I型胶原-壳聚糖复合材料生物相容性研究

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1、.I型胶原-壳聚糖复合材料的生物相容性研究基金项目：国家自然基金项目(30973048)；科技部国际合作重点项目（2008GR0403）；国家人力资源与社会保障部2009年度留学回国人员科技活动择优资助项目作者简介：张永强（1985-），男，在读硕士研究生，研究方向为关节软骨的损伤与修复*通讯作者：杨自权（1972-），男，副主任医师，硕士研究生导师，e-mail:yzqonline卫小春（1951-），男，主任医师，博士研究生导师，硕士研究生导师,e-mail:weixiaochun06张永强1任志鹏1杨自权1*孙晓丹2卫小春1*1山西医科大学第二医院骨科骨与软组织损伤修复山西省重点实验室0

2、300012清华大学材料工程学院【摘要】目的评价I型胶原-壳聚糖复合材料作为组织工程支架材料的生物相容性。方法体外培养兔骨髓间充质干细胞（BMSCs），采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测不同分组的BMSCs生长情况，酶标仪测吸光度值（OD），计算细胞相对增值率（RGR）；利用材料浸提液与兔新鲜血混合观察红细胞溶解情况，评价材料细胞生物相容性。结果空白组（A组），50浓度组（B组）和100浓度组（C组）BMSCs均生长良好，并于1、3、5天逐渐增殖，阳性对照组（D组）细胞于第天开始变圆、皱缩，3天和5天均皱缩死亡。A、B、C三组细胞在第1、3、5天各组吸光度值无显著差异（P0.05），但均与

3、组有明显统计学差异（P0.05),butallhadsignificantstatisticaldifferenceswithgroupD(P0.05).Hemolysispercentageofthescaffordwas4.1%.ConclusionIcollagen-chitosanscaffordhasnosignificantcytotoxicity,andaccordswiththebiomaterialstandardsoftissueengineering.KeywordsIcollagen-chitosanscafford;Testofhemolysis；Testforcyt

4、otoxicity壳聚糖是一种天然高分子生物材料，为线性多糖，是氨基多糖(GAG)的异构物。在自然界中广泛存在,是一种来源广泛、容易获得并具有良好生物相容性的可降解生物材料。I型胶原是很多组织的细胞外基质成分，并已应用于很多组织工程的支架材料中，但由于单独应用具有降解速率快、物理性能差等不足，因此常常与其他材料复合，以避免一些不足。本实验研究的I型胶原-壳聚糖复合材料是一种将I型胶原和壳聚糖有机结合的新型组织工程复合载体支架材料。细胞毒性实验是一类在离体状态下模拟生物体生长环境，检测材料和器械接触机体组织后生物学反应的体外试验，它是对材料进行生物学评价的重要检测指标之一。本实验通过四甲基偶氮唑

5、盐（MTT）比色法检测材料浸提液对骨髓间充质干细胞（BMSCs）生长的影响，同时进行材料浸提液的溶血试验检测，评价新型载体材料I型胶原-壳聚糖复合材料作为组织工程支架材料的生物相容性。材料与方法1主要试验材料、试剂和仪器I型胶原-壳聚糖复合材料（清华大学提供）；2月龄新西兰大白兔（山西畜牧研究所）；胰酶（Sigma公司）；DMEM-F12（赛默飞世尔生物化学有限公司）；胎牛血清（杭州四季青）；四甲基偶氮唑盐（Sigma公司）；苯酚（天津市福晨化学试剂厂）；BB5060型CO2培养箱（Heraeus公司）；MK3型酶标仪（热电上海仪器有限公司）。2细胞毒性试验2.1BMSCs的培养取2月龄新西兰

6、大白兔，称重为3kg。耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠（1ml/kg体重）约3ml麻妥，无菌条件下于双侧股骨大转子处穿刺，分别自两侧骨髓腔中抽取骨髓至含有2ml肝素（3000U/ml）注射器内，置于离心管中冲洗离心后，各加含10%胎牛血清DMEM-F12培养基5ml，分装于2个25cm2培养瓶内，置入37，5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。3d后首次换液，以后每2-3d换液一次。待细胞长满瓶底达80-90%（图），进行传代，传至三代（图2）备用。2.2 浸提液的制备1（ISO10993-5）根据GB/T16886.522003/ISO10993-5:1999医疗器械生物学评价第5部分:体外细胞毒性试

7、验中的浸提液试验，将材料按1cm试样表面积加10ml浸提介质比例在37恒温箱中浸提24h。浸提介质为含10%小牛血清的DMEM-F12培养液。2.3实验分组及检测空白组(A组)：含10%小牛血清的DMEM-F12培养液50%浓度组（B组）：材料浸提液浓度为50%100%浓度组（C组）：材料浸提液浓度为100%阳性对照组（D组）：0.64%苯酚取第三代BMSCs，配制成1105/ml细胞悬液，取3块96孔培养板，每板4组，每组10孔，每孔加100ul细胞悬液，置于条件同前的培养箱中培养。24小时后，弃去原培养液，用PBS液洗涤2次后，分别按实验分组进行换液，再把培养板放入原培养箱内继续培养，分别

8、于1、3、5天各取出一块培养板，在倒置相差显微镜下观察活细胞形态、摄影，然后加入20ul孔MTT液，继续培养6小时，吸除原液，再加入150ul孔二甲基亚砜（DMSO），震荡10分钟，在酶联免疫检测仪上以450nm波长测吸收值。按下式计算细胞相对增殖率(RGR)：RGR=（实验组吸光值/空白对照组吸光值）100%对所得RGR按美国药典细胞毒性分级标准对其进行毒性分级。美国药典2（USPXXII24版）中细胞相对增殖率与细胞毒性的分级的关系(下表)TherelationshipbetweencellproliferationrateandcytotoxicitygradeofUSP细胞相对增殖率(

9、)细胞毒性分级1000801502303043溶血试验3.1采集新西兰大白兔血4mL与2mL肝素（3000U/ml）混合备用。3.2实验分组及检测试验分组：生理盐水组(阴性对照)、实验组（材料100%浸提液）和蒸馏水组(阳性对照组)。每组10个样本，每个样本5mL。取抗凝新鲜血液0.1mL分别加入3组样品中，37培养箱孵育60min。观察大体样本溶血情况。低速离心机3000rmin10min，酶标仪492nm下对样品进行OD值检测。溶血率=(Dt-Dnc)(Dpc-Dnc)100按上述公式计算溶血率(Dt：待测OD值；Dpc：阳性对照OD值；Dnc：阴性对照OD值)。4统计分析对MTT法及溶血

10、试验测得各组吸光度值采用均数标准差表示，并行单因素方差分析，用SPSS17.0统计软件进行分析。结果1细胞毒性试验1.11天后倒置显微镜下观察A、B、C三组BMSCs生长状态均良好，细胞多呈梭形或多角形（图3）。D组细胞无明显生长，基本开始变圆，皱缩（图6）。表1：细胞相对增殖度和细胞毒性等级（1天）组别OD值(SD，n=10)细胞相对增殖度RGR(%)细胞毒性等级A空白对照组0.31880.0226100.00B50%浸提液组0.30250.033194.90C100%浸提液组0.29960.013394.00D阳性对照组0.07540.009923.74“”示：与A组比较P0.05。1.2

11、第3天可见前三组细胞数明显较前增多，细胞逐渐聚集融合。三组细胞生长状况均良好，无明显差异（图4）。D组细胞皱缩死亡。（图6）。表2：细胞相对增殖度和细胞毒性等级（3天）组别OD值(SD，n=10)细胞相对增殖度RGR(%)细胞毒性等级A空白对照组0.43700.0532100.00B50%浸提液组0.44920.0506102.70C100%浸提液组0.45800.0793104.80D阳性对照组0.07490.003617.14“”示：与A组比较P0.05。1.3第5天镜下见A、B、C三组BMSCs数量较前明显增多，且呈梭形，三角形（图5）。D组细胞成片死亡（图6）。表3：细胞相对增殖度和细

12、胞毒性等级（5天）组别OD值(SD，n=10)细胞相对增殖度RGR(%)细胞毒性等级A空白对照组0.69070.1105100.00B50%浸提液组0.65630.090995.00C100%浸提液组0.62560.149890.60D阳性对照组0.07190.001410.44“”示：与A组比较P0.05）（如表4），细胞毒性等级均为0级。2溶血试验2.1样本大体观察生理盐水组和实验组静置后各管内均可见血细胞沉积，而蒸馏水组各管颜色均一，呈淡红色，无明显血细胞沉积。2.2溶血率表5：吸光度值和溶血率(SD，n=10)生理盐水组蒸馏水组实验组OD值0.05110.01470.45360.028

13、20.06780.0100溶血率0%100%4.1%生理盐水组与实验组OD值无明显差异（P0.05）,与蒸馏水组有差异（P0.05），但均与阳性对照组有显著差异（均P0.05）。而蒸馏水组各管颜色均一，呈淡红色，表现为明显溶血的现象，其OD值与生理盐水组和实验组均有显著差异（均P0.05）。最终求得材料浸提液相对溶血率为4.1%，符合溶血率5%的标准要求7（ISO10993-4）。进一步补充说明了I型胶原-壳聚糖复合材料的无毒性。理想的骨组织工程支架材料除了对机体无毒性以外，还应具有良好的表面相容性，一定的生物活性，可降解性和良好的结构相容性等8（HunzikerE,1999）。所以对于I型胶

14、原-壳聚糖复合材料还需从这些方面进一步研究。图3第1天：A，B，C三组细胞均生长良好，细胞呈梭形或三角形（100）图图2原代BMSCs细胞（100）三代BMSCs细胞（100）附图：图4第3天：，三组数量较前增多，生长良好（100）图5第5天：，三组各孔趋于融合，细胞生长良好。图6，分别表示第，天组变圆，固缩，死亡。参考文献1ISO10993-5：1999BiologicalevaluationofmedicaldevicesPart5：Testsforinvitrocytotoxicity2USPXXII24BilolgicalTests/BiologicalReactivityTests，

15、Invivo3IsmarulIN,IshakY,IsmailZ,eta1CharacterizationofcollagenchitosanfilmsforskinregeneratingscaffoldMedJMalaysia2004；SupplB：57-58.4Rapidcolorimetricassayforcellulargrowthandsurvival:applicationtoproliferationandcytotoxicityassaysJ.ImmunMeth,1983,65(1-2):55-63.5CiapettiG,GenniE,PratelliL,etal;Invit

16、roevaluationofcell/biomaterialinteractionbyMTTassayM;Biomaterials,1993,14(5):359-364.6WatahaJC,HanksCT,CraigRG.Invitroeffectsofmetalionsoncellularmetabolismandthecorrelationbetweentheseeffectsandtheuptakeoftheions,J.Biomed.Mater.Res.1994,(28):427-433.7ISO10993-4：2002Biologicalevaluationofmedicaldevices-Par4：Selectionoftestsforinteractionswithblood8HunzikerE.Biologicalrepairofarticularcartilage:defectmodelsinexperimentalanimalsandmatrixrequirements.ClinOrthop1999;367(S):135-146.17