酶的生物改造PPT课件

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1、介介 绍绍 提提 纲纲1. 定向进化技术概述定向进化技术概述2. 定向进化技术的应用定向进化技术的应用3. 定向进化的方法定向进化的方法l基于序列的理性设计：基于序列的理性设计：化学修饰和定点突变化学修饰和定点突变 利用已知酶分子的特征、空间结构、结构和功能之利用已知酶分子的特征、空间结构、结构和功能之间关系，以及氨基酸残基功能等信息，对酶分子进行间关系，以及氨基酸残基功能等信息，对酶分子进行改造；改造；l利用基因操作模拟自然进化的非理性设计：利用基因操作模拟自然进化的非理性设计：定向进化定向进化 不需要准确的酶分子结构信息而通过随机突变、基不需要准确的酶分子结构信息而通过随机突变、基因重组等

2、方法模拟自然进化机制在体外改造酶基因，因重组等方法模拟自然进化机制在体外改造酶基因，并定向筛选出所需突变酶；并定向筛选出所需突变酶； 突变前蛋白与木糖复合物模型突变前蛋白与木糖复合物模型 突变后蛋白与木糖复合物模型突变后蛋白与木糖复合物模型 氨基酸残基与木糖之间距离比突变前下降，不利于体积氨基酸残基与木糖之间距离比突变前下降，不利于体积更大的葡萄糖底物，易于结合底物木糖，对木糖活性提高更大的葡萄糖底物，易于结合底物木糖，对木糖活性提高l自然进化过程：自然进化过程： 突变突变自然选择自然选择遗传后代遗传后代l自然进化结果：自然进化结果： 生物多样性生物多样性 基因多样性：为完成同一功能所表现出的

3、基因多样性：为完成同一功能所表现出的 多个基因或同一个基因（同源性）多个基因或同一个基因（同源性）l局限性：局限性：周期长，效率低周期长，效率低 ； 可控性差；可控性差； 基因工程技术使得人类快速筛选工业菌种基因工程技术使得人类快速筛选工业菌种成为可能，在几天和数月内即可完成；还可以成为可能，在几天和数月内即可完成；还可以让人类按照自己的意愿和需要改造菌种，甚至让人类按照自己的意愿和需要改造菌种，甚至可以产生自然界中原本不存在的全新酶，以适可以产生自然界中原本不存在的全新酶，以适应大工业生产的需要。应大工业生产的需要。-哲理上哲理上, ,承认了人类对蛋白质的认知的严重不足承认了人类对蛋白质的认

4、知的严重不足; ;-技术上技术上, ,将大自然已经实践了几亿年的达尔文进化将大自然已经实践了几亿年的达尔文进化原理应用于试管中原理应用于试管中, ,以以随机突变与随机杂交随机突变与随机杂交方法来改方法来改变蛋白质的性能变蛋白质的性能, ,再辅以筛选来获得优异的变种。再辅以筛选来获得优异的变种。 (Frances Arnold, Caltech, 1993)(Frances Arnold, Caltech, 1993) l定义：定义： 从一个或多个已经存在的亲本酶（天然或人从一个或多个已经存在的亲本酶（天然或人为获得）出发，经过基因突变和重组，构建一为获得）出发，经过基因突变和重组，构建一个人工

5、突变基因库，通过筛选最终获得预先期个人工突变基因库，通过筛选最终获得预先期望具有某些特性的进化酶；望具有某些特性的进化酶； 所谓酶的体外定向进化，又称实验分子进化，属所谓酶的体外定向进化，又称实验分子进化，属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自构和催化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制然进化机制( (随机突变、重组和自然选择随机突变、重组和自然选择) )，在体外改，在体外改造酶基因，并定向选择出所需性质的突变酶。造酶基因，并定向选择出所需性质的突变酶。 l在待进化酶基因的在待进化

6、酶基因的PCRPCR扩增反应中，利用扩增反应中，利用Taq DNATaq DNA聚合聚合酶不具有酶不具有3-53-5校对功能的性质，配合适当条件，校对功能的性质，配合适当条件，以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶( (或蛋白质或蛋白质) )，从而排除其他突变体。，从而排除其他突变体。l定向进化的基本规则是定向进化的基本规则是“”。前者是人为引发的，后者。前者是人为引发的，后者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起着选虽相当于环境，但只作用于突变后的

7、分子群，起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的进化过程完全是在人为控制下进行的蛋白质蛋白质稳定性活性有机溶液中的活性不同的底物的利用酸碱度蛋白质的表达亲和性 专一性1234性能代数达到目的达到目的随机突变随机突变随机杂交随机杂交筛选筛选目标蛋白枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶E热稳定性的分子进化热稳定性的分子进化l内酰胺酶的活性提高了内酰胺酶的活性提高了32,00032,000倍；倍；l半乳糖苷酶的底物特异性提高了半乳糖苷酶的底物特异性提高了10001000倍，倍，且活性提高且活性提高6666倍；倍；l天冬

8、氨酸转氨酶对天冬氨酸转氨酶对支链氧代氨基酸活性提支链氧代氨基酸活性提高高10105 5倍且对缬氨酸的催化效率提高倍且对缬氨酸的催化效率提高2.12.110106 6倍倍等。等。lReetzReetz等等 (1997) (1997) 将脂酶水解对硝基将脂酶水解对硝基-2-2-甲基癸酯甲基癸酯的对映体选择性提高了的对映体选择性提高了4040倍倍lYouYou和和Arnold (1996) Arnold (1996) 提高了枯草杆菌蛋白酶提高了枯草杆菌蛋白酶E E的的表达水平和在有机溶剂中的活性，使酶的总活力表达水平和在有机溶剂中的活性，使酶的总活力提高了提高了500500倍倍lZhaoZhao和和

9、ArnoldArnold（19981998）在保持酶活力不变的条件）在保持酶活力不变的条件下将枯草杆菌蛋白酶下将枯草杆菌蛋白酶E E的作用温度提高了的作用温度提高了1717度度l随机突变随机突变 不同的定向进化方法不同的定向进化方法l构建突变基因文库构建突变基因文库 载体的选择，基因重组，组建基因文库载体的选择，基因重组，组建基因文库l突变基因的筛选突变基因的筛选 平板筛选法，荧光筛选法，表面展示法平板筛选法，荧光筛选法，表面展示法 l无性进化方法：易错无性进化方法：易错PCRPCR法，盒式诱变法，盒式诱变l有性进化方法有性进化方法 1 1）DNADNA改组法（改组法（DNA Shufflin

10、g)DNA Shuffling) 2 2）体外随机重组法（）体外随机重组法（RPR)RPR) 3 3）交错延伸法）交错延伸法(StEP)(StEP)l基因家族的同源重组基因家族的同源重组l外显子的改组外显子的改组l杂合进化杂合进化v 改变改变4种底物的浓度比，或降低一种种底物的浓度比，或降低一种dNTP的量（降至的量（降至5-10）,加入加入dITP来代替被减少的来代替被减少的dNTP. 缓冲液中另缓冲液中另加加0.5mmol/L Mn2+v v 添加一定浓度的锰离子；添加一定浓度的锰离子；v 对一组同源蛋白质的氨基酸序列进行比较，以一 定的标准程序计算出各氨基酸序列的共有序列；v 人工合成同

11、序基因后重组表达。 Martin Lehmann等（20002002）把这种方法应用在真菌植酸酶家族设计合成了同源植酸酶基因，并表达出具热稳定性的同源植酸酶。l真核基因中外显子编码一个折叠结构域，故内含真核基因中外显子编码一个折叠结构域，故内含子（转录后被剪切剩下外显子）间的重组，可使子（转录后被剪切剩下外显子）间的重组，可使独立外显子组装成编码新蛋白质的基因，可导致独立外显子组装成编码新蛋白质的基因，可导致蛋白质的快速进化；蛋白质的快速进化；l在自然界中，不同分子的内含子间发生同源重组，在自然界中，不同分子的内含子间发生同源重组，导致不同外显子的结合，是产生新蛋白质的有效导致不同外显子的结合

12、，是产生新蛋白质的有效途径之一。与途径之一。与DNADNA改组不同，外显子改组是靠同改组不同，外显子改组是靠同一种分子间内含子的同源性带动，而一种分子间内含子的同源性带动，而DNADNA改组不改组不受任何限制，发生在整个基因片段上；受任何限制，发生在整个基因片段上；l把来自不同酶分子中的结构单元或是整个酶分把来自不同酶分子中的结构单元或是整个酶分子进行组合或交换，以产生具有所需性质的酶子进行组合或交换，以产生具有所需性质的酶杂合体。杂合体。l纤维素酶定向进化纤维素酶定向进化u目标目标 根据定向进化要求，在一定的环境要求下进行筛选，从根据定向进化要求，在一定的环境要求下进行筛选，从突变基因文库中

13、得到所需的突变基因。突变基因文库中得到所需的突变基因。u难点难点 突变库容量大，一般达到突变库容量大，一般达到10106 6，工作量巨大，工作量巨大u关键关键 高通量筛选：通量大，效率高高通量筛选：通量大，效率高u方法方法 平板筛选法，荧光筛选法，噬菌体表面展示法，细胞平板筛选法，荧光筛选法，噬菌体表面展示法，细胞表面展示法表面展示法u依据细胞生长情况筛选依据细胞生长情况筛选热稳定性：温度梯度和高温环境热稳定性：温度梯度和高温环境抗生素耐受性：抗生素浓度梯度抗生素耐受性：抗生素浓度梯度pHpH稳定性：稳定性： pHpH梯度梯度极端环境：高盐、低温、高浓毒物质极端环境：高盐、低温、高浓毒物质u依

14、据颜色变化筛选依据颜色变化筛选大肠杆菌大肠杆菌-半乳糖苷酶基因显色：噬菌体半乳糖苷酶基因显色：噬菌体DNA载体（蓝色）载体（蓝色）反应产物显色：磷酸酯酶水解硝基酚磷酸生成黄色硝基酚反应产物显色：磷酸酯酶水解硝基酚磷酸生成黄色硝基酚u依据透明圈大小筛选依据透明圈大小筛选淀粉酶的进化：淀粉平板培养基淀粉酶的进化：淀粉平板培养基豆鼓纤溶酶的进化：血纤维蛋白培养基豆鼓纤溶酶的进化：血纤维蛋白培养基u利用自身荧光激发特性利用自身荧光激发特性 生成产物本身是具有荧光激发特性的物质生成产物本身是具有荧光激发特性的物质u利用荧光报告基因利用荧光报告基因辣根过氧化合物酶和单加氧酶的融合基因：辣根过氧化合物酶和单

15、加氧酶的融合基因： 原理：萘原理：萘萘酚萘酚醌类化合物（能激发荧光）醌类化合物（能激发荧光）绿色荧光蛋白基因：获绿色荧光蛋白基因：获20082008年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖 u获奖获奖 2008年度诺贝尔化学奖授予日本科学家下村修、美国科年度诺贝尔化学奖授予日本科学家下村修、美国科学家马丁学家马丁沙尔菲，以及美国华裔科学家钱永健。他们三人沙尔菲，以及美国华裔科学家钱永健。他们三人因为在绿色荧光蛋白（）研究和应用方面做出的突因为在绿色荧光蛋白（）研究和应用方面做出的突出贡献将各分得出贡献将各分得2008年度年度13的诺贝尔化学奖奖金。的诺贝尔化学奖奖金。 u评论评论 生物学有些现象只能在打碎

16、细胞以后才能做，所以实际生物学有些现象只能在打碎细胞以后才能做，所以实际上是从上是从“死物死物”上来推测生物的情况。而下村修、钱永健上来推测生物的情况。而下村修、钱永健和马丁和马丁沙尔菲发明的用荧光分子标记其他分子的方法，使沙尔菲发明的用荧光分子标记其他分子的方法，使科学家们能在活细胞、活生物上直接观察一些生物现象。科学家们能在活细胞、活生物上直接观察一些生物现象。所以，可以说是把一些所以，可以说是把一些“死物学死物学”变成了真正的变成了真正的“生物学生物学 （北大饶毅）绿荧光水母通过体内绿色荧光蛋白发光科学家在线形虫体内植入绿色荧光蛋白质 FISH分析菌株（a）未加探针；（）未加探针；（b）

17、DAPI染色（染色（c）-探针杂交（探针杂交（d）Msint-1268探针杂交菌株探针杂交菌株Y1；（；（e）Msint-1268探针杂交探针杂交M. trichosporium OB3b线粒体中表达的GFP GFP在植物研究中的应用u 内涵内涵 利用丝状噬菌体的外膜结构蛋白与某些特定利用丝状噬菌体的外膜结构蛋白与某些特定的外源蛋白或多肽分子形成稳定的复合物，使的外源蛋白或多肽分子形成稳定的复合物，使外源蛋白或多肽富集在噬菌体表面的一种分子外源蛋白或多肽富集在噬菌体表面的一种分子展示技术展示技术u 特点特点 有效性高，是前景广阔的筛选方法有效性高，是前景广阔的筛选方法 通过锚定在酵母细胞表面的

18、特点蛋白质与通过锚定在酵母细胞表面的特点蛋白质与某些外源蛋白质或多肽形成稳定的化合物，使某些外源蛋白质或多肽形成稳定的化合物，使外源蛋白或多肽富集在酵母细胞表面的一种分外源蛋白或多肽富集在酵母细胞表面的一种分子展示技术。子展示技术。实例：天冬氨酸转氨酶的热稳定性的实例：天冬氨酸转氨酶的热稳定性的定向进化定向进化n高通量筛选方法的建立高通量筛选方法的建立n生物信息学技术手段的建立生物信息学技术手段的建立n天冬氨酸转氨酶热稳定性的改造天冬氨酸转氨酶热稳定性的改造研究内容及执行情况研究内容及执行情况 高通量筛选方法的建立高通量筛选方法的建立 基于酶联免疫分析方法，选用医用检测试剂盒作为基于酶联免疫分

19、析方法，选用医用检测试剂盒作为检测试剂，建立了快速高效的酶活性检测方法，结合检测试剂，建立了快速高效的酶活性检测方法，结合使用使用9696孔酶标板，形成了酶的高通量筛选方法孔酶标板，形成了酶的高通量筛选方法。 建立了改进的可高通量操作的质粒快速检测方法，建立了改进的可高通量操作的质粒快速检测方法，改进后的质粒快检工作量为原方法的改进后的质粒快检工作量为原方法的1/31/3左右，可用左右，可用于高通量筛选和鉴定所构建的基因工程菌。于高通量筛选和鉴定所构建的基因工程菌。生物催化的数据整合和信息分析生物催化的数据整合和信息分析峰值运算速度达峰值运算速度达30003000亿次亿次/ /秒的集群系统秒的

20、集群系统 基因表达 蛋白质表达 蛋白质-DNA相互作用 蛋白质-蛋白质相互作用 基因和其他功能相互作用 蛋白质定位 网络调节 功能注解 生物信息学技术手段的建立生物信息学技术手段的建立天冬氨酸转氨酶的作用天冬氨酸转氨酶的作用酶法制备酶法制备L L苯丙氨酸的关键酶苯丙氨酸的关键酶 ； u L-苯丙氨酸的主要用途 氨基酸输液 L-苯丙氨酸是人体八大必须氨基酸之一，是氨基酸输液的主要成份； 甜味剂的合成 由L-苯丙氨酸和L天冬氨酸合成的阿斯巴甜是二十世纪九十年代以来最受关注的非糖型肽类甜味剂，形成了对L-苯丙氨酸的强烈需求； 肉桂酸酶法肉桂酸酶法苯丙酮酸酶法苯丙酮酸酶法CHNH3CH2CHCOOHL

21、NH2CHCOOHPLA+HOOCH2CCOOHH2NHCH2COOHH2NHCH2C COOHOHOOCCH2C COOHOaminotransferaseL-Aspartic acidL-Phenylalanine+H3CCOxaloacetic acidCOOHPyruvic acidOCO2Phenylpyruvate+利用生物信息学技术进行酶结构分析利用生物信息学技术进行酶结构分析应用应用DeepViewDeepView（蛋白质结构预测软件）（蛋白质结构预测软件）确立天冬氨酸转氨酶的热稳定性有关的功能区域确立天冬氨酸转氨酶的热稳定性有关的功能区域引入随机引物，建立突变基因文库引入随机

22、引物，建立突变基因文库Compound LibraryUnique Compound in Each WellAssayTargetPlate ReaderSame Assay and Target in Each WellMother PlateDaughter PlateAssay PlateRR0.00.20.40.60.81.01.21.4012345678910 11 12筛选筛选得到酶热稳定性提高得到酶热稳定性提高的的1212株菌株株菌株天冬氨酸转氨酶热稳定性的进化天冬氨酸转氨酶热稳定性的进化未突变前酶的热稳定性未突变前酶的热稳定性* * 热稳定性定义为热稳定性定义为5555下放置

23、下放置10min10min后酶活性与放置前酶活性的比值后酶活性与放置前酶活性的比值l在待进化酶基因的在待进化酶基因的PCRPCR扩增反应中，利用扩增反应中，利用Taq DNATaq DNA聚合聚合酶不具有酶不具有3-53-5校对功能的性质，配合适当条件，校对功能的性质，配合适当条件，以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶( (或蛋白质或蛋白质) )，从而排除其他突变体。，从而排除其他突变体。l定向进化的基本规则是定向进化的基本规则是“”。前者是人为引发的

24、，后者。前者是人为引发的，后者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起着选虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的进化过程完全是在人为控制下进行的v 改变改变4种底物的浓度比，或降低一种种底物的浓度比，或降低一种dNTP的量（降至的量（降至5-10）,加入加入dITP来代替被减少的来代替被减少的dNTP. 缓冲液中另缓冲液中另加加0.5mmol/L Mn2+v v 添加一定浓度的锰离子；添加一定浓度的锰离子；u依据细胞生长情况筛选依据细胞生长情况筛选热稳定性：温度

25、梯度和高温环境热稳定性：温度梯度和高温环境抗生素耐受性：抗生素浓度梯度抗生素耐受性：抗生素浓度梯度pHpH稳定性：稳定性： pHpH梯度梯度极端环境：高盐、低温、高浓毒物质极端环境：高盐、低温、高浓毒物质利用生物信息学技术进行酶结构分析利用生物信息学技术进行酶结构分析RR0.00.20.40.60.81.01.21.4012345678910 11 12筛选筛选得到酶热稳定性提高得到酶热稳定性提高的的1212株菌株株菌株天冬氨酸转氨酶热稳定性的进化天冬氨酸转氨酶热稳定性的进化未突变前酶的热稳定性未突变前酶的热稳定性* * 热稳定性定义为热稳定性定义为5555下放置下放置10min10min后酶活性与放置前酶活性的比值后酶活性与放置前酶活性的比值