生物化学：第十一章 DNA生物合成

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1、第十一章第十一章 DNA生物合成（复制）生物合成（复制）DNA是由四种脱氧核糖核酸所组成的长链是由四种脱氧核糖核酸所组成的长链大分子，是遗传信息的携带者。生物体的大分子，是遗传信息的携带者。生物体的遗传信息就贮存在遗传信息就贮存在DNA的四种脱氧核糖核的四种脱氧核糖核酸的排列顺序中。酸的排列顺序中。 DNA通过复制将遗传信息由亲代传递给子代；通过复制将遗传信息由亲代传递给子代；通过转录和翻译，将遗传信息传递给蛋白质分通过转录和翻译，将遗传信息传递给蛋白质分子，从而决定生物的表现型。子，从而决定生物的表现型。DNA的复制、转的复制、转录和翻译过程就构成了录和翻译过程就构成了遗传学的中心法则遗传学

2、的中心法则。 在在RNA病毒中，其遗传信息贮存在病毒中，其遗传信息贮存在RNA分子中。因此，分子中。因此，在这些生物体中，遗传信息的流向是在这些生物体中，遗传信息的流向是RNA通过复制，将通过复制，将遗传信息由亲代传递给子代，通过反转录将遗传信息传遗传信息由亲代传递给子代，通过反转录将遗传信息传递给递给DNA，再由，再由DNA通过转录和翻译传递给蛋白质，通过转录和翻译传递给蛋白质，这种遗传信息的流向就称为这种遗传信息的流向就称为反中心法则反中心法则。Reverse transcription第一节第一节 复制的基本规律复制的基本规律DNA在复制时，以亲代在复制时，以亲代DNA的每一股作模板，的

3、每一股作模板，合成完全相同的两个双链子代合成完全相同的两个双链子代DNA，每个子代，每个子代DNA中都含有一股亲代中都含有一股亲代DNA链，这种现象称链，这种现象称为为DNA的半保留复制的半保留复制。 一、半保留复制一、半保留复制复制复制亲代亲代DNA子代子代DNADNADNA半保留复制示意图半保留复制示意图DNA以半保留方式进行复制，是在以半保留方式进行复制，是在1958年由年由M. Meselson 和和 F. Stahl 所完成的实验所证明。所完成的实验所证明。该实验首先将大肠杆菌在含该实验首先将大肠杆菌在含15N的培养基中培养约十五的培养基中培养约十五代，使其代，使其DNA中的碱基氮均

4、转变为中的碱基氮均转变为15N。然后将大肠杆。然后将大肠杆菌移至只含菌移至只含14N的培养基中同步培养一代、二代、三代。的培养基中同步培养一代、二代、三代。分别提取分别提取DNA，作密度梯度离心，将具有不同密度的，作密度梯度离心，将具有不同密度的DNA分离开。分离开。DNA半保留复制的实验证明半保留复制的实验证明DNADNA半保留复制研究实验结果示意图半保留复制研究实验结果示意图按半保留复制方式，子代按半保留复制方式，子代DNA与亲代与亲代DNA的的碱基序列一致碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的信息，体现了遗传的保守性保守性。遗传的保守性，是

5、物种稳定性的分子基础，但遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的不是绝对的。半保留复制的意义半保留复制的意义DNA在复制时，需在特定的位点起始，这是一在复制时，需在特定的位点起始，这是一些具有特定核苷酸排列顺序的片段，即些具有特定核苷酸排列顺序的片段，即复制起复制起始点始点(origin) 。在原核生物中，复制起始点通常为一个，而在在原核生物中，复制起始点通常为一个，而在真核生物中则为多个。真核生物中则为多个。二、有一定的复制起始点二、有一定的复制起始点细菌和酵母菌中细菌和酵母菌中DNADNA复制起始点的碱基序列复制起始点的碱基序列习惯上把两个相邻习惯上把两个相邻DNA复制起始点之间

6、的距离复制起始点之间的距离（或（或DNA片段）定为一个片段）定为一个复制子复制子(replicon) 。复制子是独立完成复制的功能单位。复制子是独立完成复制的功能单位。DNA复制时，局部双螺旋解开形成两条单复制时，局部双螺旋解开形成两条单链，这种叉状结构称为链，这种叉状结构称为复制叉复制叉。53oriorioriori535533553复制子复制子3复制起始点与复制子示意图复制起始点与复制子示意图复制起始点、复制子与复制叉（动画演示）复制起始点、复制子与复制叉（动画演示）参与参与DNA复制的复制的DNA聚合酶，必须以一段具有聚合酶，必须以一段具有3端自由羟基（端自由羟基（3-OH）的）的RNA

7、作为作为引物引物(primer) ，才能开始聚合子代，才能开始聚合子代DNA链。链。RNA引物的大小，在原核生物中通常为引物的大小，在原核生物中通常为50100个核苷酸，而在真核生物中约为个核苷酸，而在真核生物中约为10个核苷个核苷酸。酸。RNA引物的碱基顺序，与其模板引物的碱基顺序，与其模板DNA的碱的碱基顺序相配对。基顺序相配对。 三、需要引三、需要引物物DNA复制时，以复制起始点复制时，以复制起始点(origin)为中心，向两个方为中心，向两个方向进行解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为向进行解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制双向复制。但在低等生物中，也可进行单向复制（

8、如滚环复制）。但在低等生物中，也可进行单向复制（如滚环复制）。复制中的放射自显影图象复制中的放射自显影图象四、双向复制四、双向复制oriterA B CA. 环状双链环状双链DNA及复制起始点及复制起始点B. 复制中的两个复制叉复制中的两个复制叉C. 复制接近终止点复制接近终止点(ter)DNADNA的双向复制示意图的双向复制示意图DNA聚合酶只能以聚合酶只能以53方向聚合方向聚合子代子代DNA链链，即，即模板模板DNA链链的方向必须是的方向必须是35。由于由于DNA分子中两条链的走向相反，因此当分别以两条分子中两条链的走向相反，因此当分别以两条亲代亲代DNA链作为模板聚合子代链作为模板聚合子

9、代DNA链时，子代链的聚合链时，子代链的聚合方向也是不同的。方向也是不同的。五、半不连续复制五、半不连续复制3 5 3 5 3 5 3 5 解链方向解链方向领头链领头链随从链随从链DNADNA的半不连续复制的半不连续复制3 5 以以35方向的亲代方向的亲代DNA链作模板的子代链在复链作模板的子代链在复制时基本上是连续进行的，其子代链的聚合方向制时基本上是连续进行的，其子代链的聚合方向为为53，这一条链被称为，这一条链被称为领头链领头链。以以53方向的亲代方向的亲代DNA链为模板的子代链在复链为模板的子代链在复制时则是不连续的，其链的聚合方向也是制时则是不连续的，其链的聚合方向也是53，这条链被

10、称为这条链被称为随从链随从链(lagging strand)。领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的的半不连续性半不连续性。 由于亲代由于亲代DNA双链在复制时是逐步解开的，因双链在复制时是逐步解开的，因此，随从链的合成也是一段一段的。此，随从链的合成也是一段一段的。DNA在复在复制时，由随从链所形成的一些子代制时，由随从链所形成的一些子代DNA短链称短链称为为冈崎片段冈崎片段。冈崎片段的大小，在原核生物中约为冈崎片段的大小，在原核生物中约为10002000个核苷酸，而在真核生物中约为个核苷酸，而在真核生物中约为100个核个核苷酸。苷酸。 第二节

11、第二节 DNA复制的条件复制的条件 l DNA DNA复制的体系复制的体系 底物：底物：dNTP, N=A,T,C,G 模板：模板：DNA单链单链 引物：引物：RNA，提供，提供3 -OH末端使末端使dNTP可以依可以依次聚合次聚合 酶和蛋白质因子：酶和蛋白质因子：以四种脱氧核糖核酸为底物，即以四种脱氧核糖核酸为底物，即dATP，dGTP，dCTP，dTTP。一、底物一、底物 (dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 +PPiDNADNA复制过程中脱氧核糖核苷酸的聚合反应复制过程中脱氧核糖核苷酸的聚合反应DNA复制是模板依赖性的，必须要以亲代复制是模板依赖性的，必须要以亲代DNA链作为

12、模板。亲代链作为模板。亲代DNA的两股链解开后，可分的两股链解开后，可分别作为模板进行复制。别作为模板进行复制。 二、模板二、模板引物酶引物酶本质上是一种本质上是一种依赖依赖DNA的的RNA聚合酶聚合酶，该酶以该酶以DNA为模板，聚合一段为模板，聚合一段RNA短链引物短链引物(primer)，以提供自由的，以提供自由的3-OH，使子代，使子代DNA链能够开始聚合。链能够开始聚合。引物酶需组装成引物酶需组装成引发体引发体才能催化才能催化RNA引物的引物的合成。合成。三、三、RNA引物引物在在E. coli中，含有中，含有解螺旋酶解螺旋酶(DnaB蛋白蛋白) 、DnaC蛋白蛋白、引物酶引物酶(Dn

13、aG蛋白蛋白)和和DNA复复制 起 始 区制 起 始 区 域 的 复 合 结 构 被 称 为域 的 复 合 结 构 被 称 为 引 发 体引 发 体(primosome) 。 Dna A Dna B Dna CDNA拓扑异构酶拓扑异构酶引物引物酶酶SSB3 5 3 5 含有解螺旋酶含有解螺旋酶(DnaB蛋白蛋白)、DnaC蛋白、引物酶和蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。复制起始区域的复合结构称为引发体。 引发体的组装形成引发体的组装形成3 HO53 5 3 5 引物酶催化合成短链引物酶催化合成短链RNARNA引物分子引物分子 引物引物引物引物酶酶解螺旋酶解螺旋酶(helic

14、ase) ，又，又称解链酶或称解链酶或rep蛋白，是蛋白，是用于解开用于解开DNA双链的酶双链的酶蛋白。蛋白。每解开一对碱基，需消每解开一对碱基，需消耗耗2分子分子ATP。1、解螺旋酶、解螺旋酶四、四、DNA复制的酶学复制的酶学2、DNA拓扑异构酶拓扑异构酶人类拓扑异构酶人类拓扑异构酶的分子结构的分子结构能够松解能够松解DNA超螺超螺旋结构的酶。旋结构的酶。1010 8 8 局部解链后局部解链后DNA复制过程中正超螺旋的形成复制过程中正超螺旋的形成解链过程中正超螺旋的形成解链过程中正超螺旋的形成拓扑异构酶的作用特点拓扑异构酶的作用特点既能水解既能水解 、又能连接磷酸二酯键、又能连接磷酸二酯键

15、拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶分分 类类拓扑异拓扑异构酶构酶切断切断DNA双链中双链中一股一股链，使链，使DNA解链解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态变为松弛状态。反应反应不需不需ATP。拓扑异拓扑异构酶构酶切断切断DNA分子分子两股两股链，断端通过切口链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。旋转使超螺旋松弛。利用利用ATP供能，连接断端，供能，连接断端， DNA分子分子进入负超螺旋状态。进入负超螺旋状态。DNA拓扑异构酶的作用机制拓扑异构酶的作用机制 单链单链DNA结合蛋白（结合蛋白（SSB），），是一些能够与单是一些能够与单链链DNA

16、结合的蛋白质因子。结合的蛋白质因子。3、单链、单链DNA结合蛋白结合蛋白SSB的生理作用：的生理作用：使解开双螺旋后的使解开双螺旋后的DNA单链能够稳定存在，即单链能够稳定存在，即稳定单链稳定单链DNA，便于其作为模板复制子代，便于其作为模板复制子代DNA；保护单链保护单链DNA，避免核酸酶的降解。，避免核酸酶的降解。 4 4、引物酶、引物酶 是一种是一种RNARNA聚合酶，在复制的起始点处以聚合酶，在复制的起始点处以DNADNA为模板，为模板，催化合成一小段互补的催化合成一小段互补的RNARNA。引物酶能直接在单链。引物酶能直接在单链DNADNA模板模板上催化游离的上催化游离的NTPNTP合

17、成一小段合成一小段RNARNA，并由这一小段，并由这一小段RNARNA引物引物提供提供3-OH3-OH，经，经DNADNA聚合酶催化链的延伸。聚合酶催化链的延伸。 5、DNA聚合酶聚合酶全称：全称：依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶 简称：简称：DNA-pol活性：活性：1. 53 的聚合酶活性的聚合酶活性 2. 核酸外切酶活性核酸外切酶活性5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切酶活性外切酶活性 5 3 外切酶活性外切酶活性?能切除突变的能切除突变的

18、 DNA片段。片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。能辨认错配的碱基对，并将其水解。 DNA聚合酶的核酸外切酶活性聚合酶的核酸外切酶活性 在原核生物中，目前发现的在原核生物中，目前发现的DNA聚合酶有三种，聚合酶有三种，分别命名为分别命名为DNA聚合酶聚合酶（pol ），DNA聚聚合酶合酶（pol ），DNA聚合酶聚合酶（pol ），这三种酶都属于具有多种酶活性的多功能酶。这三种酶都属于具有多种酶活性的多功能酶。参与参与DNA复制的主要是复制的主要是pol 和和pol 。l 种类和生理功能：种类和生理功能：pol 为具有三种酶活为具有三种酶活性的单一肽链的大分子性的单一肽链的大分子蛋白质，可被

19、特异的蛋蛋白质，可被特异的蛋白酶水解为两个片段，白酶水解为两个片段，其中的大片段保留了两其中的大片段保留了两种酶活性种酶活性,即即53聚合聚合酶酶和和35外切酶外切酶活性，活性，通常被称为通常被称为Klenow fragment。 Klenow片段的分子结构片段的分子结构pol 由十种亚基组成由十种亚基组成不对称异源二聚体结构，不对称异源二聚体结构，其中其中 亚基亚基具有具有53聚聚合合DNA的酶活性，具有的酶活性，具有复制复制DNA的功能；而的功能；而 亚基亚基具有具有35外切酶外切酶的活性，与的活性，与DNA复制的复制的校正功能有关。校正功能有关。 原核生物中的三种原核生物中的三种DNAD

20、NA聚合酶聚合酶 pol pol pol pol pol pol 5353聚合酶活性聚合酶活性+ + + +5353外切酶活性外切酶活性+ +- - -3535外切酶活性外切酶活性+ + + +生理功能生理功能填补缺口填补缺口修复损伤修复损伤校正错误校正错误未知未知复制复制DNA校正错误校正错误在在真核生物真核生物中，目前发现的中，目前发现的DNA聚合酶有五种聚合酶有五种:DNA-pol 起始引发，有引物酶活性。起始引发，有引物酶活性。参与低保真度的复制参与低保真度的复制 。DNA-pol 在在线粒体线粒体DNA复制中起催化作用。复制中起催化作用。DNA-pol 延长子链的主要酶，有解螺旋酶活

21、性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。DNA-pol 在复制过程中起校读、修复和填补缺在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。口的作用。DNA-pol 真核生物的真核生物的DNADNA聚合酶聚合酶DNA-pol 分子量分子量(kD)16.54.014.012.525.55353聚合酶活性聚合酶活性+?+3535外切酶活性外切酶活性-+生理功能生理功能起始引发起始引发引物酶活引物酶活性性低保真低保真度复制度复制线粒体线粒体DNA复复制制延长子延长子代链的代链的主要酶主要酶,解螺旋解螺旋酶活性酶活性填补缺口填补缺口,切除修复切除修复,重组重组DNA连接酶连接酶可催化两段可催化两段DNA片段之间磷

22、酸二酯片段之间磷酸二酯键的形成，从而把两段相邻的键的形成，从而把两段相邻的DNA链连接成一链连接成一条完整的链。条完整的链。6、DNA连接酶连接酶DNA连接酶连接酶ATP（NAD+）ADP+Pi（NMN+AMP）HO5POO-O-O353POO-O-O3553DNA连接酶的连接作用连接酶的连接作用DNA连接酶催化的条件是：连接酶催化的条件是： 需一段需一段DNA片段具有片段具有3-OH，而另一段，而另一段DNA片段具有片段具有5-Pi基；基； 未封闭的未封闭的缺口位于双链缺口位于双链DNA中中，即其中有，即其中有一条链是完整的；一条链是完整的； 需要消耗能量，在原核生物中需要消耗能量，在原核生

23、物中由由NAD+供供能能，在真核生物中，在真核生物中由由ATP供能供能。DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。用。是基因工程的重要工具酶之是基因工程的重要工具酶之一。一。DNA连接酶的作用：连接酶的作用：为了保证遗传的稳定，为了保证遗传的稳定，DNA的复制必须具有高的复制必须具有高保真性。保真性。DNA复制时的保真性主要与下列因素复制时的保真性主要与下列因素有关：有关： 1遵守严格的碱基配对规律；遵守严格的碱基配对规律； 2DNA聚合酶在复制时对碱基的正确选择；聚合酶在复制时对

24、碱基的正确选择； 3对复制过程中出现的错误及时进行校正。对复制过程中出现的错误及时进行校正。 五、五、DNA复制的保真性复制的保真性DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读的核酸外切酶活性和及时校读A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合酶活性掺入正确配对的底物。酶活性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确，：碱基配对正确， DNA-pol不表现外切酶活性。不表现外切酶活性。复制的保真性和碱基选择复制的保真性和碱基选择DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。（磷酸二

25、酯键）键的有序形成。嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型反式构型。 第三节第三节 DNA生物合成过程生物合成过程DNA复制的起始阶段，由下列两步构成。复制的起始阶段，由下列两步构成。 1解旋解链，形成复制叉：解旋解链，形成复制叉： 由拓扑异构酶和解链酶作用，使由拓扑异构酶和解链酶作用，使DNA的超螺旋及双的超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链DNA。 单链单链DNA结合蛋白（结合蛋白（SSB）四聚体结合在两条单）四聚体结合

26、在两条单链链DNA上，形成复制叉。上，形成复制叉。一、复制的起始一、复制的起始2引发体组装和引物合成：引发体组装和引物合成： 由解螺旋酶（由解螺旋酶（DnaB蛋白）、蛋白）、DnaC蛋白、引物酶蛋白、引物酶（DnaG蛋白）和蛋白）和DNA复制起始区域形成引发体；复制起始区域形成引发体； 在引物酶的催化下，以在引物酶的催化下，以DNA为模板，合成一段短为模板，合成一段短的的RNA片段，从而获得片段，从而获得3端自由羟基（端自由羟基（3-OH）。）。 二、复制的延长二、复制的延长 复制的延长指在复制的延长指在DNA聚合酶催化下，以聚合酶催化下，以35方向的亲方向的亲代代DNA链为模板，从链为模板，

27、从53方向聚合子代方向聚合子代DNA链。其化链。其化学本质是学本质是dNTP以以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的的方式逐个加入引物或延长中的子链上，磷酸二酯键不断生成。子链上，磷酸二酯键不断生成。 在原核生物中，参与在原核生物中，参与DNA复制延长的是复制延长的是DNA聚合酶聚合酶；而在真核生物中是而在真核生物中是DNA聚合酶聚合酶。 5 5 3 35 5dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33 3DNA-polDNADNA复制的延长过程复制的延长过程领头链的合成过程领头链的合成过程随从链的合成过程随从链的合成过程DNA复制过程简图复制过程简图冈崎片段冈崎

28、片段随从链不连续复制的片段称为冈崎片段，其大小在随从链不连续复制的片段称为冈崎片段，其大小在10002000个核苷酸。个核苷酸。每一个不连续复制的片段每一个不连续复制的片段5-端都带有一个端都带有一个RNA引物。引物。片段的复制完成后，片段的复制完成后，RNA引物会被除去而代之以引物会被除去而代之以DNA片段，因此复制至最后，两股子链都是片段，因此复制至最后，两股子链都是DNA链。链。3 3 5 5 3 3 5 5 解链方向解链方向3 35 53 33 35 5冈崎片段冈崎片段复制叉引导的复制方向复制叉引导的复制方向亲代亲代DNA双链双链前导链前导链 随从链随从链冈崎片段冈崎片段RNA引物引物

29、复复 制制 过过 程程 动动 画画三、复制的终止三、复制的终止 在复制过程中形成的在复制过程中形成的RNA引物，需由引物，需由RNA酶酶来来水解去除；水解去除；RNA引物水解后遗留的缺口，由引物水解后遗留的缺口，由DNA聚合酶聚合酶（原核生物）或（原核生物）或DNA聚合酶聚合酶 （真核生物）催化（真核生物）催化延长缺口处的延长缺口处的DNA，直到剩下最后一个磷酸酯，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。键的缺口。（一）去除引物，填补缺口：（一）去除引物，填补缺口：在在DNA连接酶的催化下，生成最后一个磷酸酯连接酶的催化下，生成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的键，将冈崎片段连接起来，形

30、成完整的DNA长长链。链。 （二）连接冈崎片段：（二）连接冈崎片段：5 5 5 RNA酶酶OH P5 DNA-pol dNTP5 5 PATP ADP+Pi5 5 DNA连接酶连接酶 随从链上不连续性片段的连接随从链上不连续性片段的连接DNADNA复制的过程复制的过程端粒（端粒（telomere）是是指真核生物染色体线指真核生物染色体线性性DNA分子末端的结分子末端的结构部分，通常膨大成构部分，通常膨大成粒状。粒状。（三）真核生物端粒的形成：（三）真核生物端粒的形成：功能功能 维持染色体的稳定性维持染色体的稳定性 保证保证DNA复制的完整性复制的完整性端粒的结构特点端粒的结构特点 由末端单链由

31、末端单链DNA序列和蛋白质构成。序列和蛋白质构成。 末端末端DNA序列是多次重复的富含序列是多次重复的富含G、T碱基的短碱基的短 序序列。列。TTTTGGGGTTTTGGGG线性线性DNA在复制完成后，其末端由于引物在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短。故需要在的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶端粒酶的催的催化下，进行延长反应。化下，进行延长反应。5 3 3 5 5 3 3 5 端粒酶端粒酶(telomerase)端粒酶是一种端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体，它可蛋白质复合体，它可以其以其RNA为模板，通为模板，通过逆转录过程对末端过逆转录过程对末端DNA链进行延长。链进行

32、延长。端粒酶的分子结构端粒酶的分子结构 端粒酶端粒酶RNA ( hTR） 端粒酶协同蛋白（端粒酶协同蛋白（hTP1） 端粒酶逆转录酶（端粒酶逆转录酶（hTRT） 端粒酶的组成端粒酶的组成端粒酶的作用机制端粒酶的作用机制爬行模型爬行模型端粒酶的爬行模型（动画演示）端粒酶的爬行模型（动画演示）第四节第四节 逆转录和其他复制方式逆转录和其他复制方式一、概念一、概念 逆转录指遗传信息从逆转录指遗传信息从RNA流向流向DNA，是，是RNA指导下指导下的的DNA合成过程，即以合成过程，即以RNA为模板，四种为模板，四种dNTP为原料，为原料，合成与合成与RNA互补的互补的DNA单链。单链。 逆转录逆转录酶

33、酶二、逆转录酶二、逆转录酶 催化逆转录过程的酶称逆转录酶，催化逆转录过程的酶称逆转录酶，RNA病毒中都含有此病毒中都含有此酶。酶。 具有三种酶活性：具有三种酶活性： RNA指导的指导的DNA聚合酶活性聚合酶活性 RNA酶活性酶活性 DNA指导的指导的DNA聚合酶活性聚合酶活性逆转录病毒细胞内的逆转录现象：逆转录病毒细胞内的逆转录现象：RNA 模板模板逆转录酶逆转录酶DNA-RNA 杂杂化双链化双链RNA酶酶单链单链DNA逆转录酶逆转录酶双链双链DNA逆转录酶逆转录酶 A AA A T T T TAAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T分子生物学研究可应用分子

34、生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，程目的基因的重要方法之一，此法称为此法称为cDNA法。法。 以以mRNA为模板，经逆为模板，经逆转录合成的与转录合成的与mRNA碱基序碱基序列互补的列互补的DNA链。链。 试管内合成试管内合成cDNAcDNAcDNA 三、逆转录研究的意义三、逆转录研究的意义 逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。的重大发现。 逆转录逆转录现象说明：至少在某些生物，现象说明：至少在某些生物，RNA同样同样兼有遗传信息传代与表达功能。兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病

35、毒的研究，拓宽了对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意世纪初已注意到的病毒致癌理论。到的病毒致癌理论。 第五节第五节 DNA的损伤与修复的损伤与修复 由自发的或环境的因素引起由自发的或环境的因素引起DNA一级结构的任一级结构的任何异常的改变称为何异常的改变称为DNA的损伤的损伤，也称为，也称为突变突变（mutation）。）。常见的常见的DNA的损伤包括碱基脱落、碱基修饰、的损伤包括碱基脱落、碱基修饰、交联，链的断裂，重组等。交联，链的断裂，重组等。 一、突变的意义一、突变的意义（一）突变是进化、分化的分子基础（一）突变是进化、分化的分子基础（二）突变导致基因型改变（二）突变导致基因型改变

36、（三）突变导致死亡（三）突变导致死亡（四）突变是某些疾病的发病基础（四）突变是某些疾病的发病基础（一）自发因素：（一）自发因素： 1.自发脱碱基自发脱碱基：由于由于N-糖苷键的自发断裂，引起嘌糖苷键的自发断裂，引起嘌呤或嘧啶碱基的脱落。每日可达近万个核苷酸残基。呤或嘧啶碱基的脱落。每日可达近万个核苷酸残基。 2.自发脱氨基自发脱氨基：胞嘧啶自发脱氨基可生成尿嘧啶，胞嘧啶自发脱氨基可生成尿嘧啶，腺嘌呤自发脱氨基可生成次黄嘌呤。每日可达几十到腺嘌呤自发脱氨基可生成次黄嘌呤。每日可达几十到几百个核苷酸残基。几百个核苷酸残基。 3.复制错配复制错配：由于复制时碱基配对错误引起的损伤，由于复制时碱基配对

37、错误引起的损伤，发生频率较低。发生频率较低。 二、引起突变的因素二、引起突变的因素由紫外线、电离辐射、由紫外线、电离辐射、X射线等引起的射线等引起的DNA损伤。其中，损伤。其中，X射线和电离辐射常常引起射线和电离辐射常常引起DNA链的断裂，而链的断裂，而紫外线紫外线常常常引起常引起嘧啶二聚体嘧啶二聚体的形成，如的形成，如TT，TC，CC等二聚体。等二聚体。这些嘧啶二聚体由于形成了共价键连接的环丁烷结构，这些嘧啶二聚体由于形成了共价键连接的环丁烷结构，因而会引起复制障碍。因而会引起复制障碍。 （二）物理因素：（二）物理因素：嘧啶二聚体的形成嘧啶二聚体的形成 UV1.脱氨剂脱氨剂：如如亚亚硝 酸

38、与 亚 硝 酸硝 酸 与 亚 硝 酸盐盐，可加速，可加速C脱脱氨基生成氨基生成U，A脱氨基生成脱氨基生成H。 （三）化学因素：（三）化学因素：2.烷基化剂烷基化剂：这是一类带有活性烷基的化合物，可提供这是一类带有活性烷基的化合物，可提供甲基或其他烷基，引起碱基或磷酸基的烷基化，甚至甲基或其他烷基，引起碱基或磷酸基的烷基化，甚至可引起邻近碱基的交联。可引起邻近碱基的交联。3.DNA加合剂加合剂：如苯并芘，在体内代谢后生成四羟苯如苯并芘，在体内代谢后生成四羟苯并芘，与嘌呤共价结合引起损伤。并芘，与嘌呤共价结合引起损伤。4.碱基类似物碱基类似物：如如5-FU，6-MP等，可掺入到等，可掺入到DNA分

39、子分子中引起损伤或突变。中引起损伤或突变。5.断链剂断链剂：如过氧化物，含巯基化合物等，可引起如过氧化物，含巯基化合物等，可引起DNA链的断裂。链的断裂。 常见的化学诱变剂常见的化学诱变剂化合物类别化合物类别作作 用用 点点分子改变分子改变碱基类似物碱基类似物如：如：5-BUA 5-BU G- A - T - G - C -羟胺类（羟胺类（NH2OH）T C- T - A - C - G -亚硝酸盐（亚硝酸盐（NO2）C U- G - C - A - T -烷化剂烷化剂如：氮芥类，如：氮芥类，NitrominsG mGG mGDNA缺失缺失G三、突变的分子改变类型三、突变的分子改变类型 转转换

40、换相相同同类类型型碱碱基基的的取取代代。 颠颠换换不不同同类类型型碱碱基基的的取取代代。 点点突突变变 插插入入增增加加一一个个碱碱基基。 缺缺失失减减少少一一个个碱碱基基。 插插入入 增增加加一一段段顺顺序序。 缺缺失失 减减少少一一段段顺顺序序。 复复突突变变 倒倒位位 一一段段碱碱基基顺顺序序发发生生颠颠倒倒。 移移位位 一一段段碱碱基基顺顺序序的的位位置置发发生生改改变变。 重重排排 一一段段碱碱基基顺顺序序与与另另一一段段碱碱基基顺顺序序发发生生交交换换。 DNA分子上单一碱基的改变称分子上单一碱基的改变称点突变点突变。发生在同型碱基之间，即嘌呤代替发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一

41、嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。 1. 转换转换发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。啶或嘧啶变嘌呤。 2. 颠换颠换镰形红细胞贫血病人镰形红细胞贫血病人Hb (HbS) 亚基亚基N-val his leu thr pro val glu C 肽链肽链CAC GTG基因基因正常成人正常成人Hb (HbA) 亚基亚基N-val his leu thr pro glu glu C 肽链肽链CTC GAG基因基因血红蛋白血红蛋白 -亚基的点突变亚基的点突变3. 缺失：缺失：一个碱基或一段核苷酸链从一个碱基或一段核苷酸链从DNADNA大分子

42、大分子上消失。上消失。4. 插入：插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到入到DNA大分子中间。大分子中间。框移突变框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。 缺失或插入都可导致缺失或插入都可导致框移突变框移突变。谷谷 酪酪 蛋蛋 丝丝5 G C A G U A C A U G U C 丙丙 缬缬 组组 缬缬正常正常5 G A G U A C A U G U C 缺失缺失C缺失引起的框移突变缺失引起的框移突变5.5.重排重排 DNA分子内较大片段的交换，称为重分子

43、内较大片段的交换，称为重组或重排。组或重排。由基因重排引起的两种地中海贫血基因型由基因重排引起的两种地中海贫血基因型四、四、DNA损伤的修复损伤的修复DNA损伤修复损伤修复 ：是对已发生分子改变的补偿措施，使是对已发生分子改变的补偿措施，使其尽可能回复为原有的天然状态。其尽可能回复为原有的天然状态。光修复光修复切除修复切除修复重组修复重组修复SOS修复修复 修复的主要类型：修复的主要类型：无差错修复无差错修复有差错倾向修复有差错倾向修复这是一种广泛存在的修复作用，能够修复任何嘧啶二聚这是一种广泛存在的修复作用，能够修复任何嘧啶二聚体的损伤。体的损伤。修复过程由修复过程由光修复酶光修复酶催化完成

44、。催化完成。（一）光修复：（一）光修复：光修复酶的光修复酶的分子结构分子结构光光其修复过程为：其修复过程为：1. 光修复酶光修复酶识别嘧啶二识别嘧啶二聚体并与之结合形成复聚体并与之结合形成复合物。合物。2. 在在300600nm可见光可见光照射下，酶获得能量，照射下，酶获得能量，将嘧啶二聚体的丁酰环将嘧啶二聚体的丁酰环打开。打开。3. 光修复酶从光修复酶从DNA上解离。上解离。 这也是一种广泛存在的修复机制，可适用于多种这也是一种广泛存在的修复机制，可适用于多种DNA损伤的修复。损伤的修复。切除修复机制的基本过程是将受损的切除修复机制的基本过程是将受损的DNA片段切除，片段切除，然后再以对侧链

45、为模板，重新合成新链进行修复。然后再以对侧链为模板，重新合成新链进行修复。（二）切除修复（二）切除修复在原核生物中，与在原核生物中，与DNA切除修复有关的蛋白质切除修复有关的蛋白质包括包括UvrA、UvrB、UvrC，以及，以及DNA pol 和连接酶。和连接酶。UvrA和和UvrB主要起辨认和结合受损部位的作主要起辨认和结合受损部位的作用；而用；而UvrC则主要与受损片段的切除有关。则主要与受损片段的切除有关。原核生物原核生物DNA切除修复的机制切除修复的机制真核生物真核生物XPXP切除修复系统切除修复系统1.1.识别识别3.3.切除切除4.4.修复修复2.2.组装组装这是这是DNA的复制过

46、程中所的复制过程中所采用的一种有差错的修复采用的一种有差错的修复方式。方式。 修复时，利用重组蛋白修复时，利用重组蛋白RecA的核酸酶活性，将另的核酸酶活性，将另一股健康亲链与损伤缺口一股健康亲链与损伤缺口相互交换。相互交换。 （三）重组修复（三）重组修复RecA的分子结构的分子结构RecARecA重组蛋白修复重组蛋白修复DNADNA示意图示意图当当DNA损伤广泛难以继续复制时，由此而诱发出一系损伤广泛难以继续复制时，由此而诱发出一系列复杂的反应。列复杂的反应。在在E. coli中，各种与修复有关的基因，组成一个称为中，各种与修复有关的基因，组成一个称为调调节子节子的网络式调控系统。的网络式调控系统。这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。通这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。通过过SOS修复，复制如能继续，细胞是可存活的。然而修复，复制如能继续，细胞是可存活的。然而DNA保留的错误较多，导致较广泛、长期的突变。保留的错误较多，导致较广泛、长期的突变。 （四）（四）SOS修复修复