中科院大学张竹青单分子考试总结

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1、一，宙诺数Re(Reynoldsnumber)表示作用于微团的与粘性力工之比。两个几何相似的宙诺数相等.则对应微团的惯性力与粘性力之比相等。宙诺数较小时.黏滞力对流场的影响大于惯性力，流场中流速的扰动会因黏滞力而衰减.流体流动稳定.为：若宙诺数较大时.惯性力对流场的影响大于黏滞力，流体流动较不稳定，流速的微小变化容易发展、増强.形成紊乱.不规则的流场。宙诺数越小意味普粘性力影响越显着，越大则惯性力影响越显着。二，荧光产生原理，光致发光一物质分子吸收光能后.其电子由基态跃迁到激发态，激发态的分子以电磁辐射的形式释放能虽回到基态.称为光致发光。荧光一受光激发的分子从第一激发矗重态的最低振动能级回到

2、基态所发出的辐射c磷光一受光激发的分子从第一激发三重态的最低振动能级回到基态所发出的辐射c荧光光谱的主要參数和特征：(1) 童子产率荧光量子产率也叫荧光效率或虽子效率它农示物质发射荧光的能力，通常用下式表示发射荧光虽子数/吸收光量子数(2) 荧光寿命：十某种物质被一束激光激发后，该物质的分子吸收后从跃迁到某一激发态上,再以辐射跃迁的形式发出荧光回到基态、“I激发停止后，分子的荧光强度降到激发时最大强度的1/e所需的时间称为荧光寿命.它表示粒子在存在的平均时间，通常称为激发态的荧光寿命。(3) 亮度：斯托克司(stokes)位移：斯托克司位移为最大荧光波长与最大激发波长之差特征：(1荧光淬灭：是

3、抬导致特定物质的荧光强度和寿命减少的所有现線。(2) 荧光漂白：photochemicaldestructionofafluorophore.aphenomenondescribingafluorophoreinabilitytobeexcitedagainafterundergoingrepetitiveexcitationandemissioncycles(3) 荧光闪烁：ThephenomenonofrandomswitchingbetweenON(bright)andOFF(dark)statesoftheemitterunderilscontinuousexcitation.主要荧光

4、标记：有机染料荧光贵白虽子点三，单分子研究中常用显微术：(原理)(1) 激光共聚焦显微镜：Confocal利用放宜在光源后的照明针孔和放宜在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测來自光源的光通过照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在探测针孔上，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点來说是共犯的因此被探测点即共焦点，被探测点所在的平面即共焦平Iftloit算机以像点的方式将被探测点显示在讣算机屏幕上，为J产生一幅完整的图像，由光路中的扫描系统在样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的共焦图像C只要戦物台沿若Z轴上下移动，将样品新的一个

5、层面移动到共焦平面上，样品的新层面又成像在显示器上.随着Z轴的不断移动，就可得到样品不同层面连续的光切图像。(2) 全内反射荧光显微镜TIRF：全内角反射荧光显微镜(totalinternalreflectionfluorescencemicroscope.TIRFM),利用光线全反射后在介质另一倆产生衰逝波的特性.激发荧光分子以观察荧光标定样品的极薄区域，观测的动态范圉通常在200nm以下因为激发光呈抬数衰减的特性，只有极靠近全反射而的样木区域会产生荧光反射.大大降低了背景光噪声T扰观测标的.能帮助研究者获得商质量的成像质虽和可崟的观测数据故此项技术广泛应用于细胞表而物质的动态观察。光学原理

6、：为一束光从光密介质进入光跤介质时，根据斯涅耳定律一部分光会发生折射，而一部分光会发生反射，X入射角度不断増大，折射角也会不断增大.、”I折射角刚好达到90度时.就发生r全反射现彖。全反射发生后.折射光有一个临界状态沿肴折射面传播，这部分光我们称之为隐失波，其能虽:在z轴上呈现指数衰减。（3）近场光学显微镜NS0M：根据非辐射场的探测与成像廉埋，能够突破普通光学显微镜所受到的衍射极限，采用亚波长尺度的探针在距离样品表面几个纳米的近场范用进行扫描成像的技术，在近场观测范困内.在样品上进行扫描而同时得到分辨率祐于衍射极限的形貌像利光学像的眾微镜。近场光学显微镜适用于超尚光学分辨率下进行纳米尺度光学

7、成像与纳米尺度光谱研尤C传统光学显微镜的分辨率受到光学衍射极限影响.分辨率不超过该波长尺度范用。与传统光学显微镜不同的是.近场光学显:微镜利用亚波长尺度探针.可以得到更小分辨率。使用由熔拉或腐蚀光纤波导所制成之探针在外表镀上金属薄膜已形成末端具有15nm至100am直径尺寸之光学孔径（opticalaperture）的近场光学探针，再以可作精密位移与扫描探测之压电陶浇材料（piezoelectrcalceramics）配合原子力显微技术（atomicforcemicroscopy,AFM）所提供粘确的高度回馈控制.将近场光学探针非常粘确地（垂直与水平干样品表血的方向之空间解析度可分别达到约与l

8、nm）控制在彼测样品表面上lnm至100am的商度，进行三维空间可回馈控制的近场扫描（scanning）,而具有奈米光学孔径之光纤探针即可做接收或发射光学讯息之用.由此获得一真实空间之三维近场光学影像，因其与样品表面距离远小于一般光波波长，测得的信息皆属近场光学作用的信息.无平常常见的远场光学中绕射极限的光学解析度限制。四，单分子荧光共振能最转移smFRET：原理：荧光兵按i站t转移是指在两个不同的荧光基团中.如果一个荧光基团（供体Donor）的发射光谱与另一个基团（受体Acceptor）的吸收光谱有一定的重栓，半这两个荧光基团间的距离合适时（一般小于100A）,就可观察到荧光能虽由供体向受体

9、转移的现線.即以前一种基团的激发波长激发时.可观察到后一个基团发射的荧光c简单地说，就是在基团的激发状态下由一对介导的能址从供体向转移的过程此过程没有光子的参与.所以是非辐射的.供体分子被激发后，、”I受体分子与供体分子相距一定距离，且供休和受体的基态及第一电于激发态两者的振动能级间的能址差相互适应时，处于激发态的供体将把一部分或全部能址转移给受体使受体被激发，在整个能虽:转移过程中.不涉及光子的发射和重新吸收。如果受体荧光量子产率为零，则发生能址转移荧光熄灭：如果受体也是一种荧光发射体，则呈现出受体的荧光并造成次级荧光光谱的红移。产生条件：供体和受体都能发光供体的发射谱和受体的激发谱必须有部

10、分重叠供体和受体的距离必须小于100A供体和受体的取向状态合适对荧光标记要求：光稳定.足够亮，对标记分子影响小供体发射谱和受体吸收谱有一定重叠供体发射谱和受体发射谱尽可能分开供体和受体的址子产率相当准条过程：标记荧光分子表面固定数据分析五，smFRET应用和技术进展：应用:structure、dynamics,andmechanismofnucleicacids protein-nucleicacidinteraction protein-proteininteraction molecularmotorsprotein-foldingTranslation.DNAprocessing,hom

11、ologousrecombination,transcriptionregulationnucleosomedynamics,membranefusion技术进展：smFRETinLivingCellssniFRETMethodsBasedonAlternatingLaserExcitation(ALEX)MultipleFRETPairMethodsCombinationsofsmFRETwithOtherSingle-MoleculeMethods六，荧光相关光谱FCS：原理：荧光相关光谱技术是一种利用荧光强度随时间的涨落进行分析检测的荧光光谱技术。某一物质的荧光强度与其浓度成正比。同样.

12、在开放微区内平衡时记录的荧光信号强度也与其中的荧光分子数成正比。由于荧光分子的扩散(或由于化学反应)导致进入或离开微区的分子数目总是在其平衡值处发生变化，因而导致荧光信号强度F(t)也不断变化(即产生荧光的涨落现彖).它是时间的函数。(是一种统计小样木中荧光分子的荧光强度波动的相关分析方法，在这种方法的经典模式中样木休积被聚焦激光束和共焦小孔所限定，样木发出的荧光被高数值孔径的显微镜物镜所收集.然后彼灵敏的单光子汁数器所监测,被探测到的荧光是随时间波动的.且这些时间函数是自相关的，归一化的荧光波动自相关函数提供了两类信息，函数的大小反比于所观测的荧光分子的平均数虽，时间衰退的速率和形态反映J所

13、观测的荧光分子的动力学特征)自相关函数：Thephysicalmeaningoftheautocorrelationisthatitisdirectlyproportionaltotheprobabilityofdetectingaphotonatumeuftherewasaphotondetectioneventattunezero.(1) Thetemporaldecayofthecorrelation,thatis.thetemporaldecayofG(t)withincreasinglag-timewillbeproportionaltothediffusionspeedofthem

14、olecule:thelargerthediftusioncoefficient,thefasterarethefluorescencecorrelationdecays.secondimportantpropertyof(ACF)isitsdependenceontheconcentrationoffluorescingmolecules.Tliereisadirectconnectionbetweentheinverseconcentrationoffluorescingmoleculesand(heamplitudeoftheACE荧光交叉相关光谱FCCS：ScanningFCS：衍身i

15、f极限(diffractionresolutionlimit)因为一般光学系统的口径都是恻形，这样每个物点的像就是一个弥散斑.两个弥散斑靠近后就不好区分，这样就限制r系统的分辨率，这个斑越大，分辨率越低。这个限制是物理光学的限制.是造成的。分辨率辰商只能到光波长的一半。衍射极限公式是sin)=X/Do其中0是角分辨率X是波长，D是光圈直径。突破衍射极限的方法1，基于软件的解决方法FIONASTORMPAWL2,基于锁件的解决办法STEDSSIM超高分辨成像PSF的平均标准误a-/2Srrsfb2Na2N2）第一项，光子数误差第二项，像素尺寸误差第三项，背景误差一，FIONA（单纳米精度荧光成像

16、）1原理：在一秒内一个荧光发色团收集10000个光子凭借大址的光子数据.根据PSF（点函数）汁算,像素可以精确到土2精度：3应用举例:肌球（myosin）蛋白步行模型二，SHRImP（单分子光漂白高分辨成像）原理：原木两个荧光团定位，其中一个漂白后，利用两种图像对比可以穩确定位三，SHREC（单分子高分辨率荧光共定位）原理：用不同的荧光分子（通常为2个）作为探针.共同标记同一部位.交從成像.经行定位。举例:myosinV的步行双链DNA长度的测虽分子的取向：分子取向力发生在极性分子与极性分子之间。由干极性分子的电性分布不均匀.一端带正电.一端帯负电，形成偶极。I大I此，、“I两个极性分子相互接

17、近时.由于它们偶极的同极相斥，界极相吸，两个分于必将发生相对转动。这种偶极子的互相转动，就使偶极子的相反的极相对叫做“取向二1,DOPI（散焦定位成像）原理：成像CCD不汇聚光线至焦点，这样发光的样木成像就会呈现出散焦的斑块，光斑包含若取向信息。精度与所收集的光子数相关。举例:肌球蛋白V的角度信息（偏振全内发射荧光显微镜）原理：十有偏振光打入时，荧光分子会优先吸收与其取向平行的光.产生荧光，获取坐标数后讣算.可以获得荧光分子取向信息。举例：myosinVI四，STORM（随机光学重构显微镜）原理：随机光学重建显微镜（STORM）是一种雋级的光学显微术.通过这一技术能够表现组织或细胞更加细微的结

18、构。之前广泛应用于生物医学领域的光学显微技术由于受到衍射极限的限制，分辨率通常为几百个纳米左右。这要比细胞内典型的分子结构大，这样很多生物学的研尤都无法用光学显微镜实现。而STORM采用光转换荧光探针，在时间上分离相互熏叠发光的荧光分子，然后眾构得到高分辨率图像利用激活子报告子形成光开关，再随机照射成像，如此循环.得到一组荧光图像，最后把所成像叠加。分辨率:20nm横向，50nm轴向举例:神经细胞的观察五，PAML（光激活定位显微技术）原理：依赖于一系列的光激活荧光黃白，荧光蛋白再依次漂白，获得搞精度成像精度:10nm基于硬件一，STED（受体发射损耗显微术）原理：能虽由基态到激发态会吸收光子

19、，从激发态回到基态时会释放光子，两种光子的波长，极性，取向相同根据捕捉到的光子成像。激发光和衰减光的重叠决定了分辨率。精度：6nm-20nm举例：神经细胞树突二，SSIM（饱和结构照明显微术）原理：通过衍射光栅将激发光分成两束到达样木，出现正弦曲线图案.激发光在顶点激发荧光.在零点不激发从而产生暗视野。大址的成像是通过扫描和转动转盘实现的.可以突破衍射极限。精度：50nm原子力显微镜原理AFM：将探针装在一弹性微悬臂的一端.微悬臂的另一端固定，、”I探针在样品表而扫描时.探针与样品表面原子间的作用力会使得微悬臂轻微变形.这样，微悬臂的轻微变形就可以作为探针和样品何作用力的直接量度。一束激光经微

20、悬臂的背面反射到光电检测器.可以粘确测址微悬精的微小变形.实现了通过检测样品与探针之间的原子间作用力來反映样品表面形貌和结构。AFM测虽对样品无特殊要求.用來研究包括绝缘休在内的固体材料表面结构。从而弥补了扫描隧道显微镜的不足。与STM大的差别在于并非利用电子隧穿效应.而是检测原子之间的接触，原子惟合.范徳华力等來呈现样品的表面特性。接触模式:在整个扫描成像过程之中.探针针尖始终与样品表面保持紧密的接触.是排斥力。施加在针尖上的力有可能破坏的。若表而柔嫩而不能承受这样的力便不宜选用接個模式对样品表而进行成像C非接他模式:在距离试样表血上方510nm的距离处振荡。样品与针尖之间的相互作用由范德华

21、力控制样品不会被破坏.而且针尖也不会被污染，特别适合于研尤柔嫩物体的表面。这种操作模式的不利之处在于要在室温环境下实现这种模式十分困难。因为表而不可避免地会积聚薄簿的一层水，它会在样品与针尖之间搭起一小小的毛细桥.将针尖与表面吸在一起.从而増加尖端对表面的压力。敲击模式:介于接触模式和非接触模式之间，是一个杂化的概念。在试样表而上方以其振荡.针尖仅仅是周期性地短暂地接触/敲击样品表面。出检测柔嫩的样品时.敲击模式是最好的选择之一。一旦AFM开始对进行成像扫描.装亘随即将有关数据输入系统.如表面粗糙度、平均高度、峰谷峰顶之间的最大距离等.用干物体。同时AFM还可以完成工作，测址的弯曲程度來确定针

22、尖与样品之间的作用力大小。单分子力谱：基于AFM等技术的的单分子力谱是研尤痈分子体系中的分子内与分子间相互作用.进而揭示起超分子结构的木质及动态过程的一种新型纳米表征技术。力一伸展曲线（FEC）：首先吸附岛分子样品的基片随着斥电陶瓷管的运到而与针尖逼近在样品表血开始逼近微悬臂而并没有接触到针尖的过程中.如果悬臂每一天受到吸引或排斥力.微悬臂处于一种松弛状态.光学检测信号为零。压电陶瓷管的扫描信号被记录下來，形成扫描基线。如图Ac、勺针尖接近样品表而时，针尖与基底之间的排斥力使得悬臂发生偏转如图B（这种由排斥力引发的偏转为负向偏转，从力谱仪上获得的光电信号经过转换后，就可以得到一条力一伸展曲线、

23、|针尖与样品分离时，连到针尖与基片之间的商分子链会被拉伸.而这种针尖与样品的相互作用会引起悬臂弯曲，此时悬诗为正向偏转，表现为吸引力。导致力曲线上拉伸信号产生的这一区域能够给出关于单链弹性性质的丰富信息，因此成为数据分析过程中的重点研究对線。如图C。报后，X岛分子受到进一步拉伸后，这种介于针尖和基底之间的桥连结构中较为薄弱的部分会发生脱落使悬诗迅速复原.表现为力曲线上的力值迅速掉回零点。光阱：一种通过高度聚焦激光束产生力（虽级通常为皮牛顿级）移动微小透明物体的装宜用于移动细胞或病毒颗粒，把细胞捏成幹种形状，或者冷却原子。光是一种特殊的物质.携带有能址和动虽，光与物质相互作用时彼此交换能虽和动虽

24、.产生各种效应。光与物质间可以交换动址.使受光照射的物体受到一个力或力矩.也即产生光的力学效应。由于通常光源发出的光产生的力学效应太微弱.这一效应在激光发明之后才引起人们的关注.并取得了突破性进展。基木原理：拓度聚焦激光束通常是通过使激光通过显微镜物镜得到的。聚焦后的激光光束最窄的部分（光束腰）会存在非常强的电场梯度。介电质颗粒会被吸引至电场梯度最髙的区域，也就是光束的中心。同时电场还会在光束传播方向上对颗粒产生力。这点可以通过动虽守恒來理解。光束中的介电质颗粒会吸收并散射光子.于是就会产生相应的动址的变化。如果颗粒不在光束腰上.由于光场光强梯度的影响.颗粒族个方向上会受到不均匀的力将其拉向光

25、强最强的区域。光锣是非常辅确的设备.可以将亚微米级的颗粒移动亚纳米级的距离。所以.光锣常常被用于研尤和操作DNA.蛋白质，曲甚至是取个分子。在定址科学测址中.通常电介质颗粒都会不移动到离光束中心很远的地方。Scaucri叩force：位于光传播方向上，大多数悄况下所受的力Gradiemforce：位于光密度梯度上.如果光有很大的亮度剃度时比较明显十颗粒与光束中心的距离很小时.颗粒受到的力与颗粒与光束中心的距离成正比。因此.其特性类似于普通的弹簧系统.遵守胡克定律.磁阱：川电磁场形成的一种“势能坑町以被收集在坑内存起权一种原子阱叫磁阱S它利用两个平行的电流方向相反的线圈构成。这种阱中心的磁场为零

26、，向四周磁场不断增强陷在阱中的原子具有磁矩，在中心时筠能最低。偏离中心时就会受到不均匀磁场的作用力而返回。这种阱曾捕获1012个原子.捕陷时间长达12minoFISH荧光原位杂交：将DNA（或RNA）探针用持殊的孩昔酸分子标记然后将探针直接朵交到染色休或DNA纤维切片上，再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特界性结合來检测DNA序列在染色体或DNA纤维切片上的定性.定位.相对定量分析.FRAP荧光漂白恢复：用标记或膜脂.然后用激光束照射某一区域使被照射区的变暗。由于膜的流动性.区域的亮度逐渐増加最后恢复到与周碉的荧光强度相等。根据恢复的速度可推算出或膜脂扩散速度。FLIP荧光漂白消失：有

27、些荧光恢复的速度非常快.荧光漂白与恢复几乎同时发生，所以FRAP实验无法实现这些快速变化标木的动力学研尤。FLIP与FRAP类似同样在细胞上选取局部刺激区域.用强激光反复刺激，不同之处是FRAP记录的是被漂白区域的荧光恢复过程，而FLIP记录的是未被谏白区域的荧光损失过程该技术为检査内质网、纽I胞核和细胞质等区室的边界提供了强有力的匸具。FLIM荧光寿命成像：荧光寿命是指分子受到光脉冲激发后返回基态之前在激发态平均停留的时间.处于激发态的荧光分子在退激发到基态的过程中发射荧光释放能:S.激发态荧光团荧光强度的衰减用数学式表达为单抬数函数C荧光寿命取决于荧光分子所处的微环境，通过对样品荧光寿命的

28、测址和成像可以定虽获取样品的功能信息。以往荧光分析或成像技术大女基于荧光强度的测虽.容易受激发光强度、样品猝灭和荧光染料的分布浓度等许女因素的影响I大I此难以做到定址测址，而FLIM的测虽一般來说是绝对的.不受激发光强度变化、荧光团的浓度和光漂白等因素的影响，且不受其他限制强度测虽因素的制约，仅与荧光团所处的微环境密切相关.因此.通过对样品进行FLIM.可以对分子所处微环境中的许女生物物理.生物化学参数如PH值、离子浓度、辄压、溶液疏水性及猝灭剂（如碘化物、丙烯酰胺）等的分布.进行定量测址。应用：细胞内PH值和离子浓度成像，细胞过程的时间分辨成像，组织成像和临床应用，FRET+FLIM测定细胞内分子的相互作用玻璃微针分析法？基于流体力学分析法？