发酵制药巩健子学习情境4教案

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1、子学习情境4 青霉素发酵任务一 青霉素的结构和理化性质一、 -内酰胺类抗生素特性和作用机制1. 结构特性都含有一个四元的内酰氨环，并通过N与相邻的碳原子和另外一个杂环相稠合。2. 物理性质白色或黄色无定型或结晶性固体。熔点不明显，具有旋光，酸性形式易溶于有机溶剂，盐易溶于极性溶剂，特别是水。3. 化学性质化学性质活泼，由于稠环的作用，青霉素的内酰胺环很易开环，头孢菌素相对稳定。4. 作用机制通过抑制肽聚糖转肽酶及D-丙氨酸羧肽酶的活性抑制肽聚糖的合成，从而干扰细胞壁的合成。二 发展概况1929 Fleming 首先发现青霉素可抑制葡球菌的生长，但并未获得足够重视1940 Florey Chai

2、n青霉菌发酵液中提取出了青霉素1945 意大利 Brotzu 发现头孢菌素C1958后 人工合成半合成青霉素、头孢菌素陆续发现头霉素、克拉维酸、硫霉素、单环-内酰胺三 常用的-内酰胺类抗生素（一）青霉素：苄青霉素、青霉素V、氨苄西林、替卡西林、甲氧西林、氯唑西林(一) 头孢菌素头孢菌素C、头霉素C、头孢力行、头孢克洛、头孢唑啉、头孢西丁、头孢他啶（一） 新型-内酰胺四、天然存在的青霉素青霉素是一族化合物的总称。分子式：R为侧链，根据R基不同青霉素G C6H5CH2-青霉素X HOC6H4CH2-青霉素F CH3CH2CH=CHCH2-青霉素K CH3(CH2)6-双氢青霉素F CH3(CH2)

3、4-青霉素V C6H5OCH2-五、青霉素的理化性质（一）稳定性干燥纯净的青霉素盐很稳定，有效期都在三年以上，并且对热稳定，如结晶青霉素钾盐在150OC加热1.5小时效价不降低。青霉素水溶液PH=5-7较稳定。最稳定的PH为6-6.5。（一） 溶解度青霉素在水中溶解度小，易溶于有机溶剂青霉素盐易溶于水、甲醇（二） 降解反应青霉素遇酸、碱、加热易开环，倒是抗菌活性丧失。详见课本（三） 紫外吸收光谱在252nm 257nm 264nm具有弱的吸收峰（四） 过敏反应任务二 发酵法工艺过程现代抗生素生产绝大多数采用发酵法生产，虽然种类繁多，但其基本过程大致相同。菌种孢子制备种子制备发酵发酵液的预处理及

4、过滤提取及精制成品检验成品包装出厂检验。一般说，从孢子制备到发酵属于“生物合成”范围从预处理到提取精制属于化工范围一 生产菌种菌种是发酵生产的基础，必须产量高、性能稳定、容易培养。为防止菌种衰退，要合理保藏。一般保存在沙土管或冷冻于干燥管中。一般使用期为年，不断纯化淘汰变异菌种。有条件的可以菌种选育，不断提高产量。二、 孢子制备孢子制备是发酵工序的开端，孢子的质量、数量对以后菌丝体的生长繁殖有很大的影响。不同菌种的孢子制备工艺是不同的。（一）.放线菌类培养基：人工合成固体培养基，C源N源不要太丰富。以利于产生大量孢子温度：大多28 土 1CO 部分菌种30 CO或者37时间：（因菌种不同而异）

5、一般4-7天保存：2-4 CO冰箱保存一周左右放线菌发酵生产的工艺过程如下：采用哪一代的斜面孢子接入液体培养，视菌种特性而定。采用母斜面孢子接人液体培养基有利于防止菌种变异，采用子斜面孢子接入液体培养基可节约菌种用量。菌种进入种子罐有两种方法。一种为孢子进罐法，即将斜面孢子制成孢子悬浮液直接接人种子罐。此方法可减少批与批之间的差异，具有操作方便、工艺过程简单、便于控制孢子质量筹优点，孢子进罐法已成为发酵生产的一个方向。另一种方法为摇瓶菌丝进罐法，适用于某些生长发育缓慢的放线菌，此方法的优点是可以缩短种子在种子罐内的培养时间。（二）.霉菌类培养基：天然培养基（大米、小米、麦麸）工艺过程：沙土管-

6、斜面-亲米-生产米-种子罐首先将保存于沙土管中或冷冻管中的菌种孢子接种在斜面上，恒温培养，孢子成熟后制作成孢子悬浮液然后接种到大米或小米等培养基上，恒温成熟后称为“亲米”，由亲米再转至大米或小米培养基上，培养成熟后称为“生产米”，用生产米介入种子罐内，培养温度一般为25-28度，培养时间一般为4-14天。（三）.细菌类培养温度：37CO 少数为28 CO培养时间：多数1-2天 有的芽孢需要5-6天，甚至十多天（四）影响孢子质量的因素及其控制1、原材料质量的影响多数抗生素产生菌对原材料敏感。如：四环素斜面孢子与小麦麸皮质量关系密切，小麦的产地、品种、加工方法、成份用量对孢子质量均有影响。青霉素的

7、大米孢子，由于大米产地、颗粒大小、均匀程度不同如：琼脂的牌号不同对孢子的质量也有影响。原因是不同的琼脂含有不同的无机离子。如：水质。污染，硬度大。人工调节2、.培养条件的影响1.温度： CO正常生长，超过28就不能正常生长。土霉素产生菌在36.5-37 CO，超过37CO，孢子早熟易老化北方控制在40-45%，南方控制在35-42%（三）冷藏时间的影响总的原则是易短不易长，一般不超过7天。（四）孢子龄及孢子量的影响过于年轻的孢子经不起冷藏，过于衰老的孢子生产能力下降，控制在孢子成熟、孢子量多、效价正常时为宜。孢子量过多或过少，对发酵也是不利的。小结：本节介绍了青霉素的结构和作用机理。介绍了发酵

8、生产抗生素的菌种制备过程和孢子培养过程。三、种子制备种子制备是将固体培养基上培养出的孢子或菌体转入到液体培养基中培养，使其繁殖成大量菌丝或菌体的过程。(一)摇瓶种子制备某些孢子发芽和菌丝繁殖速度缓慢的菌种，需将孢子经摇瓶培养成菌丝后再进人种子罐，这就是摇瓶种子。目的就是让孢子发芽长成健壮的菌丝。摇瓶种子进罐，常采用母瓶、子瓶两级培养，有时母瓶种子也可以直接进罐。培养基：其培养基配方和培养条件与种子罐相似，要求比较丰富和完全，易被菌体分解利用，氮源丰富有利于菌丝生长。原则上各种营养成分不宜过浓，子瓶培养基浓度比母瓶略高，更接近种子罐的培养基配方。（二）种子罐种子制备孢子悬浮液或摇瓶种子接入种子罐

9、后，在罐内繁殖成为大量菌丝的过程，从而缩短了发酵罐繁殖菌丝的时间，增加了抗生素合成时间。1 种子罐级数因抗生素品种不同，可分为一级种子、二级种子、三级种子。a一级种子（二级发酵）：将孢子或摇瓶种子接种到体积较小的种子罐中，培养繁殖成为大量菌丝体，然后接种到发酵罐发酵。这样的种子称为一级种子，利用一级种子进行发酵的过程称为二级发酵。如：青霉素、四环素、头孢菌素b二级种子（三级发酵）将制备的一级种子接入体积较大的种子罐，培养繁殖更多的菌丝，然后转入发酵罐发酵。如：红霉素、卡那霉素、庆大霉素c.三级种子（司级发酵）如：链霉素根据菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度，以及所采用发酵罐的容积而定。生长快

10、的细菌，种子用量比例少，种子罐相应也少，生长慢的菌种种子罐级数要多。种子罐的级数越少，越有利于简化工艺，并可减少染菌机会。改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。接种龄是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。接种龄以菌丝体处于生命力极为旺盛的对数生长期，且培养液中菌体量还未达到最高峰时，较为合适。过于年轻的种子会出现前期生长缓慢、发酵周期延长、产物开始形成的时间推迟，甚至会因菌丝量过少而在发酵罐内结球，造成异常发酵。过老的种子会引起生产能力下降而菌丝过早自溶。嗜碱性芽孢杆菌产生碱性蛋白酶的接种龄试验情况，以12h为接种龄所得的酶活

11、力最高。接种量 接种量是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。大多数抗生素最适接种量为7%15%，有时可增加到20%25%接种量的大小取决于菌种在发酵罐中生长繁殖的速度。采用较大的接种量可以缩短菌丝繁殖时间，使抗生素的形成提前到来。但是，如果接种量过多，往往使菌丝生长过快，培养液黏度增加，造成溶解氧不足，影响产物的合成。如：嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶1%接种量产酶活力最高，在0.5%4%接种量之间虽有差别，但影响不大，一旦超过4%则产量明显下降。(三)、影响种子质量的因素及其控制种子质量主要受孢子质量、培养基、培养条件、种龄和接种量等因素的影响。a营养成分丰富培养基营养成分应适合种子培

12、养的需要，易于被菌体吸收和利用氮源和维生素含量较高，可使菌丝粗壮并具有较强的活力。要尽可能地和发酵培养基接近，入罐后容易适应发酵罐的培养条件。发酵培养基一般比较浓，而种子培养基以略稀薄为宜。pH值的变化会引起各种酶活力的改变，对菌丝形态和代谢途径影响很大。2培养条件种子培养应选择最适温度。培养过程中通气搅拌的控制很重要，各个不同时期的需氧量不同，一般前期需氧量较少。后期需氧量较多。在青霉素生产的种子制备过程中，充足的通气量可以提高种子质量。例如，将通气充足和通气不足两种情况下得到的种子都接入发酵罐内，它们的发酵单位可相差1倍。通气搅拌不足可引起菌丝结团、菌丝粘壁等异常现象。生产过程中，有时种子

13、培养会产生大量泡沫而影响正常的通气搅拌，此时应严格控制，甚至可考虑改变培养基配方，以减少发泡。在种子罐培养一定时间后，补入一定量的种子培养基，结果种子质量有所提高，菌丝团明显减少，菌丝粗壮，发酵单位增高。在生产过程中，种子质量受各种各样因素的影响，种子异常的情况时有发生，会给发酵带来很大的困难。种子异常往往表现为菌种生长发育缓慢或过快、菌丝结团、菌丝粘壁三个方面。a菌种生长发育过快或过慢菌种在种子罐生长发育缓慢或过快和孢子质量以及种子罐的培养条件有关。生产中，通入种子罐的无菌空气的温度较低或者培养基的灭菌质量较差是种子生长、代谢缓慢的主要原因。生产中，培养基灭菌后需取样测定其pH值，以判断培养

14、基的灭菌质量。b菌丝结团在液体培养条件下，繁殖的菌丝并不分散舒展而聚成团状称为菌丝团。这时从培养液的外观就能看见白色的小颗粒，菌丝聚集成团会影响菌的呼吸和对营养物质的吸收。如果种子液中的菌丝团较少，进入发酵罐后，在良好的条件下，可以逐渐消失，不会对发酵产生显著影响。如果菌丝团较多，种子液移入发酵罐后往往形成更多的菌丝团，影响发酵的正常进行。菌丝结团与搅拌效果差、接种量小有关，一个菌丝团可由一个孢子生长发育而来，也可由多个菌丝体聚集一起逐渐形成。c菌丝粘壁菌丝粘壁是指在种子培养过程中，由于搅拌效果不好，泡沫过多以及种子罐装料系数过小等原因，使菌丝逐步粘在罐壁上。其结果使培养液中菌丝浓度减少，最后

15、就可能形成菌丝团。以真菌为产生菌的种子培养过程中，发生菌丝粘壁的机会较多。四、 发酵过程的控制（一） 温度变化及其控制1、温度对发酵的影响温度影响微生物的生长发育和代谢活动。因为一切代谢活动都依赖于酶。而酶的活力只有在最适才能发挥。温度低于最适范围，菌体生长缓慢；高于最适范围，酶易过热失活，使菌体自溶，发酵周期缩短，影响抗生素产量。发酵最适温度低于最适生长温度几度。如：产黄青霉菌最适温度为27-28OC,分泌青霉素的最适温度为26 OC小单胞菌34-36 OC,分泌庆大霉素32-34 OC温度不仅影响菌体生长与合成速度，甚至影响合成方向例如， 35 OC 四环素2、发酵最适温度的选择 所谓最适

16、温度是指最适于产生菌生长或合成抗生素的温度。注意：a.抗生素在发酵周期内一般不能只选择一个最适温度。“马克思主义矛盾论”例如，青霉素产生菌生长最适温度为30，但产生青霉素的最适合成温度是。在生长初期，抗生素还未开始合成，以促进菌丝体生长繁殖为目的，应该选择最适生长温度；当菌丝浓度达到一定程度，到了抗生素分泌时，生物合成成为主要方面，就应该满足生物合成的最适宜温度。如：发酵前期保持在28，40h之后改为27，放罐前24h，在增加到28，链霉素产量明显增加。如：通气条件较差，一般温度较低为宜。因为温度较低可以相应增加氧的溶解度，菌丝生长速度也可减慢，从而弥补发酵供氧不足。 (二) PH的影响及控制

17、 酶活力 PH抗生素产生菌的最适PH一般在5-8，但是不同菌种的PH也不一样。了解了菌种的PH范围，就要进一步调节，方法如下：1. 根据菌种特性和培养基性质，选择适当的培养基成分和配比，有些成分可以中间补料时补充调节.如：青霉素发酵中，根据青霉素产生菌的代谢需要，用改变加糖率来控制PH比固定加糖率通过加酸、碱调节PH可以提高产量25%2.加入适当的缓冲剂，以控制培养基PH的变化。常用的缓冲剂是碳酸钙和磷酸钙。其中碳酸钙便宜，方便、效果好。主要作用是中和各种酸，防止PH急剧下降。3.在发酵过程中出现PH过高和过低时，可以直接用酸碱调节。（三） 通气与搅拌1、通气搅拌对抗生素发酵的影响一般情况下，

18、产生菌在发酵过程中的需氧量为20-25毫克分子/升.小时，氧在发酵液中的溶解度为1个大气压下0.2毫克分子/升，随溶质浓度升高溶解度度还会下降，如果不及时通氧，微生物只能维持正常呼吸15-30秒，然后呼吸就收到了抑制，远远不能满足发酵菌的需要。因此需要通入无菌空气，并且通过搅拌与培养既充分混合，增加通气效果。发酵产生菌对氧的需求量取决于下列两个因素：单位体积培养液中菌的浓度和军的呼吸强度（单位重量菌丝体在单位时间内的好氧量Qo2 ）幼龄菌呼吸强度最大，随菌龄增长稍微下降，然后急剧下降。发酵前期：早期菌量少，需氧量不大，进入对数生长期，菌丝浓度急剧增加，呼吸极为旺盛。达到最高。发酵中期：细菌生长

19、稳定抗生素开始合成，呼吸强度减弱，为继续维持细胞活动和抗生素的合成，通气搅拌还须保持在一定水平。发酵后期：菌丝逐渐趋向自溶，可适当降低空气流量或降低搅拌转速。2、影响发酵过程中供养的因素不同品种的抗生素产生菌对氧的需求是不同的。链霉素 12h 45四环素 12h 37制霉菌素 73h 25灰黄霉素 24h 8新霉素 138h 16增加培养基成分的浓度，可是产生菌的摄氧率增加。如：链霉素大罐发酵70h后补糖，补前摄氧率34.3毫克分子/升.小时，补后78h为40.9毫克分子/升.小时。菌丝浓度大，需氧量就越高。接种量大，生长快，菌丝浓度高，需氧就多。年轻菌丝呼吸强度较高。使用动植物油脂作为消沫剂

20、有利于溶氧。有毒产物的积累，如CO2不及时排出对溶氧是不利的。搅拌改善通气的机理不利方面：耗能、影响某些微生物的菌丝形态，功率过高时甚至会造成细胞损伤。空气流速能影响通气效率，通气效率随空气量的增加而增加。随着空气流速的增大，大气泡造成发酵液更大的湍流，空气流速过大能使搅拌叶轮发生过载，即叶轮不能分散空气，此时气流形成大气泡在轴的周围溢出，因此当空气流速超过过载速度后，通气效率不再增加。军体本身的代谢和繁殖会影响到发酵液的物理性质，比如表面张力、黏度、离子浓度，而这些变化会影响到气体的溶解度显著影响通气效率。(四) 发酵过程中的代谢与控制发酵过程应及时掌握产生菌生长代谢、培养基的性质含量等状况

21、，所以必须进行发酵过程中的中间分析。1、中间分析项目分析项目：抗生素效价、Ph值、糖含量、氨基氮和氨氮、磷浓度、菌丝浓度、黏度。a抗生素效价单位一般采用化学测定法和生物测定法。（1）.化学测定法以抗生素化学结构为基础，通过一定的化学反应进行测定。优：简单迅速，可在较短的时间内得到结果。缺：准确度差，易受杂质和类似化合物的干扰。（2）.生物测定法以抗生素的抑菌和杀菌作用为基础。方法复杂，需要无菌操作，且有操作和生物误差。此法在中间测定一般不采用。大多用于放罐样品和出厂成品的检验。PH试纸、酸度计(1).总糖是指发酵液中各种糖的总量，它是分析及计算发酵过程中汤消耗的主要数据。方法：把含糖的发酵液用

22、酸水解，使多糖和双塘变成G,然后测定其还原糖的总含量。（2）.还原糖是发酵液中含有醛基的单糖，通常指G。因为葡萄糖能直接被微生物利用，参与发酵代谢及抗生素的合成，因此还原糖的变压可以直接反映产生菌的代谢状况。克/100ml氮源物质的变化也反映发酵菌的生长状况，生产商一般测定氨基氮（NH2-N）和氨氮(NH3-N).这两种形式都可以用甲醛法测定。毫克/100毫升 微克/毫升e磷含量微生物代谢活动对磷的要求很高。磷的供应以磷酸盐为主，以有机磷为辅。菌丝浓度，单位体积发酵液中的菌丝数量。粘度的测定可以用旋转式粘度计，单位为厘泊。发酵液的黏度由1厘泊到500厘泊不等。简单方法：用一根长直径的玻璃管，吸

23、取一定量的发酵液，用马表记录其留出速度2. 中间补料与代谢控制a.中间部料的意义与原则中间补料：在发酵过程中补充某些营养物料，以满足产生菌在培养过程中，特别是中期的生化代谢活动和合成抗生素的需要。原则：控制和引导抗生素产生菌在培养过程中，特别是中期的色花代谢活动，使其向着有利于抗生素合成和分泌的方向进行。 4.维持抗生素较高的增长幅度。b补料内容1. 补充C源和能源物质如：液化淀粉、糊精、饴糖（麦芽糖）、G2. 补充N源物质如：酵母粉、蛋白胨、玉米浆、尿素、硫酸铵、氯化铵、硝酸钠、硝酸钾、氨水3. 补充无机盐、微量元素、前体和促进剂如：磷酸盐、硫酸锌、硫酸锰、氯化钴、氯化钙、硫酸钠、促进剂4.

24、 补全料和补水c补料的控制补糖的控制0- 补糖时机的控制补糖时间对抗生素的产量有很大影响，过早补糖，刺激菌体生长，加速糖的利用，过迟补糖，菌体已经受到部分损害，补糖只能干扰代谢，不能提高产量。举例：四环素发酵补G62h 后补糖 产量 6000单位/毫升20h 6000 单位/毫升45h10000单位/毫升1- 补糖方式和补糖指标以还原糖作为指标，如四环素发酵还原糖0.8-1.5%以总糖作为指标，如土霉素发酵前期5-6%，中期4-5%，后期3-4%，放罐1-2%补糖方式：小量间隙多次补入、小量连续滴加补入、大量多次补入、大量少次补入。5. 通氨及补氮作用：调节PH和补充无机氮源，从而控制产生菌的

25、代谢活动方法：少量间隙添加或少量自动流加氨水：工业用20%氨水（快速）尿素（慢速）6. 补充无机元素和促进剂、前体（五）发酵过程中泡沫的产生和控制1、泡沫的产生及其对发酵的影响3.影响通气搅拌，引起异常发酵2、泡沫的性质泡沫是气体分散于液体中的一种胶体系统，气泡间被一层液膜隔开彼此不相联通。分散相是无菌空气和代谢气体，连续向是发酵液。泡沫类型：1.存在于发酵液的液面上，界面明显、容易破灭2.界面不明显、泡沫较稳定，不易破碎3、影响泡沫消长的因素前期接种后加大空气流量和全开搅拌，泡沫产量增加，甚至无法控制，前期空气流量不需要太大，应先开小流量，逐步加大，待菌丝达到一定程度在加大流量，然后开搅拌并

26、加消沫剂。天然原料浓度大的培养基，黏度大，产泡多而持久。如葡萄糖、黄豆饼粉、蛋白胨、玉米浆、花生饼粉、酵母粉合成培养基不易产生泡沫。c.与菌种、种子质量、菌丝阶段、接种量有关生长速度越快，泡沫越少。原因是菌丝大量繁殖，含氮物大量消耗利用，甚至可以提高罐温，促进菌丝生长繁殖、以便减少泡沫的干扰。4、泡沫的消除机械消沫主要靠机械引起的强烈振动或压力变化促使气泡破裂。罐内消沫，搅拌轴上方装消沫桨，效率不高罐外消沫，将泡沫引出罐外，通过喷嘴的加速作用或利用离心力消除泡沫优点：不加入外界物料，节省原料，减少染菌的机会。缺点：效果差、需要一定设备、消耗动力，不能从根本上消除因其泡沫稳定的因素。b.消沫剂消

27、沫（化学消沫）加入某些活性物质，降低泡沫的局部表面张力使泡沫破裂的方法。机理：1.当泡沫表层存在着表面活性物质而形成双电层时可以加入一种有相反电荷的表面活性剂，降低他的机械强度。2.具有较大的表面黏度时，可加入某些分子内聚力较小的物质，以降低液膜的表面黏度。优点：消沫效果好、作用迅速缺点：有的具有毒性，残留在发酵液中增加提炼的麻烦，有的影响溶解氧的传递，影响通气搅拌的效果，成本增加。（1） 天然油脂类玉米油、米糠油、鱼油、蛹油，豆油、棉籽油、菜籽油、猪油天然油脂消沫效率不高，用量很大。（2） 化学合成类消沫剂a.泡敌：聚氧丙烯甘油（GP型）聚氧乙烯氧丙烯甘油（GPE型）用量：0.02-0.03

28、5% 性能稳定、能耐受高温高压灭菌、操作简便、用量少、成本低，易掌握。b.十八醇：青霉素发酵使用c.聚乙二醇：适用于霉菌发酵d硅酮类：对微酸性抗生素发酵效果差，适用于碱性抗生素如链霉素、新霉素。任务三 青霉素发酵工艺及过程（一）、菌种 黄孢子丝状菌 丝状菌 绿孢子丝状菌产黄青霉菌球状菌 绿孢子球状菌 白孢子球状菌（三）、发酵工艺过程及要点1、种子丝状菌的生产菌种保藏在砂土管中。由砂土孢子接入拉氏培养基的目瓶斜面上，经25OC培养6-7天，长成绿色孢子，只成孢子悬浮液，接入装有大米的茄子瓶中，经25OC，相对湿度50-45%，培养6-7天，制成大米孢子，真空干燥。生产时按一定接种量移入种子罐内，

29、25OC培养40-45小时，菌丝浓度达40%以上，菌丝形态正常，即按10-15%的接种量移入繁殖罐内。经25OC培养13-15小时，菌丝体积40%以上，残糖1.0%.发酵罐接种量为30%球状菌的生产种子由冷冻管孢子经0.5-1.0%的玉米浆的原始亲米孢子，移入罗氏瓶25OC培养3-4天生产大米孢子（生产米）。将生产米接入含花生饼粉、玉米胚牙粉、G、饴糖为主的种子罐内，28OC培养50-60小时，当PH由6.5-6.0下降至5.5-5.0，菌丝呈菊花团状，每毫升球数为6-8只2 发酵培养基主要碳源为葡萄糖母液和工业用葡萄糖玉米浆、花生饼粉、麸质粉、玉米胚牙粉、尿素c前体苯乙酸、苯乙酰胺作为前体，

30、具有毒性，任何时候浓度不能大于0.1%d无机盐0- S和P 青霉素的液泡中含有S和P，青霉素的生物合成也需要硫。据报道，硫浓度降低时青霉素的产量减少三倍，磷浓度降低时青霉素的产量减少一倍。1- Ca Mg K 阳离子总浓度以300毫克当量/升钾 30% 钙 20% 镁41%铁离子 铁离子对细胞具有毒害作用 菌丝生长繁殖期：糖及含氮物质被迅速利用球状菌：菌丝发育为球状，菌体浓度迅速增加丝状菌：菌丝分支旺盛，菌丝浓度迅速增加 青霉素分泌期：菌丝生长趋势减弱，需添加G、花生饼粉、尿素。青霉素分泌旺盛 球：PH6.6-6.9 球体不可太松，也不可太紧 丝：PH6.2-6.4 脂肪粒消失，中小型空胞 菌

31、丝自溶期：菌体衰老走向自溶PH上升青霉素分泌下跌 球：球体破裂 丝：大型空胞增加并逐渐扩大自溶丝：残糖控制在0.6%左右，PH上升以后开始加糖。 加糖控制：0-72小时 0.6-0.8% 72小时放罐0.8-1.0% 加糖率每小时0.07-0.15% 每两小时加一次球：当Ph高于6.5，约20之后开始加糖，根据PH高低酌情。丝：接种后8-12小时，发酵液浓度40%左右开始补料 发酵单位上升至2500U/ml开始补前体，每4小时补一次 使苯乙酰胺浓度为0.05-0.08%球：因发酵基础培养基中没有前体，在10小时左右开始加入 尿素、氨水和苯醋酸的混合料，每3小时加一次主要通过加G控制PH青霉菌最

32、适生长温度高于最适分泌温度丝和球都是变温培养，且前期罐温高于后期丝 球种子罐温 25oc 28 oc酵罐温 26 oc -24 oc -23 oc -22 oc 26 oc -25 oc -24 oc通气比为1：1.1-0.8（V/V/M）丝： 种子罐转速发酵罐转速球： 种子罐转速发酵罐转速过去：天然油脂如豆油、玉米油现在：GPE PAGE任务四 青霉素提炼工艺一、提炼工艺流程二、提炼工艺要点青霉素不稳定，整个提炼过程应在低温干燥条件下进行。（一）发酵液的预处理发酵液放罐后，首先要冷却，因为青霉素在低温时比较稳定。由于菌丝较粗，一般较容易过滤，目前采用鼓式过滤机及板框过滤机过滤。为了加快滤速，

33、缩短工时，可利用发酵菌液的菌体作为板框压滤机中的助滤剂。作为助滤剂的发酵液一般不超过1/3。 由于发酵液中含有过剩的碳酸钙，在酸化时会有部分溶解，使钙例子呈游离状态，在酸化萃取时，遇到大量的硫酸根离子，会形成硫酸钙沉淀，故酸化PH应该控制的高一些，一般为4-5之间。（二）影响青霉素提取的因素1. PH 青霉素在酸性条件下极易水解破坏，生成青霉素酸，但是只有在酸性条件下才能转移，这是个矛盾。目前生产上采用上述PH，转移比较完全而且破坏比较少。 从有机相转移到水相时，选择上述PH也合适，如果碱性较强则易发生碱性水解，而且杂质也容易转移到水相中。要求提取在低温下进行（一般要求在10 oc以下）青霉素

34、在提取过程中停留时间越短越好，因此要求操作熟练设备良好，不发生故障。酸化提取时速度应快一些，使青霉素尽快的转移到醋酸丁酯中，碱化提取时速度可放慢些，因为青霉素在中性条件下半衰期要长一些，破坏情况要缓和一些。生产上一般采取二级逆流萃取方式。浓缩比的选择也很重要，一般选择滤液体积的25-30%如果丁酯用量太多，虽然萃取完全，收率高，但达不到结晶浓度要求，反而增加溶媒的耗用量。如果丁酯用量太少，则萃取不完全，影响收率。（三）结晶以青霉素钾盐为例水分应控制在0.9%以下。温度高时结晶速度快，晶体细小，温度低时结晶速度慢，晶体颗粒粗大。一般污染数在0.5%以下，结晶温度控制在10-15 oc污染数在0.5%以上，结晶温度控制在15-20 oc要求污染数在0.5%左右，污染数高反应速度降低，晶体大，收率低污染数低，反应速度快，结晶颗粒小。