微生物实验专题

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1、 .微生物实验专题一、探究酵母菌的呼吸方式【C】（一）、实验原理：1. 酵母菌是兼性厌氧型生物，无氧和有氧呼吸都产生CO2，无氧呼吸还能产生酒精。2. 检测产生CO2：可使用澄清石灰水；或溴麝香草酚蓝溶液（现象：蓝变绿变黄）。3检测酒精产生：用酸化的重铬酸钾。实验现象：溶液由橙色变为灰绿色。（二）、实验设计（及方法步骤）：设计如下图装置进行对照实验：1. 设计成有氧条件（甲组）与无氧条件（乙组）进行对照实验。2. NaOH溶液的作用是：除去空气中CO2，排除对实验干扰。3. 培养液要进行灭菌，灭菌后的培养液要冷却后才能接种酵母菌。4. 进行乙组实验时，必须让B瓶密封放置反应一段时间，才能将导管

2、连通到澄清石灰水瓶中。其目的是：消耗掉瓶内氧气，防止酵母菌进行有氧呼吸对实验结果的干扰。5. 实验中要观察甲、乙组澄清石灰水的变化，并检测A和B瓶中有无酒精产生。检测酒精时，要将重铬酸钾溶于浓硫酸溶液中进行酸化处理，再加入到被检测溶液中。（三）、实验结果（现象）及其分析：1. 甲、乙两组的澄清石灰水都变浑浊，甲组变浑浊快和程度大；说明酵母菌有氧和无氧条件下 都产生CO2，有氧条件下比无氧条件下产生的CO2多。注意：据该实验现象不能确定呼吸方式。2. 检测酒精时，若A瓶中无酒精产生（检测时不变灰绿），则说明A瓶酵母菌只进行有氧呼吸； 若B瓶中有酒精产生（检测时变灰绿）；则说明B瓶中酵母菌进行了无

3、氧呼吸。二、探究培养液中酵母菌种群数量的动态变化【C】（一）、实验原理： 1. 液体培养酵母菌时，种群的增长受培养液营养成分、空间（含氧量）、温度和pH等因素的影响。2. 在理想条件下，酵母菌种群的增长呈“J”型曲线；在各种资源有限或者存在环境阻力的情况下， 酵母菌种群增长呈“S”型曲线。酵母菌种群数量变化表现为：增长保持稳定衰减。3. 对酵母菌进行观察计数，需要用到血球计数板和显微镜。血球计数板构造如下图：正面 侧面计数室（2个）每个小格的面积盖玻片下液体高度（二）、实验设计（方法和步骤）： 1. 将10mL无菌的5%的葡萄糖溶液加入试管。2. 将酵母菌（干酵母）接种到试管培养液中，将试管在

4、 28条件下连续培养7天。3. 采用抽样检测法，每天取样测定酵母菌数目，每天抽测3次，取平均值。【取样计数的操作方法】（1）先将盖玻片盖在血球计数板计数室上，再用吸管吸取培养液滴于盖玻片边缘。特别提醒：吸取培养液前，要振荡几下试管，摇匀培养液（否则数据会偏差较大）。（2）让培养液自行渗入计数室内，用滤纸吸去多余的培养液。（3）待酵母菌全部沉降到计数室底部时，将计数板放在载物台中央进行观察计数。计数区域： 25（中）16（小）型计数室为四顶角和中央的5个中格。对于压在小方格界线上的酵母菌，应取两邻边及其顶角计数。（4）计算出1mL培养液中酵母菌，换算后记录在设计的表格中。1mL培养液中酵母菌数目

5、 4106 每小格酵母菌数 稀释倍数 =400（每小格的面积1/400mm2）每小格酵母菌数104 稀释倍数（三）、实验结果及其分析：将记录在表格中的数据转换成曲线图，分析实验结果并得出结论。特别提醒1：每天的计数时间要相同；培养至中后期时，要对培养液进行稀释后再计数。特别提醒2：若视野中有气泡，应重新制片计数。要对酵母菌进行染色后计数，否则数据偏大。特别提醒3：清洗血球计数板时，应采用浸泡和冲洗方法，不能刷洗和擦拭。三、固定化酵母细胞的制备与应用【B】1. 制备固定化细胞常用凝胶包埋法。制备固定化酵母细胞常用海藻酸钠凝胶包埋法。凝胶是多孔载体，调节凝胶溶液的浓度，可以改变凝胶的孔径大小。2.

6、 制备固定化酵母细胞的方法步骤：关键步骤：配制海藻酸钠溶液。（1）活化酵母细胞：目的：使酵母菌从休眠状态恢复到正常生活状态。 操作：将1克干酵母和10ml蒸馏水放在50ml烧杯中混合并搅拌均匀，放置1小时。 注意事项：容器要大一些，以防活化液溢出；混合后要进行搅拌。（2）配制0.05mol/L的CaCL2 溶液：操作：将0.83克无水CaCL2和150mL蒸馏水，放在200ml烧杯中使其充分溶解。 CaCL2溶液的作用：（起凝胶聚沉作用）促使凝胶珠的形成。（3）配制海藻酸钠溶液（最关键）： 操作：将0.7g海藻酸钠和10ml蒸馏水加入50ml小烧杯中，小火间断加热至完全溶化，加蒸馏水定容至10

7、ml。注意事项：应采用小火间断加热，以防焦糊；海藻酸钠浓度不宜过高过低。海藻酸钠溶液浓度过高时：难以形成凝胶珠或凝胶珠形态异常。海藻酸钠浓度过低时：凝胶珠中包埋的细胞数量少，凝胶珠色浅呈白色。（4）海藻酸钠溶液与酵母细胞混合：应将海藻酸钠溶液冷却至室温后，再加入已活化的酵母细胞；并充分搅拌均匀。（5）固定化酵母细胞：操作：用注射器吸取混合液，以恒定的速度缓慢地滴加到CaCL2溶液中，并不断搅拌（磁力搅拌器搅拌），将凝胶珠在CaCL2溶液中浸泡30分钟。注意事项：注射器距液面距离不能太近、凝胶珠浸泡时间不能过短。注射器距液面距离过近时：凝胶珠会出现拖尾现象。凝胶珠浸泡时间过短时：凝胶珠不能形成稳

8、定结构，容易裂开。（6）冲洗：取出凝胶珠后，要用蒸馏水冲洗23次。冲洗的目的：洗去凝胶珠表面的氯化钙溶液和杂菌。（7）发酵实验：将10%的葡萄糖溶液150ml加入200ml的锥形瓶中，加入固定化酵母细胞在25下发酵24h。观察气泡产生（CO2）和闻酒味，并用重铬酸钾检测酒精。3. 实验结果分析：酵母细胞凝胶珠质量检测。（1）合格凝胶珠的标准：乳白色，圆形或椭圆形。摔打容易弹起。挤压不易破裂、无液体流出。（2）凝胶珠异常的原因： 色浅呈白色：海藻酸钠溶液浓度偏低，此种凝胶珠中包埋的酵母细胞数量少。 不呈圆形或椭圆形：海藻酸钠溶液浓度偏高。此种凝胶珠为制作失败，不能使用；需要重新制作。 拖尾现象：

9、混合液浓度低，或注射器距氯化钙溶液液面距离太近。凝胶珠漂浮：混合溶液中含气泡。 凝胶珠容易裂开：凝胶珠在氯化钙溶液中浸泡时间过短。四、腐乳的制作【A】1. 制作腐乳的原理： 利用毛霉等微生物分泌的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶将豆腐中的蛋白质、脂肪和淀粉分解为多种氨基酸、有机酸等；使腐乳鲜香可口，易消化吸收。（1）在腐乳制作中，多种微生物参与了豆腐的发酵，但起主要作用的是毛霉。毛霉是丝状真菌，其代谢类型属于异养需氧型；适宜生长温度：1518。 毛霉孢子分布广泛，空气中含有大量毛霉孢子。（2）家庭和实验制作腐乳时，将豆腐坯暴露在空气中接种毛霉孢子。（3）工业生产腐乳时，在严格无菌条件下接种优良毛霉菌种孢

10、子。腐乳品质好。工业上生产腐乳步骤：接种孢子。培养和晾花。压坯与装坛“晾花”的目的：增强酶的作用，散失霉味。 （4）醉方（添加黄酒制成）、红方（添加红曲制成）、青方（不加调料制成）。2. 腐乳制作的基本流程：见下图：让豆腐上长出毛霉 直接接种或利用空气中毛霉孢子，1518培养。 加盐腌制 逐层加盐，随层数增高而增加盐量；近瓶口处铺厚些。 加卤汤装瓶 卤汤由酒和香辛料配成。 密封腌制 用酒精灯对瓶口灭菌后密封。（1）让豆腐上长出毛霉：将豆腐切成小块（4cm4cm1.5cm），用沸水消毒后微微晾干，制成腐乳坯。在晾干过程中空气中毛霉孢子落到腐乳坯上，完成接种过程。所用豆腐含水量应控制在70%左右，

11、含水过多腐乳不成形。将腐乳坯竖立放在清洁容器内彼此间隔1cm，将温度控制在1518，并保持一定湿度让毛霉生长；当菌丝变成淡黄色，有大量灰褐色孢子形成时停止发酵。若某些豆腐上长出青霉，应剔除这种豆腐或重新制作。（2）加盐腌制：将长满毛霉的豆腐块用食盐水清洗后整齐地摆放在瓶中，用食盐腌制10天。加盐方法：逐层加盐，加盐量逐层递增，接近瓶口的表面盐要铺厚一些。盐量：腐乳坯量= 5 ：1。加盐过多会影响继续发酵，过少豆腐会腐败变质。【加盐目的】析出豆腐中水分，使豆腐变硬，防止过早酥烂。 抑制微生物生长，防止豆腐腐败变质。 调节口味。（3）配制卤汤：用食盐、水和料酒及各种香辛料等进行配制。卤汤中酒含量控

12、制在12%左右。酒的作用：抑制微生物的生长，并使腐乳具有独特酒香味。 酒用量过多会抑制蛋白酶活性和影响腐乳风味；酒用量过少豆腐会腐败。 香辛料的作用：调味、防腐杀菌。（4）加卤汤装瓶，密封腌制：将配制好的卤汤加入瓶中，将瓶口通过酒精灯火焰，再用胶带密封瓶口，密封腌制6个月。 装瓶时要迅速，瓶口要通过酒精灯的火焰，再密封。2. 腐乳品质鉴定及有关提醒：（1）评价腐乳品质：应从形状、色、香、味、质地等方面进行评价。（2）影响腐乳品质的因素：盐、酒、香辛料和发酵温度。 前期发酵温度为：1518；后期发酵温度（腌制时）为常温或30。 在腌制过程中，毛霉等微生物（酶的作用）仍可继续发酵一段时间。（3）腐

13、乳外表的皮是附着在豆腐上的毛霉菌丝形成的，可使腐乳成形。（4）用于腌制的玻璃瓶洗刷干净后要用沸水消毒，装瓶、密封等环节要无菌操作。五、果酒和果醋的制作【B】（一）果酒制作：果酒中酒精含量应控制在10%20%。1. 果酒制作方法步骤（及注意事项）： （1）对发酵瓶、纱布、榨汁机等进行清洗和消毒：发酵瓶要用温水反复清洗后，再用75%酒精擦拭消毒，晾干。 （2）取葡萄500克，先冲洗干净，再去除枝梗和腐烂籽粒，再次冲洗。冲洗目的：去除葡萄表面污物杂物。不能先去枝梗再冲洗。 不能反复冲洗，否则会冲洗掉附着在葡萄表面的野生型酵母菌。 （3）用榨汁机榨取葡萄汁，之后将葡萄汁装入发酵瓶中，并盖好瓶盖：【注意

14、】果汁不能装满（装入量不超过发酵瓶总体积的2/3）。目的是：让酵母菌有氧呼吸大量繁殖，保证发酵时有较大起始数量。 防止发酵时发酵液溢出。（4）将发酵瓶放置在1825条件下发酵1012天：（5）每天定期排气12次（排CO2），以防瓶爆裂。 为了防止发酵瓶爆裂，最好选用塑料瓶。 排气时要防止杂菌污染，常拧松瓶盖排气，不能打开瓶盖。 右图发酵装置中排气管设计成长而弯曲状，既能排气，又能防止杂菌污染。 （6）取样检测酒精（10天后）：用酸化重铬酸钾检测；也可闻酒味、镜检酵母菌。【检测方法】取两支试管编号1、2，分别装入2mL酒精、2mL发酵液。向两试管中分别滴加3滴3mol/L的硫酸溶液，并振荡混匀。

15、再向两试管中各加入饱和重铬酸钾溶液3滴，振荡后观察溶液颜色变化。2.制作果酒和果醋中防止杂菌污染的措施：（1）对用具清洗并用酒精消毒。 （2）葡萄先清洗后除枝梗。（3）排气管设计为长而弯曲状。 （4）无菌操作。（二）果醋制作： 1. 利用葡萄汁等果汁制作果醋：（1）要向果汁中接种醋酸菌，并置于3035条件下进行有氧发酵。酶（2）发酵时需要不断通入无菌空气，同时也需要定期排气（排CO2）。（3）反应式：C6H12O6 2O2 2 CH3 COOH 2CO22 H2O能量2. 利用果酒制作果醋的方法步骤：（1）将醋酸菌（醋曲或醋酸菌膜）接种到制作好的果酒中，并通入无菌空气。（2）将发酵装置放在30

16、35环境中，不断通入无菌空气进行有氧发酵78天。（3）检测果醋是否制作成功，并对发酵液（果醋）进行过滤、灭菌：【检测方法】pH测定、观察醋酸菌膜形成、闻酸味、品尝、镜检等。【提醒】变酸的果酒表面白色菌膜是由醋酸菌形成的。酶 泡菜坛内表面白色菌膜是由酵母菌形成的。（4）果酒制果醋反应式： C2H5OH O2 CH3 COOH H2O 能量（三）果酒制作与果醋制作的比较： 果酒制作果醋制作发酵菌种酵母菌醋酸菌最适发酵温度18253035对氧气需求前期需氧，后期不需氧一直需要氧pH4.05.85.46.3发酵时间1012天78天方法与流程挑选葡萄冲洗榨汁酒精发酵（果酒）醋酸发酵（果醋）六、微生物的分

17、离和培养【B】（一）分离纯化大肠杆菌：1. 配制牛肉膏蛋白胨培养基：包括：计算称量溶化（含调pH）灭菌倒平板。2. 分离纯化大肠杆菌的接种方法：划线平板法和稀释涂布平板法。3. 接种后的培养基的培养：置于恒温箱中37培养12d。4. 挑取大肠杆菌菌落多次进行接种培养可以纯化大肠杆菌菌种。5. 菌种保存方法：临时保藏（4保存）和长期保存（甘油管藏：20保存）.（二）土壤中分解尿素的微生物的分离与计数：1.筛选原理及方法：（1）原理：尿素分解菌能合成脲酶，能利用脲酶分解尿素，因此可以尿素为氮源。（2）筛选方法：用以尿素为唯一氮源的培养基培养土壤微生物进行筛选。2. 实验方法步骤：本实验采用稀释涂布

18、平板法和活菌计数法。（1）土壤取样：从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。【注意】取土样用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都要灭菌。（2）制备培养基：按下列配方制备以尿素为唯一氮源的培养基。KH2PO4Na2HPO4MgSO47H2O葡萄糖尿素琼脂pH调至7.07.2，加蒸馏水定容至1000ml1.4g2.1g0.2g10.0g1.0g15.0g需要设置无尿素培养基作空白对照，即：表中尿素用等量的无菌水替换。（3）土壤样品稀释：制备不同稀释度的土壤悬液。方法如下： 称取0.5g土壤，倒入盛有50mL无菌水的锥形瓶，振荡20min，充分打散土壤，制

19、成102g/mL的土壤悬液。用无菌移液管吸取0.5mL（102g/mL）的土壤悬液注入盛有4.5mL无菌水的1号试管，配制成103g/mL的土壤悬液。取另一支无菌移液管吹吸1号管3次，使悬液均匀，再吸取0.5mL注入盛有4.5mL无菌水的2号试管，配制成104g/mL的土壤悬液.。依此类推，配制105、106、107、108g/mL的等浓度的土壤悬液。 每次吸取土壤悬液前都要用移液管吹吸悬液3次的目的：使土壤悬液均匀。 分离不同的微生物采用不同稀释度（因不同微生物在土壤中含量不同）。见下表：细菌放线菌霉菌稀释度104、105、106103、104、105102、103、104目的保证获得菌落数

20、在30300之间、适于计数的平板【提醒】人教版是配制10mL不同浓度的土壤悬液，其方法与上述方法相同。（4）接种：采用（稀释）涂布平板法。具体操作如下： 从最低浓度（108g/mL）土壤溶液开始，分别用无菌移液管吸取1mL（人教版为0.1mL）加入到相应编号的培养基中，每个浓度设置至少3个重复（三个平板），再用涂布器（玻璃刮铲）涂布均匀。 每次吸取土壤悬液前都要将土壤悬液充分振荡，混合均匀；每一步都应做到无菌操作。操作时，移液管和试管口应在离火焰12cm处。实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。（5）培养与观察：将已标明培养基种类、培养日期和样品稀释度的培养皿，

21、倒置放在37的恒温箱培养12d，观察细菌菌落。（6）计数菌落：每隔24h统计菌落一次，选取菌落数目稳定时的数据作结果，以防止培养时间不足而遗漏某些菌落。计算时应选择菌落数为30300的平板上进行计数，要计算平均数。每克样品菌落数（用液1mL）某一稀释度重复培养菌落平均数稀释倍数。统计的菌落数比活菌的实际数目少。原因是：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是1个菌落。4. 结果分析与评价： 同一土样的重复组统计的结果应相近。（1）若未接种的培养基中没有菌落，说明培养基未被杂菌污染，反之，则被污染。（2）若空白对照组培养基上有菌落生长，原因可能是被固氮微生物污染或培养基中混入了其他氮源。（

22、3）若实验中得到2个或2个以上菌落数在30300的平板，表明稀释操作成功，可以进行计数统计。（4）若同一稀释度的3个重复的菌落数相差悬殊，表明试验不精确，需要重新实验。【知识拓展】1土壤中微生物数目的统计方法：包括：直接计数法和间接计数法（活菌计数法）。（1）直接计数法：用血球计数板制片后在显微镜下观察计数。 取样计数方法与培养液中酵母菌计数方法类似。 土壤微生物的稀释要求：以达到每小格内有510个菌体为宜。经稀释的土壤样品应重复计数3次，取其平均值。 1mL土壤悬液中菌体总数 = 4106每小格中的菌体数土壤悬液稀释倍数。（2）间接计数法（活菌计数法）采用稀释涂布平板法，统计菌落数进行计数。

23、要设置对照和重复，每个稀释度土壤悬液至少设置3个重复。选择菌落数为30300的平板上进行计数，并计算平均数。每克土壤样品中菌落数菌落数 稀释倍数 涂布体积。2. 鉴定能分解尿素的微生物的方法：脲酶检测法。（1）原理：尿素经脲酶分解后形成氨，使pH升高，会使酚红指示剂变红。（2）方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红，若酚红指示剂变红，则说明该微生物能分解尿素。（三）分离土壤中能分解纤维素的微生物： 1.基础知识和原理：（1）能分解纤维素的微生物都能分泌纤维素酶，该类微生物能以纤维素为唯一碳源。（2）纤维素酶：是一种复合酶，包括：C1酶（外切酶）、CX酶（内切酶）和葡萄糖苷酶。纤维素纤维二糖

24、葡萄糖C1酶、CX酶葡萄糖苷酶（3）刚果红：能与纤维素形成红色复合物，不能与纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。 在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，能分解纤维素的微生物形成的菌落周围由于纤维素被分解，因此不呈红色，而是形成透明圈。2.操作步骤：（1）土壤取样：应从富含纤维素的环境中进行土壤取样。如：树林中多年落叶形成的腐殖土等。若找不到合适的环境，可将滤纸埋在土壤中（深10cm）再取样。（2）选择培养：目的：增加纤维素分解菌的浓度（即：浓缩所需要微生物）。 按下表配方制备液体选择培养基：纤维素粉5gNa2HPO47H2O1.2g溶解后加蒸馏水定容至1000mLNaNO31gKH2PO40.9gKC

25、L0.5g酵母膏0.5gMgSO47H2O0.5g水解酪素0.5g【提醒】该培养基为液体培养基，属于选择培养基。 原因是：该培养基中虽然含有其他碳源（酵母膏），但含量很少，培养基中的主要碳源还是 纤维素；在此种培养基中只有能分解纤维素的微生物才能大量繁殖。 水解酪素：提供氮源和生长因子。设计对照组培养基时，用葡萄糖代替该配方中纤维素粉。【操作】称取20g土样加入装有30mL选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下（30），振荡培养12天，直至培养液变浑浊。（3）梯度稀释：将选择培养后的培养基进行等梯度稀释101107倍。（4）将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上： 制备鉴别培

26、养基：按下表配方制备鉴别培养基。CMCNa（水溶性羧甲基纤维素钠）酵母膏KH2PO4土豆汁琼脂溶解后加蒸馏水定容至1000ml510g1g0.25g100mL15g 涂布平板：将稀释度为104106的菌悬液各取0.1ml涂布到平板培养基上，30倒置培养。（5）刚果红染色法：目的：挑选产生透明圈的菌落（筛选出纤维素分解菌）。 方法一：先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应。 方法二：在倒平板时就加入刚果红。 方法一中要使用NaCl溶液，其作用是：漂洗作用。即：洗去与纤维素结合不牢的刚果红，使透明圈更清晰。 透明圈越大的菌落，产纤维素酶能力越强，分解纤维素的能力越强。两种染色鉴定方法的优缺点比较：染色法优点缺点方法一 颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用操作繁琐，刚果红会使菌落之间发生混杂。方法二操作简便，不存在菌落混杂问题产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。（6）纯化培养：在产生明显透明圈的菌落中，挑取并接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在3037培养，可获得纯化培养。3. 确定纤维素分解菌：进行发酵产纤维素酶实验： （1）纤维素酶的发酵方法：包括：液体发酵和固体发酵。（2）纤维素酶测定方法：对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的葡萄糖含量测定。.DOC资料.