基因工程基本原理及操作程序

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1、基基 因因 工工 程程选修选修3 专题一专题一基因工程的概念基因工程的概念苏云金杆菌苏云金杆菌毒蛋白基因毒蛋白基因毒蛋白毒蛋白杀死害虫杀死害虫棉花细胞棉花细胞抗虫棉的培育抗虫棉的培育基因工程的概念基因工程的概念DNADNA片段的连接工具（片段的连接工具（“分子缝合针分子缝合针”） DNADNA连接酶连接酶基因转移工具（基因转移工具（“分子运输车分子运输车”） 运载体运载体一、一、DNADNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具准确切割准确切割DNADNA的工具（的工具（“分子手术刀分子手术刀”） 限制酶限制酶 特点：一种限制酶只能识别特点：一种限制酶只能识别DNA的一种核苷酸的一种核苷酸序列，

2、并在特定的位点切割序列，并在特定的位点切割DNA.1、限制酶、限制酶限制性内切酶限制限制酶酶限制酶切割的是么？限制酶切割的是么？DNADNA分子分子 切割切割DNADNA分子两个脱分子两个脱氧核苷酸之间的氧核苷酸之间的磷酸磷酸二酯键二酯键。切割切割DNADNA分子后形成什么？分子后形成什么？ 将双链将双链DNADNA分子片段分子片段“缝合缝合”起来，恢复两起来，恢复两个脱氧核苷酸之间的个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键。DNA连接酶连接的是什么？连接酶连接的是什么？2、DNA连接酶连接酶基因的针线：基因的针线：DNADNA连接酶连接酶G A A T T CC T T A A GG A A

3、T T CC T T A A GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C G剪刀：用同种限制剪刀：用同种限制酶切割酶切割DNA连接酶的种类连接酶的种类T T4 4DNADNA连接酶：连接酶： 连接连接黏性末端黏性末端和和平末平末端端DNADNA连接酶：连接酶：黏性末端黏性末端3 3、运载体、运载体 常用的运载体：常用的运载体： 质粒、噬菌体和质粒、噬菌体和动植物病毒等动植物病毒等标记基因，便于标记基因，便于进行检测。进行检测。 质粒存在于质粒存在于许多细菌和酵母许多细菌和酵母菌等生物中菌等生物中, ,

4、是拟是拟核或细胞核外能核或细胞核外能够自主复制的很够自主复制的很小的环状小的环状DNADNA分子分子. .特点特点： 1. 1.结构简单，能够在宿主细胞中结构简单，能够在宿主细胞中复制复制并稳定地保存并稳定地保存。 2.2.具具多种限制酶的单一切点多种限制酶的单一切点，以便与外源基因连接。，以便与外源基因连接。 3.3.具有某些具有某些标记基因标记基因，便于进行，便于进行筛选筛选。 4.4.对宿主细胞没有伤害。对宿主细胞没有伤害。作用作用：将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞常用运载体常用运载体：质粒质粒 动植物病毒动植物病毒 噬菌体噬菌体基因工程基本操作的四个步骤基因工程基本操作的四

5、个步骤1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将表达载体导入受体细胞、将表达载体导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取一、目的基因的获取1 1、目的基因主要是、目的基因主要是 编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因2 2、获取目的基因的常用方法、获取目的基因的常用方法? ?从基因文库中获取从基因文库中获取利用利用PCRPCR技术扩增技术扩增人工合成人工合成从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因基因文库基因文库 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNADNA片断，导片断，导入到

6、受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。生物的不同基因，称为基因文库。基因组文库基因组文库部分基因文库（如部分基因文库（如:cDNA:cDNA文库）文库）基因组文库基因组文库 通过对受体菌通过对受体菌群体的培养而储群体的培养而储存一种生物的全存一种生物的全部基因。部基因。cDNAcDNA文库的构建文库的构建提取生物某发育时期提取生物某发育时期mRNAmRNA单链单链DNADNA逆转录酶逆转录酶双链的双链的cDNAcDNA ( (只含该生物的部分基因只含该生物的部分基因) )与载体连接导入受体菌群储存起来与载体连接导入受体菌群

7、储存起来基因组文库和部分基因组文库基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库文库)比较比较真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区RNARNA聚合酶聚合酶的结合位点的结合位点内含子内含子 外显子外显子 能转录翻译成蛋白质能转录翻译成蛋白质 不能转录翻译成蛋白质不能转录翻译成蛋白质启动子启动子终止子终止子内含子：内含子： 外显子：外显子： 基因组文库和基因组文库和 cDNAcDNA文库的比较文库的比较利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因人工合成法：人工合成法： 基因较小，核苷酸序列已知，可以利用基因较小，核苷酸序列已知，可以利用DNADNA合

8、合成仪人工合成。成仪人工合成。目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。达和发挥作用。质质 粒粒 目的基因目的基因 启动子启动子 终止子终止子二、基因二、基因表达载体表达载体的构建的构建 启动子：启动子：位于基因的首端的一位于基因的首端的一段特殊的段特殊的DNADNA片断，它是片断，它是RNARNA聚聚合酶识别和结合的部位，有了合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出它才能驱动基因转录出mRNAmRNA，最终获得蛋白质最终获得蛋白质终止子：终止子：位于基因的

9、尾端的一位于基因的尾端的一段特殊的段特殊的DNADNA片断，能终止片断，能终止mRNAmRNA的转录的转录标记基因标记基因：为了鉴别受体细胞为了鉴别受体细胞中是否导入了目的基因，从而中是否导入了目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来将有目的基因的细胞筛选出来用一定的用一定的_切割切割质粒，使其出现一个切口，质粒，使其出现一个切口，露出露出_。用用_切断目切断目的基因，使其产生的基因，使其产生_将切下的目的基因片段将切下的目的基因片段插入质粒的插入质粒的_处，再加处，再加入适量入适量_，形成了，形成了一个重组一个重组DNADNA分子（重组质分子（重组质粒）。粒）。限制酶限制酶黏性末端黏性末端同

10、一种限制酶同一种限制酶相同的黏性末端相同的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶 用同种限制酶分别切割目的基因和质粒，使之露出用同种限制酶分别切割目的基因和质粒，使之露出相同的粘性末端，再加入相同的粘性末端，再加入DNA连接酶。连接酶。三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞转转 化化 方法方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法目的基因进入受体细胞内，并在受体细目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞

11、内维持稳定和表达的过程。胞内维持稳定和表达的过程。Ca 处理细胞处理细胞 2+农杆菌转化法农杆菌转化法农杆菌特点：易感染农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶，对大多数单子叶植物没有感染能力。植物没有感染能力。原理：原理：TiTi质粒上的质粒上的T TDNADNA可以转移到受体细胞，并整合到受体可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的细胞染色体的DNADNA上。上。基因枪法：基因枪法： 单子叶植物单子叶植物花粉管通道法：花粉管通道法： 抗虫棉抗虫棉 目的基因表达载体提纯目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）取卵（受精卵） 显微注射显微注射 转基因受精卵转基

12、因受精卵 转基因动物转基因动物显微注射法显微注射法显微注射法显微注射法 用用CaCa2+2+处理细胞处理细胞 感受态细胞感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合表达载体与感受态细胞混合 感受感受态细胞吸收态细胞吸收DNADNA分子分子将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞大肠杆菌大肠杆菌四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定分子水分子水平检测平检测个体水个体水平鉴定平鉴定检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNADNA上是否上是否 插入了目的基因插入了目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译

13、成蛋白质方法方法 DNADNA分子杂交分子杂交方法方法 抗原抗原- -抗体杂交抗体杂交抗虫鉴定、抗病鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定等方法方法 DNADNA分子杂交分子杂交 基因探针基因探针：是一小段单链的：是一小段单链的DNADNA或或RNARNA，带有，带有放射性同位素标记，并能与目的基因的的一条链发放射性同位素标记，并能与目的基因的的一条链发生碱基互补配对。生碱基互补配对。 检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了 mRNAmRNA方法方法DNA与与mRNA杂交杂交检测目的基因是否翻译出了蛋白质检测目的基因是否翻译出了蛋白质方法方法抗原抗原抗体杂交抗体杂交检测转基因生物染色体的检测转基因

14、生物染色体的DNA 上是否插上是否插入了目的基因入了目的基因 DNA与与DNA杂交杂交 检测抗虫棉是否翻译出毒蛋白：从苏云金杆菌中检测抗虫棉是否翻译出毒蛋白：从苏云金杆菌中提取毒蛋白，注入某种动物体内，从动物的血清中分提取毒蛋白，注入某种动物体内，从动物的血清中分离相应抗体，并用荧光标记该抗体。然后用标记的抗离相应抗体，并用荧光标记该抗体。然后用标记的抗体与抗虫棉的细胞提取液混合，若出现杂交带，则表体与抗虫棉的细胞提取液混合，若出现杂交带，则表明抗虫基因已在棉花细胞被表达。明抗虫基因已在棉花细胞被表达。基因工程的基本操作程序1.1.获取目的基因获取目的基因u从基因文库中获取从基因文库中获取u利用利用PCRPCR技术扩增技术扩增u化学方法人工合成化学方法人工合成2.2.构建基因表达载体构建基因表达载体u目的基因、质粒、启动子、终止子目的基因、质粒、启动子、终止子3.3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞u农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射法、法、 Ca2+处理法处理法4.4.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定u分子水平检测：是否插入、转录、翻译分子水平检测：是否插入、转录、翻译u个体水平鉴定：个体水平鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定等