分子生物学实验操作方法与技巧（3）课件

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1、分子生物学实验操作方法与技巧（3）分子生物学与生物化学实验分子生物学与生物化学实验操作、设计与技能操作、设计与技能DNADNA和和RNARNA提取方法提取方法; ;酶切与连接。酶切与连接。 李刚 副教授分子生物学实验操作方法与技巧（3）二、DNA和RNA提取方法 细菌DNA的常规制备方法； 细菌DNA PCR模板的快速制备方法； 细菌基因组DNA提取试剂盒的选择； 酵母DNA的常规制备方法； 酵母DNA PCR模板的快速制备方法； 细菌基因组DNA提取试剂盒的选择；分子生物学实验操作方法与技巧（3）二、DNA和RNA提取方法 植物、真菌DNA的小量制备方法； 植物（真菌）DNA extract

2、 Kit的选择； 动物组织或细胞中RNA的制备； 真菌（植物）RNA的制备； 植物和真菌RNA提取试剂盒的选择。 RNA提取过程中的注意事项； 鉴定所提RNA质量的方法和技巧。分子生物学实验操作方法与技巧（3）细菌DNA的常规制备方法将培养后离心得到的菌体经过生理盐水洗涤2遍后，取TENSTENS提取液提取液（50mMTris.Cl, pH8.0, 20mM Na50mMTris.Cl, pH8.0, 20mM Na2 2EDTA,100mM NaCl, 1% SDSEDTA,100mM NaCl, 1% SDS）3mL 于离心管中充分悬浮菌体.经100 C水浴保温2 2分钟分钟后取出,待其自

3、然冷却后,离心15分钟(8000g, 4 4 C C), 收集其上清液。在其中加入0.60.6倍体积倍体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），离心15分钟（12000g, 常温常温）,保留上清液.然后再加入0.6倍体积的氯仿：异戊醇（24：1），再次离心15分钟（12000g,常温）,取上清.最后加入1/10体积的3M NaAC(pH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇，混匀，置于20C 30分钟，离心15分钟（12000g, 4C）,弃上清保留沉淀。并用75的乙醇洗涤沉淀，离心，控干后溶于100微升TE或无菌水中，加RNase至终浓度为20 g/mL, 37 C处理30分钟, 取少量电泳,其余

4、放-20C保存备用。该方法所提细菌该方法所提细菌DNADNA适于作为适于作为PCRPCR反应的模板反应的模板，如果该方法所提细菌DNA将用于建立基因组文库，则最好先将这些DNADNA用相应的细菌用相应的细菌DNADNA提取试剂提取试剂盒或盒或DNADNA纯化试剂盒进行纯化后再用于建库纯化试剂盒进行纯化后再用于建库。分子生物学实验操作方法与技巧（3）细菌DNA PCR模板的快速制备方法（1） 微波炉法微波炉法: : 用接种环刮取大肠杆菌菌落菌落,置于1.5mL eppendorf离心管里，加上20 L TE（pH8.0）,振荡，盖上盖子。如果是菌液，则取1.5mL于13000r/min离心15秒

5、，彻底倒尽上清液。用无菌双蒸水或TE洗涤一次， 13000r/min离心15秒，去上清，悬浮在残存液体里，盖上盖子。在750W750W家用微波炉高热处理高热处理30S30S，内置内置一盛水的烧杯一盛水的烧杯，以免损坏微波炉。振荡1分钟，13000r/分离心2min。将上清储存在20 C。取12 L做为PCR反应的模板。分子生物学实验操作方法与技巧（3）细菌DNA PCR模板的快速制备方法（2） 煮沸法：煮沸法： 用接种环刮取大肠杆菌菌落,置于1.5mL eppendorf离心管里，加上20 L TE（pH8.0）,振荡，盖上盖子。如果是菌液，则取1.5mL于13000r/min离心15秒，彻底

6、倒尽上清液。用无菌双蒸水或TE洗涤一次， 13000r/min离心15秒，去上清，悬浮在残存液体里，盖上盖子。在沸水上煮在沸水上煮2min2min。13000r/min离心2分钟。将上清储存在20C。取12 L做为PCR反应的模板。 通过多次实验的比较，个人认为煮沸法煮沸法制备的细菌DNA PCR模板的质量和方法的重复性，要优于微波炉法优于微波炉法。 分子生物学实验操作方法与技巧（3）细菌基因组DNA提取试剂盒的选择首选QIAGEN公司的，因为其核酸提取试剂全球领先，而起总类最全。当然价格也比较昂贵。另外，有非常多的国内公司都生产细菌基因组DNA提取试剂盒，如：北京天根生化科技有限公司、广州东

7、盛生物科技有限公司、杭州博日科技有限公司，北京百泰克生物技术公司，广州誉维生物科技有限公司等。这些试剂盒的质量应该都可以满足要求。这里推荐三款我用过的、效果不错的试剂盒供大家参考：DW09-1DW09-1：细菌基因组：细菌基因组DNADNA快速提取试剂盒快速提取试剂盒（广州东盛生物科技有限公司）；E.Z.N.A.Bacterial DNAE.Z.N.A.Bacterial DNA KitKit(Omega公司，广州飞扬生物工程有限公司生产)；细菌基因组细菌基因组DNA提取试剂盒提取试剂盒 （北京天根生化科技有限公司）快速快速DNADNA提取扩增套装提取扩增套装 （北京天根生化科技有限公司）。上

8、述三款产品，前三款产品提取的DNA既可用于PCR，也可用于建库，而第四款产品提取的DNA只能用于PCR。分子生物学实验操作方法与技巧（3）酵母DNA的小量制备方法（1）实验原理：实验原理：首先酶解消化酵母细胞壁，制备原生质体。然后用SDS裂解产生的原生质体，释放出基因组DNA，从而可以制备其总DNA。程序：程序：、用YPDYPD培养基培养基培养酵母。将酵母培养物在3030C C、中度振荡条件下培养过夜，至ODOD6006002.02.03.03.0(约为3107个细胞mL)。2、取5mL 培养细胞置于离心管中.2000g(4100r/Min,Sorvall SS-34转头)离心5分钟,收集细胞

9、.将剩下培养物置于4 C贮存.3、用 0.5ml 山梨糖醇缓冲液（山梨糖醇缓冲液（1 M1 M山梨糖醇，山梨糖醇，0.1 M EDTA0.1 M EDTA（pH pH 7.57.5）重新悬浮细胞。将细胞悬液转移到一只微量离心管中。4、加入20l酶解酶溶液(Lywallzyme,Lywallzyme,广东微生物所，用山梨糖广东微生物所，用山梨糖醇缓冲液配成醇缓冲液配成2.5 mg/mL2.5 mg/mL浓度浓度)。将细胞悬液在37 37 C C下温育1h.5、用微量离心机离心1分钟，收集细胞，吸弃上清液。6、用0.5ml酵母重悬缓冲液（酵母重悬缓冲液（50 mM Tris-Cl,pH 7.4,

10、20 mM 50 mM Tris-Cl,pH 7.4, 20 mM EDTA, pH 7.5EDTA, pH 7.5）重新悬浮细胞。分子生物学实验操作方法与技巧（3）酵母DNA的小量制备（2）7、加入50 l 10的SDS。盖上管盖，将离心管快速地翻转数次，混匀 后将离心管在65 65 C C下温育30 min30 min。8、加入0.2 ml 5 mol/L 的醋酸钾溶液，冰浴冰浴1h。9、在微量离心机中以最大转速4 4 C C离心5min,使细胞碎片沉积下来。10、室温下用粗孔吸头吸取离心上清，转移到一个新的微量离心管中。11、加入等体积室温下的异丙醇等体积室温下的异丙醇，沉淀核酸。将管内

11、容物混匀，室温下 放置5min。( (重要：不要使沉淀过程超过重要：不要使沉淀过程超过5min)5min) 12、在微量离心机中以最大转速离心10s回收核酸沉淀。吸去离心上清 液，将沉淀在空气中干燥10min。 13、用300 l含20g/ml 胰Rnase的TE(pH8.0)溶解沉淀.将消化混合物 在37 37 C C温育温育30 min30 min。 14、加入30 l 3mol/L的醋酸钠(pH7.0).混匀后,加入0.2ml的异丙醇。 再次进行混匀。在微量离心机中以最大转速离心20s,使DNA沉淀。 15 吸去上清液，沉淀在空气中干燥10 min,用 150 l TE(pH 7.0)溶

12、 解DNA。本方法所得酵母本方法所得酵母DNADNA可用作可用作PCRPCR或被限制性酶切割用于构建基因组文库或被限制性酶切割用于构建基因组文库。分子生物学实验操作方法与技巧（3）酵母基因组DNA的两个简易制备方法(1) 方法1：接种酵母菌种于无菌的50 mL YPD 或SD培养基,在30 C生长至对数生长晚期(至OD6002.03.0)。滤液4000 r/min离心10 min. 菌体用液氮研液氮研磨磨破壁. 加7 mL DNA DNA 缓冲液缓冲液(100mM Tris-HCl, (100mM Tris-HCl, pH8.0, 10mM EDTA,1%SDS)pH8.0, 10mM EDT

13、A,1%SDS)。混匀, 65 C保温 1 h. 10000 r/min离心15分钟。上清用苯酚抽提2次，每次5000 r/min离心7分钟。再用氯仿抽提一次，5000 r/min离心7分钟。用2.5倍乙醇沉淀（加0.3 M NaAC，pH 5.2）, 10000 r/min离心10 min. 70%乙醇洗,电吹风吹干。加适量TE或水悬浮, 同时加适量RNase(20g/ml 胰RNase)。分子生物学实验操作方法与技巧（3）酵母基因组DNA的两个简易制备方法(2) 方法2：接种酵母菌种于无菌的50 mL YPD 或SD培养基,在30C生长至对数生长晚期(至OD6002.03.0). 滤液40

14、00r/min离心10 min. 菌体用液氮研磨液氮研磨破壁. 加加7mL DNA 7mL DNA 缓冲液缓冲液4mM spermidine4mM spermidine（亚精胺）（亚精胺）,40mM Tris-HCl, pH8.0, ,40mM Tris-HCl, pH8.0, 10mM EDTA, 0.1M Nacl, 0.5%SDS, 10mM 10mM EDTA, 0.1M Nacl, 0.5%SDS, 10mM - -mercaptoethanolmercaptoethanol（ - - 巯基乙醇）巯基乙醇） 。混匀, 迅速用苯酚抽提，5000 r/min离心7分钟,重复一次抽提过程.

15、再用氯仿抽提一次，5000 r/min离心7分钟。用2.5倍乙醇沉淀（加0.3 M NaAC，pH 5.2）, 10000 r/min离心10 min. 70%乙醇洗,电吹风吹干.加适量TE或水悬浮, 同时加适量RNase(20 g/ml 胰RNase)。分子生物学实验操作方法与技巧（3）上述两个简易方法的比较和讨论 方法1和方法2制备的酵母DNA的得率分别为0.2 mg/L0.2 mg/L菌液和0.3 mg/L0.3 mg/L菌液。方法2的DNA缓冲液成份稍微复杂一点，但得率更高。两个方法都很简便，不用制作原生质体，可酶简便，不用制作原生质体，可酶切分析和作为切分析和作为PCRPCR模板。模

16、板。如果不加液氮不加液氮研磨，则方法1和2的得率分别减少至减少至15152020和5 51010。分子生物学实验操作方法与技巧（3）酵母DNA小量提取试剂盒 推荐 E.Z.N.A. Yeast DNA Kit.(Omega公司出品，飞扬公司生产) 一次可从1-3 ml酵母培养液中提取基因组DNA或质粒。 操作时间：60分钟左右。 得率：不高（几个微克），但较纯。 价格：900元/50次,很贵。 用途：纯化DNA产物可直接用于PCR、酶切和杂交等实验。分子生物学实验操作方法与技巧（3）植物（真菌）DNA的小量制备方法、首先，必须破碎（或消化）细胞壁释放出细胞内容物。常用的破壁常用的破壁方法是用匀

17、浆器直接将植物组织磨成细粉；或者将新鲜植物组织在液氮方法是用匀浆器直接将植物组织磨成细粉；或者将新鲜植物组织在液氮中快速冷冻后，用研钵将其磨成粉。中快速冷冻后，用研钵将其磨成粉。分离核DNA或细胞器DNA则应采取更为温和的破壁方法，以免过早破坏内膜系统，人们通常采用在含渗透剂的缓冲液中C匀浆的方法来破壁。、必须破坏细胞膜使、必须破坏细胞膜使DNADNA释放到提取缓冲液中。这一步骤通常靠释放到提取缓冲液中。这一步骤通常靠SDSSDS或或CTABCTAB一类的去污剂来完成。一类的去污剂来完成。去污剂还可以保护DNA免受内源性核酸酶的降解。通常提取缓冲液中还包含还包含EDTAEDTA，它可以螯合大多

18、数核酸酶所需的辅助因子镁离子。、一旦DNA释放出来，其剪切破坏的程度必须要降到最低。剪切破坏的程度必须要降到最低。剧烈振荡或小孔快速抽吸都会打断溶液中高分子量的DNA。一般说来，如果操作得当，可以得到相对分子质量长度为kbkb的的DNADNA。、在DNA粗提取中往往含有大量RNA、蛋白质、多糖、单宁、色素等杂质，大多数蛋白可通过氯仿或苯酚处理后变性、沉淀除去蛋白可通过氯仿或苯酚处理后变性、沉淀除去，绝大多数RNA可以通过RNaseA除去。但多糖一般很难除去。多糖一般很难除去。常使DNA提取物呈胶状而干扰后续操作。用玻璃钩钩出溶液中沉淀的絮状用玻璃钩钩出溶液中沉淀的絮状DNADNA而不是用离心获

19、得DNA，可以有效减少DNA 中多糖的含量。分子生物学实验操作方法与技巧（3）操作程序（1）、将g经去淀粉处理去淀粉处理的新鲜植物组织置于液氮中速冻，用研钵磨成细粉。、将冷冻粉转移到一个ml离心管中并加入ml提取缓冲液500 mMNaCl, 100 mM Tris-Cl pH 8.0, 50 mM EDTA,pH 8.0, 10 mM -mercaptoethanal(用前加入)中，轻轻旋转混匀。、加入mlSDS，混匀， C保温分钟，并不时轻轻旋转混匀（要点）（要点）、加入5mLmol/L KAC,混匀后冰上放置分钟（要点）（要点）、12g, 4 C离心分钟。、上清用双层纱布过滤，转移至一干净

20、的mL离心管中，加入mL异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20 C放置min沉淀核酸。7、2000 g,4 C离心20 min,去上清,晾干沉淀5 min.8 、用700 lTE缓冲液溶解沉淀并转移到一个eppendorf管中。（要点（要点3 3）分子生物学实验操作方法与技巧（3）操作要点操作要点 去淀粉处理：收获之前将植株于暗处放置24小时即可达到去除淀粉的目的。 1、将SDS溶液加入到化冻的提取物中时，可能会有沉淀析出，要保证析出的SDS重新溶解，以及65 C保温时提取物混合均匀。 2、在高浓度（1 mol/L）的钾离子存在的情况下，SDS会与蛋白或多糖结合变成不溶性的十二烷基磺酸钾复合物，这类复合

21、物通常呈絮状，必须要经较高转速离心和纱布过滤予以除去。 3、若沉淀难于重新溶解，可在65 C加热10 min.分子生物学实验操作方法与技巧（3）操作程序（2） 9 9、加入、加入7 7 l RNase A l RNase A 储存液储存液, 37 , 37 C C保温保温1 h.1 h. 1010、加入、加入75 75 l 3mol/L KAC,l 3mol/L KAC,轻弹混匀轻弹混匀, ,离心离心15 15 minmin沉淀不溶性杂质。沉淀不溶性杂质。 1111、 将上清转移至一装有将上清转移至一装有500 500 l l 异丙醇的干净异丙醇的干净管中，轻轻混匀，室温下放置管中，轻轻混匀，

22、室温下放置5min.5min. 1212、微量离心机离心、微量离心机离心15 min15 min沉淀沉淀DNADNA，去上清并用，去上清并用500 500 l 70l 70乙醇清洗沉淀，再次离心乙醇清洗沉淀，再次离心5 min,5 min,小小心弃去乙醇。心弃去乙醇。 1313、沉淀物溶解于、沉淀物溶解于200 200 l TEl TE缓冲液中，缓冲液中，4 4 C C保存。保存。分子生物学实验操作方法与技巧（3）植物（真菌） DNA extract Kit的选择 优点: 步骤较简单步骤较简单, ,重复性高重复性高,DNA,DNA纯度很高纯度很高,不含多糖等很难除去的杂质。 缺点: 价格高价格

23、高, ,得率很低得率很低,用来做PCR模板可以,但用来做文库则量不够。 推荐品牌:严格说来目前没有一个品牌的植物（真菌） DNA extract Kit 是令人满意的，相比而言，Qiagen公司和Omega公司的产品稍好些。QiagenQiagen公司的试剂盒公司的试剂盒（DNeasy plant Mini Kit）质量好,适用于植物和真菌适用于植物和真菌，但得率低,价格贵。OmegaOmega公司的产品公司的产品价格适中,对植物DNA提取效果较好（E.Z.N.A.SP Plant DNA Kit）,但提真菌提真菌DNADNA效果不好效果不好(E.Z.N.A.SP Fungal DNA Kit

24、)。 推荐方法：可用前面的手工提取方法提取大量的可用前面的手工提取方法提取大量的DNADNA，然后，然后用试剂盒纯化用试剂盒纯化DNADNA。分子生物学实验操作方法与技巧（3）动物组织或细胞中RNA的制备推荐方法：一步法。一步法。原理：用含异硫氰酸胍异硫氰酸胍和酚酚的一种单相液单相液来裂解细胞。加入氯仿产生了第二相（有机相），DNADNA和蛋白质在有机相中被抽提，和蛋白质在有机相中被抽提，RNARNA则被留在上层水相中。用乙则被留在上层水相中。用乙醇和异丙醇连续沉淀可分别分离有机相中的醇和异丙醇连续沉淀可分别分离有机相中的DNADNA和蛋白质。和蛋白质。回收的有机相中的DNA大小约为20KB，

25、适于作PCR的模板。存在于含胍的溶液中保持变性的蛋白质主要用于免疫印迹分析。异丙醇沉淀的上层水相中的RNA可用Oligo（dT)纤维素柱亲和层析法进一步纯化或被用于Northern印迹杂交分析、反转录或反转录PCR反应（RTPCR）。RNA的产量取决于组织或细胞的来源，但是，通常每毫克组织可获得通常每毫克组织可获得4 47 7 g g RNA, RNA, 每每10106 6细胞可获得细胞可获得5 510 10 g RNAg RNA。提取的RNA A260A280 比值一般为1.82.0。定量测定DNA或RNA时需要读取260nm和280nm两个波长下的读数。根据在260nm处的读数可计算出样品

26、中的核酸浓度，1 1个个ODOD值相当于值相当于50 50 g gmLmL双链双链DNADNA、40 40 g g mLmL单链单链DNADNA和和RNARNA及及33 33 g g mLmL单链寡核苷酸。单链寡核苷酸。利用260nm和280nm两处读数的比值可估计核酸的纯度。DNA和RNA纯制品的OD260：OD280值分别为1.8和2.0, 若样品中蛋白或酚的污染较严重则OD260：OD280低于上述两个数值，就不可能通过分光光度法进行精确定量。分子生物学实验操作方法与技巧（3）操作步骤（1）1、准备分离RNA的细胞或组织样品细胞或组织样品。有些组织富含降解酶（胰腺或肠子），最好先将这些组

27、织切成小块，迅切成小块，迅速放入液氮中，速放入液氮中，反复冰冻后，储存于7070度度或直接提取RNA。组织可在70度存放几个月而不影响RNA的产量和完整性。A.解剖所要的组织，将其直接放入液氮中速冻。B.将100mg冰冻组织放入盛有液氮的研钵中，用研杵碾碎组织。在研磨过程中要不断添加液氮以保持组织冷冻。不断添加液氮以保持组织冷冻。C.将粉末状的组织移入一个盛有1mL冰冷单相液（Trizol,Trizol,成分目前还没成分目前还没有公开）有公开）的聚乙烯离心管中。D.于室温用polytron匀浆器高速匀浆组织1530S。悬浮生长的哺乳动物细胞：悬浮生长的哺乳动物细胞：A.用台式离心机于室温以20

28、0-900g离心510min,收集细胞。B.吸出培养液，用12mL无菌冰冷的PBS重悬细胞沉淀。C.离心收集细胞，吸尽PBS，每106细胞加1mL单相裂解液。D.于室温，用匀浆器高速匀浆细胞1530S。分子生物学实验操作方法与技巧（3）操作步骤（2）单层生长的哺乳动物细胞：单层生长的哺乳动物细胞：A.吸出培养液，用510mL无菌冰冷的PBS洗涤细胞 一次。B.吸出PBS，每个直径90mm培养皿中的培养细胞用1mL单相裂解剂裂解细胞（每个直径60mm培养皿中加0.7mL单相裂解液）C. 转细胞裂解液于螺帽聚乙烯管（离心管）中。D. 于室温用匀浆器高速匀浆细胞裂解物1530S。2. 于室温将细胞匀

29、浆物温育5 min使核蛋白复合物完全解离。3. 加入0.2mL氯仿于每毫升单相裂解液中，通过剧烈摇动或用涡旋振荡器混匀样品；4.于4C以12000r/min 离心15 min使混合物分为两相，将上层水上层水相移相移至一个新的离心管中。DNADNA（中间相）和蛋白质（下层相）（中间相）和蛋白质（下层相）被抽提进有机相，RNA留在水相。用乙醇和异丙醇连续沉淀回收DNA和蛋白质。5.从水相中沉淀RNA：每1mL单相裂解液，加入0.25倍体积的异丙醇和0.250.25倍体积的倍体积的RNARNA沉淀液（沉淀液（1.2 M NaCl, 0.8 M 1.2 M NaCl, 0.8 M 柠檬酸二钠柠檬酸二钠

30、盐盐.15H.15H2 2O O，乙酸钠，乙酸钠，3 M3 M，pH 5.2pH 5.2）。）。充分混匀后，于室温放置10 Min。分子生物学实验操作方法与技巧（3）操作步骤（3）6. 于4C 以最大转速离心10min收集RNA沉淀。用75乙醇沉淀两次，重复上述离心。用一次性使用的吸头吸尽残存的乙醇。将打开管盖的离心管在实验台放置几分钟，将最后残存的痕量乙醇挥发殆尽。不要让RNA沉淀干透。7. 加50-100L DEPCDEPC（焦碳酸二乙酯）处理过的水（最好再加一（焦碳酸二乙酯）处理过的水（最好再加一些商品化的些商品化的RnaseRnase抑制剂，如抑制剂，如RNAsin,PromegaRN

31、Asin,Promega公司）。公司）。将RNARNA溶液溶液储存于储存于7070C C。加SDS至终浓度0.5，然后加热至65C有助于RNA沉淀的溶解.但纯的RNA在用0.5%SDS液重悬后不能抵抗Rnase的降解，因此一些研究者更喜欢用50100 L 稳定的甲酰胺溶液溶解RNA沉淀，并储存于20C。用4倍体积的乙醇沉淀可回收溶于甲酰胺溶液中的RNA。另外如RNA用SDS溶解，在酶学处理（如RTPCR等）前应用氯仿抽提和乙醇沉淀除去SDS。如RNA中不慎污染了DNA，可用无RNase的DNase处理样品或用oligo(dT)柱层析制备mRNA的方法除去DNA片段8. 电泳（乙醛酸处理的（乙醛

32、酸处理的RNARNA琼脂糖电泳或琼脂糖电泳或RNARNA甲醛琼脂糖电泳）甲醛琼脂糖电泳）分析RNA完整程度, 分光光度计法计算RNA浓度。 分子生物学实验操作方法与技巧（3）TRIZOL 法提取真菌（植物）RNA操作程序（Invitrogen 公司 protocol）一、 所需试剂：氯仿，异丙醇，75%乙醇（用DEPC水配制），DEPC水。二、 操作程序：1、500mg离心收集的湿菌丝体，加1ml TRIZOL,匀浆器中匀浆匀浆器中匀浆5 5分钟（液氮研磨分钟（液氮研磨成粉后再加入成粉后再加入TRIZOLTRIZOL可获得更佳的效果可获得更佳的效果 ），至菌丝体完全捣碎。2、4、12000g离

33、心10分钟，转移上清。3、上清室温放置5分钟，加0.2ml氯仿，用手剧震15秒，室温放置2-3分钟。4、4、11000g离心15分钟，转移水相。5、水相中加入0.25ml异丙醇及0.25ml高盐沉淀液（0.8M柠檬酸钠，1.2MNaCl）混匀，室温放置10分钟。6、4、11000g离心10分钟去上清。7、加1ml 75%乙醇，vortex混匀，4、7000g离心5分钟，去上清。8、沉淀在空气中干燥5-10分钟，用用100100 l DEPCl DEPC水溶解水溶解，枪头吸打几次，放于放于5555水浴中水浴中1010分钟促溶。分钟促溶。9、电泳及测OD值，检定RNA的量及完整性。10、RNARN

34、A放放-70 -70 保存。保存。分子生物学实验操作方法与技巧（3）植物和真菌RNA提取试剂盒的选择 对于植物和真菌对于植物和真菌，没有好的提RNA的试剂盒（多糖含量高，不好纯化，得率很低），即使Qiagen的也不好用，所以只能用只能用TrizolTrizol法法提取。提取。Trizol推荐使用Invitrogen Invitrogen 公司的公司的Trizol reagentsTrizol reagents为最佳, Omega公司的也可以。其他公司也有Trizol，但效果良莠不齐。至于提血液、动物组织，很多公司的试剂盒至于提血液、动物组织，很多公司的试剂盒都不错都不错，如Omega，Qiag

35、en的试剂盒。分子生物学实验操作方法与技巧（3）如何确保RNA提取实验成功1、带手套、口罩手套、口罩操作。2、研磨时液氮添加的量液氮添加的量（样品为植物和真菌材料、动物器官等时需要用到）要足够要足够，研磨时要不停地添加；3、操作时周围人不要太多人不要太多，而且尽量不要走动尽量不要走动；4、样品最好新鲜采集样品最好新鲜采集，并且保存在冰箱或液氮中；5、TrizolTrizol等试剂没有过期变质。没有过期变质。6、提取缓冲液没被污染缓冲液没被污染（空气或微生物）。7、保证有RNA实验专用的移液器、生化试剂、工作台面、玻璃专用的移液器、生化试剂、工作台面、玻璃 器皿器皿（300300度烘度烘4 4小

36、时），小时），DEPCDEPC处理过的水；处理过的水；8、进口的移液器吸头和离心管。进口的移液器吸头和离心管。分子生物学实验操作方法与技巧（3）一种简单、快速进行RNA电泳的方法目前RNA 的质量采用变性琼脂糖凝胶电泳方法来鉴定,这些方法步骤繁琐、费时、费力。我室在长期进行RNA 的研究中,摸索出了一种简单、快速和可靠的鉴定RNA 质量的电泳方法,现报道如下：电泳方法、步骤大体同普通的TBE琼脂糖凝胶电泳。为最大限度降低RNA 在电泳时被降解,结合甲醛变性琼脂凝胶电泳分离RNA 方法,在常规琼脂糖凝胶电泳的基础上进行如下改进。电泳电泳RNA RNA 所用器械所用器械如制胶的模具、梳子、电泳槽等

37、用洗涤剂洗干净后用用DEPCDEPC处理过的水处理过的水（也可用无菌双蒸水替代）冲洗冲洗二遍后在室温晾干备用。用新的用新的TBE TBE bufferbuffer配制配制1 1.2%2%琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶, ,倒胶时溴化乙锭倒胶时溴化乙锭(EB)(EB)直接加入凝胶中。直接加入凝胶中。制备好的琼脂糖凝胶板放入电泳槽后再加入经高压灭菌过的1XTBE ,液面只能刚好同胶面平齐液面只能刚好同胶面平齐, ,缓冲液不要淹过胶面。点样时缓冲液不要淹过胶面。点样时, ,样品样品RNA RNA 每每10l 10l 加入加入2l 2l 上样缓冲液上样缓冲液, ,上样缓冲液是用上样缓冲液是用DEPC DEPC

38、处理的水配制处理的水配制的的50 %50 %甘油甘油, ,另外单独点一样品孔含有另外单独点一样品孔含有3l 3l 溴酚蓝的上样缓冲液作为溴酚蓝的上样缓冲液作为电泳指示剂电泳指示剂。电泳电压可适当加大，用电泳电压可适当加大，用10 V/ cm10 V/ cm胶板胶板, ,以减少电泳以减少电泳时间。时间。电泳结束后立即取出凝胶在紫外灯下观看所提取的RNA 的质量或进行拍照记录。实验关键：普通实验关键：普通TBETBE电泳跑电泳跑RNARNA，有两个关键：，有两个关键：第一，从清洁电泳槽和胶板，制备电泳胶及点样、电泳的过程中都要第一，从清洁电泳槽和胶板，制备电泳胶及点样、电泳的过程中都要尽可能避免尽

39、可能避免RNARNA酶的污染。酶的污染。第二，实验过程要动作迅速，电泳仪的电压加大，减少电泳的时间。第二，实验过程要动作迅速，电泳仪的电压加大，减少电泳的时间。分子生物学实验操作方法与技巧（3） 理想的RNA提取结果（电泳图片）理想的RNA提取结果应该是由两条比较亮的带组成，对应于真核生物的28S rRNA和18S rRNA。特别是28S rRNA28S rRNA的带越完整、清晰和明亮，通常的带越完整、清晰和明亮，通常说明说明RNARNA提取结果越好。提取结果越好。最下面一条比较模糊的带通常是由tRNA、5.8s rRNA和5S rRNA组成的。rRNA占总RNA的90%以上,它们主要由28S

40、、18S、5. 8 S、5S 组成,28S(28S(约约4.5 kb)4.5 kb) 、18S(18S(约约2.1 kb)2.1 kb) 、5.8S(5S)（约几百（约几百bpbp） 这三类rRNA 的摩尔浓度大致相等,但他们的分子量相差较大,在紫外灯下的亮度依次为28S18S5.8S(5S) 。分子生物学实验操作方法与技巧（3）不理想的RNA提取结果（电泳图片）分子生物学实验操作方法与技巧（3）三、酶切与连接 1、限制性内切酶的概述及使用注意事项； 2、标准的限制酶酶切体系； 3、星活性（Star activity）； 4、双酶切反应； 5、 PCR片段末端的限制酶酶切； 6、酶切片段的回收

41、； 7、限制酶末端的相互连接； 8、同尾酶举例； 9、限制性内切酶和连接酶品牌推荐； 10、底物DNA没有被限制酶切断的常见原因； 11、实验室代替低温循环水浴的几个小窍门。分子生物学实验操作方法与技巧（3）限制性内切酶的概述及使用注意事项 分子生物学实验中常用的酶分子生物学实验中常用的酶: : 限制性内切酶限制性内切酶: EcoRI，HindIII等。 修饰酶修饰酶:ligases,Alkaline phosphatases,DNA polymerases,RNA polymerases, Nucleases等。 酶类都有保存期限保存期限,保质期一般是检定日后的一年检定日后的一年内内，但几乎

42、所有的限制酶在超过保质期后都不会急剧失活，还可以用一段时间。一般买酶时分析日期一般买酶时分析日期以半年内为好。酶切时酶应放在冰上操作或从冰箱以半年内为好。酶切时酶应放在冰上操作或从冰箱拿出吸完立刻放回。拿酶时手指应放在管子的上部，拿出吸完立刻放回。拿酶时手指应放在管子的上部，防止手指的温度使酶失活。另外，限制性内切酶从防止手指的温度使酶失活。另外，限制性内切酶从冰箱中取出后，应置于冰上。一般总是在其它试剂冰箱中取出后，应置于冰上。一般总是在其它试剂加完后，再加入内切酶。加完后，再加入内切酶。分子生物学实验操作方法与技巧（3）标准的限制酶酶切体系 一般是1 1g g底物底物DNA，在50 50

43、l l终反应体系终反应体系中，用1个单位（1 Unit）的内切酶催化，在推荐的反应缓冲液和温度下反应1个小时。 酶解1g以下或以上的DNA，可按上述标准体系进行缩小标准体系进行缩小或放大或放大。加入过量的内切酶，可以缩短反应时间并达到酶切完全的效果，但是不能过分加大酶的用量，以免产生星活性。所以我们推荐稍过量的酶（推荐稍过量的酶（2-52-5倍）较长的反应时倍）较长的反应时间。间。 对于绝大多数酶切反应，通常通常4-64-6小时都足以完全酶切小时都足以完全酶切反应底物。如果底物不纯或难以酶切，通常过夜酶切（过夜酶切（8-128-12小时）小时）可实现底物的完全酶切。但不推荐太长的酶切时间太长的

44、酶切时间（1818小时以上），小时以上），太长的酶切时间（或许还有酶量过多的原因）有时会把反应底物切成碎片有时会把反应底物切成碎片。 由于某些未知的原因，有时按预实验结果放大酶切体积的有时按预实验结果放大酶切体积的时候，会导致酶切效果不理想。时候，会导致酶切效果不理想。如果重复一次实验仍然不能解决问题，这种情况下最好的办法是做多管小体积的酶做多管小体积的酶切实验切实验，最后把酶切产物汇集到一起进行电泳、回收酶切片段。分子生物学实验操作方法与技巧（3）星活性（Star activity） 限制酶根据反应条件的不同，可能会切断与原来认识序列不同的位点，这种不同于原来的特异性的活性，称为星活性。星活

45、性。一般产生星活性的主要原因是反应体系中酶量太多（一酶量太多（一般不要超过般不要超过15152020），或样品中甘油含量），或样品中甘油含量多（一般不要超过多（一般不要超过1010），或酶切温度变化），或酶切温度变化（如从（如从3737C变为变为30 30 C C ）。）。分子生物学实验操作方法与技巧（3）双酶切反应 使用两种酶同时进行DNA切断反应，是实验操作中非常常用的手段。此时，使用此时，使用BufferBuffer非常重要。非常重要。为了节省时间，通常通常希望在同一反应体系中进行。希望在同一反应体系中进行。Takara采用Universal Buffer表示系统，并对每种酶表明了在各U

46、niversal buffer中的相对活性（详见TakaraTakara商品目录商品目录A A4 4表表）。根据该表，可选出可选出双酶切时的缓冲液双酶切时的缓冲液（具体见TakaraTakara商品目录商品目录A A6 6表表，选择原选择原则是该缓冲液应该使两种酶的活性都比较高，且尽可能避免则是该缓冲液应该使两种酶的活性都比较高，且尽可能避免出现酶的星活性出现酶的星活性）。尽管如此，在进行Double Digestion时，有时还会难以找到合适的难以找到合适的Universal BufferUniversal Buffer。此时应自己调此时应自己调整缓冲液的成份整缓冲液的成份（ TakaraT

47、akara商品目录商品目录A A5 5表表，如先在低盐低盐BufferBuffer下用一种酶切，然后补加盐后，将一种酶加热失活，再在高盐高盐BufferBuffer下用另一种酶酶切。 根据DNADNA的种类的种类，各DNA的立体结构的差别立体结构的差别，或当限制酶切位当限制酶切位点邻接时点邻接时，有时有时会发生Double DigestionDouble Digestion不能顺利进行不能顺利进行的可能。此时可调节酶切反应体系调节酶切反应体系或换不同的载体换不同的载体进行酶切反应。分子生物学实验操作方法与技巧（3）PCR片段末端的限制酶酶切 克隆PCR产物的方法之一，是在PCR产物两端设计一定

48、的限制酶切位点，经酶切后克隆至用相同酶切的载体中。但实验证明，大多数限制酶对裸露的酶切位点不能切断。必须在酶切大多数限制酶对裸露的酶切位点不能切断。必须在酶切位点旁边加上位点旁边加上2 23 3个保护碱基，以个保护碱基，以3 3个为最好，才能使所定个为最好，才能使所定的限制酶对其识别位点进行有效切断。的限制酶对其识别位点进行有效切断。 保护碱基不是随便设计的，不同的酶需要设计不同的保护碱不同的酶需要设计不同的保护碱基基，以达到最佳酶切效果。如有需要，我这里有份NEB公司限制酶的保护碱基资料（pdf版），可供大家参考。 如果加上保护碱基仍然不能切开PCR产物，可将可将PCRPCR产物克隆产物克隆

49、（利用PCR产物末端通常加A的特性连接到T载体上）到到T T载体载体上再切。上再切。分子生物学实验操作方法与技巧（3）酶切片段的回收 将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后将所需大小的酶切片段从胶上切下来所需大小的酶切片段从胶上切下来，利用DNADNA胶回收试剂盒胶回收试剂盒进行回收。具体技术细节和产品推荐将在电泳章节中详述。分子生物学实验操作方法与技巧（3）限制酶末端的相互连接 尽管限制酶不同，但只要酶切后产生的切口序列相互吻合，就可相互连接。在TakaraTakara产产品目录品目录A41A41A47A47中中罗列了这些限制酶的相互关系，对选择用于切断连接的限制酶很

50、有用处。分子生物学实验操作方法与技巧（3）同尾酶举例同尾酶举例 BamHI识别位点：GGATCC， BglII识别位点：AGATCT， BamHI切后产生：GATC末端 BglII切后产生：GATC末端 所以二者的酶切产物可以互相连接起来，产生新的识别位点GGATCT，该序列能被MfII和Sau3AI识别。分子生物学实验操作方法与技巧（3）限制性内切酶和连接酶品牌推荐内切酶推荐品牌内切酶推荐品牌:Takara（宝生物），ToYoBo（东洋纺）。这两个公司生产的限制性内切酶价廉物美，非常可靠，适用于绝大多数酶切实验。如果重复多次酶切都不成功，且DNA质量和酶本身都没有问题，那么推荐可采用质量最好

51、的限制性内切酶NEB （New England Biolabs）公司的酶试一试，通常都能立刻解决问题。连接酶推荐品牌连接酶推荐品牌: : 绝大多数连接实验都可采用Takara公司的 ligase或ToYoBo公司的Ligation high完成。如果酶切位点特别难连接或进行平端连接，推荐采用质量更可靠、连接效率更高的下列品牌的连接酶：NEB（New England Biolabs），Clonetech,德国宝灵曼的ligase(已被Roche收购)。最近，加拿大的Fermentas（富酶泰斯）产品也开始进入中国市场，该公司是世界第二大的工具酶生产商，其限制性内切酶（尤其是快速内切酶，号称可以在

52、5分钟内完成酶切）和连接酶质量也很好，而价格介于NEB和TakaRa之间，大家也可以使用。分子生物学实验操作方法与技巧（3）底物DNA没有被限制酶切断的常见原因 1 1、底物、底物DNADNA上没有该限制酶位点，上没有该限制酶位点，特别是一些经过重组等处理的DNA（非工程菌株），碱基易发生缺失、变化等。 2 2、限制酶识别位点上的、限制酶识别位点上的A A或或C C被甲基化。被甲基化。部分限制酶对识别位点中的碱基是否被甲基化比较敏感，从而无法切断该位点。 3 3、底物不纯。、底物不纯。如果底物DNA中含有限制酶阻害物质，会影响限制酶的酶起作用。在此情况下DNA必须进行纯化。 4、限制酶的识别、

53、切断位点在底物底物DNADNA的高级结构的高级结构中所处的位置，对酶切反应也有一定的影响影响。 5、酶的质量问题。酶的质量问题。如过期、运输或保存过程中放置不当导致的酶活的丧失。 6、一个常常容易被忽视的原因是由于酶切所采用的水质量水质量不好（应采用无菌超纯水或无菌三蒸水）不好（应采用无菌超纯水或无菌三蒸水），使得底物DNA没有被限制酶切断。分子生物学实验操作方法与技巧（3）实验室代替低温循环水浴的几个小窍门 酶切片段连接时通常采用的连接温度是连接温度是1616度度，最好用低温循最好用低温循环水浴进行过夜连接环水浴进行过夜连接。 如果没有，可使用以下替代方法，也可获得很好的效果： 1、如果是白天连接白天连接，可将保温壶保温壶中水温度调至16度，然后放入连接产物进行连接。每隔一段时间，往保温壶中加一点冰，保持壶中温度不升高；如果是晚上连接如果是晚上连接，离开前将保温壶水温调至调至1212度度左右，然后盖紧壶盖离开。夜间温度一般比较低，第二天往往水温还能保持在20度左右，基本可满足连接条件； 2、冰箱冷藏室门的最上面往往保持在冰箱冷藏室门的最上面往往保持在15151616度（不同品牌度（不同品牌冰箱可能略有不同，需预先测量一下），是连接的好地方。冰箱可能略有不同，需预先测量一下），是连接的好地方。在测量过温度后，可将连接产物放在上面过夜，效果也很好。分子生物学实验操作方法与技巧（3）