分子遗传学课件遗传多态性

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1、2022-5-4 2分子遗传学分子遗传学分子遗传学分子遗传学教师：教师：刘若余联系电话：0851-3864327，13984812913 基因组多态性基因组多态性n基因组多态性：在不同群体或个体之间，基基因组多态性：在不同群体或个体之间，基因组的某些位点上碱基的差异。这种差异也因组的某些位点上碱基的差异。这种差异也称之为分子遗传标记。称之为分子遗传标记。n遗传标记遗传标记是指可以明确反映遗传多态性的生是指可以明确反映遗传多态性的生物特征物特征n 在经典遗传学中在经典遗传学中,遗传多态性遗传多态性是指等位基是指等位基因的变异因的变异.n 在现代遗传学中在现代遗传学中,遗传多态性遗传多态性是指基因

2、组是指基因组中任何座位上的相对差异中任何座位上的相对差异. DNA分子标记分子标记是是DNA水平上遗传多态性水平上遗传多态性的直接反映的直接反映.DNA水平的遗传多态性表现为水平的遗传多态性表现为核苷酸序列的任何差异核苷酸序列的任何差异,哪怕是单个核苷酸哪怕是单个核苷酸的变异的变异.因此因此,DNA标记在数量上几乎是无限标记在数量上几乎是无限的的.nDNADNA遗传标记特点遗传标记特点：n1.1.直接反映基因特征，非推测。直接反映基因特征，非推测。 2.2.基因座位数量多，无论表达与否。基因座位数量多，无论表达与否。 3.3.多态性程度高，等位基因多，鉴别能力强多态性程度高，等位基因多，鉴别能

3、力强。 4.4.适合于陈旧的样品，检测能力强。适合于陈旧的样品，检测能力强。 5.5.灵敏度高，有利于微量样品的检测。灵敏度高，有利于微量样品的检测。 6.6.易于检测手段的自动化、标准化，重复性易于检测手段的自动化、标准化，重复性好。逐渐取代了蛋白质水平的检测方法。好。逐渐取代了蛋白质水平的检测方法。 DNA多态性的分类 1 1）长度多态性）长度多态性：等位基因片段长度的个体差：等位基因片段长度的个体差 别。由一特定序列，首尾相连串联别。由一特定序列，首尾相连串联 重复次数不同产生的个体差别。重复次数不同产生的个体差别。 可变数目串联重复（可变数目串联重复（variable number o

4、f variable number of tandem repeat,VNTR tandem repeat,VNTR） 短串联重复短串联重复(short tandem repeat,STR)(short tandem repeat,STR) A A：产生原因：产生原因：DNADNA滑动与同源染色体滑动与同源染色体 不等交换。不等交换。2 2）序列多态性：DNADNA片段碱基排列顺序的个体差别。片段碱基排列顺序的个体差别。 单核苷酸多态性单核苷酸多态性 （single ucleotidepolymorphism,SNPssingle ucleotidepolymorphism,SNPs） 原因：

5、碱基的置换、插入、缺失。原因：碱基的置换、插入、缺失。 特点：多位于非编码区，选择压力。特点：多位于非编码区，选择压力。 数量多，数量多，1/1000 bp1/1000 bp，300300万万 二态性，二态性，2 2个等位基因，多态性个等位基因，多态性 程度较低。程度较低。 孤立事件，人类遗传学意义大。孤立事件，人类遗传学意义大。DNA标记的分类标记的分类依据多态性的检测手段依据多态性的检测手段,DNA标记可分为四大类标记可分为四大类:(1)基于基于DNA-DNA杂交杂交的的DNA标记标记. 该标记技术是利用限制性内切酶及凝胶电该标记技术是利用限制性内切酶及凝胶电泳分离不同生物体的泳分离不同生

6、物体的DNA分子分子,然后用经标记然后用经标记的的DNA探针探针,通过放射自显影或非同位素显色通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示技术来揭示DNA的多态性的多态性.其中最具代表性的其中最具代表性的是发现最早和应用广泛的是发现最早和应用广泛的RFLP标记标记.n(2)基于基于PCR的的DNA标记标记. 根据根据PCR所用的引物特点所用的引物特点,这类这类DNA标记可标记可分为随机引物分为随机引物PCR标记和特异引物标记和特异引物PCR标记标记.随机引物随机引物PCR标记包括标记包括RAPD标记和标记和ISSR等等,随机引物随机引物PCR所扩增的所扩增的DNA区段事先未知区段事先未知,具具有随意

7、性和任意性有随意性和任意性,因此随机引物因此随机引物PCR标记技标记技术可用于对任何未知基因组的研究术可用于对任何未知基因组的研究.特异引物特异引物PCR标记包括标记包括SSR标记和标记和STS标记等标记等,特异引特异引物物PCR所扩增的所扩增的DNA区段事先是已知的明确区段事先是已知的明确的的,具有特异性具有特异性.因此特异引物因此特异引物PCR标记技术依标记技术依赖于对各个物种基因组信息的了解赖于对各个物种基因组信息的了解.(3)基于基于PCR和限制性酶切技术结合的和限制性酶切技术结合的DNA标标记记.这类这类DNA标记可分为二种类型标记可分为二种类型,一种是通一种是通过对限制性酶切片段的

8、选择性扩增来显示限过对限制性酶切片段的选择性扩增来显示限制性片段长度的多态性制性片段长度的多态性,如如AFLP标记标记.另一种另一种是通过对是通过对PCR扩增的片段的限制性酶扩增的片段的限制性酶 切来切来揭示被扩增的区段的多态性揭示被扩增的区段的多态性,如如CASP标记标记.n4)基于单核苷酸多态性的基于单核苷酸多态性的DNA标记标记,如如SNP标记标记.单核苷酸多态性（SNP）标记被称为第三代分子标记 。它也是以以PCR技术为基础的分子标记技术。基于遗传标记的发展历程基于遗传标记的发展历程n第一代标记 经典的遗传标记（蛋白质和免疫学的标记） 70年代中后期，限制酶片段长度多态性（RFLP）n

9、第二代标记 85年，“小卫星序列（minisatellite） 89年，“微卫星序列（microsatellite）n第三代标记 单核苷酸多态性标记（single nucleotide polymorphism ，SNP）n经典的遗传标记（蛋白质和免疫学的标记）ABO血型位点标记HLA位点标记（人类白细胞抗原）人类白细胞抗原）n存在问题：已知多态的蛋白质很少等位基因的数目有限无法获得足够的信息量检测技术的繁琐等限制了人类基因组的遗传分析工作促使人们直接在DNA上寻找遗传标记遗传标记中的第一代标记遗传标记中的第一代标记蛋白质和免疫学的标记同工酶的多态性同工酶的多态性EsDEsD分型示意图分型示意

10、图遗传标记中的第一代标记遗传标记中的第一代标记nRFLP( restriction fragment length polymorphism) 标记技术标记技术 RFLP即限制性片段长度多态性即限制性片段长度多态性.是指用某一种限制性内切酶来切割来自不同个体的DNA分子上，内切酶的识别序列有差异，即是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。这种差异反映在酶切片段的长度和数目上。 限制性内切酶是一种能识别限制性内切酶是一种能识别DNA上特定碱上特定碱基组成的序列基组成的序列,并在这些序列位点上切断并在这些序列位点上切断DNA分子的酶分子的酶.限制性片段长度多态性的DNA基础（1

11、） 识别部位的点突变：碱基的替换、修识别部位的点突变：碱基的替换、修 饰（甲基化）或插入与缺失。饰（甲基化）或插入与缺失。（2） 识别部位间的片段插入与缺失。识别部位间的片段插入与缺失。（3） 识别部位间的重复序列数目的变化。识别部位间的重复序列数目的变化。 DNA限制性内切酶 restriction endonuclease 能够识别特定的能够识别特定的DNA序列，与序列，与DNA分子结合后在分子结合后在特定部位将特定部位将DNA双链切断的核酸水解酶。双链切断的核酸水解酶。（1）生物学功能：水解核酸的磷酸二酯键。）生物学功能：水解核酸的磷酸二酯键。（2）命名：根据微生物的种（第一个字母大）命

12、名：根据微生物的种（第一个字母大 写）、属（前二个字母小写）、变种第一个写）、属（前二个字母小写）、变种第一个 字母大写）、发现分离的顺序（罗马数字）。字母大写）、发现分离的顺序（罗马数字）。（3）分类：）分类： A：型：远离识别部位随即切割，非特异。型：远离识别部位随即切割，非特异。 B：型：在识别部位内部切割，特异。型：在识别部位内部切割，特异。 C：型：在识别部位后定点切割，特异。型：在识别部位后定点切割，特异。 单位：单位：1U：在标准条件下，：在标准条件下，1h完全水解完全水解1g噬菌噬菌体的酶量。体的酶量。 型型DNA限制性内切酶限制性内切酶： A：识别核酸序列数目：识别核酸序列数

13、目4-6个。个。 B：识别序列为回纹序列。：识别序列为回纹序列。 C：切割后产生的末端分为粘行末端与平：切割后产生的末端分为粘行末端与平 末端。末端。 例：例：Pst 5-CTGCAG-3 3-GACGTC-5 Hae 5-GGCC-3 3-CCGG-5分型法：分型法： RFLP标记是发展最早的DNA标记技术。RFLP技术主要包括以下基本步骤：DNA提取用限制性内切酶酶切DNA 、 用凝胶电泳分开DNA片段把DNA片段转移到滤膜上利用放射性标记的探针杂交显示特定的DNA片段（Southern杂交）和结果分析。 n特点A 无表型效应，RFLP标记的检测不受环境条件和发育阶段的影响。B RFLP标

14、记在等位基因之间是共显性的，因此在配制杂交组合时不受杂交方式的影响。C 在非等位的RFLP标记之间不存在上位效应，因而互不干扰D RFLP标记起源于基因组DNA的自身变异，在数量上几乎不受限制E DNA需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中。在植物分子标记辅助育种中需要将RFLP转换成以PCR为基础的标记。PCR-RFLPPCR-RFLP AnalysisTT: 55+68+135+241+302bp TT: 55+68+135+241+302bp CT: 55+68+135+241+302+543bpCT: 55+68+135+241+302+543bpCC: 55+68+135

15、+543bpCC: 55+68+135+543bp AA: 152+187+462bp AA: 152+187+462bp CA: 83+104+152+187+462bp CA: 83+104+152+187+462bp CC: 83+104+152+462bp CC: 83+104+152+462bp 微卫星标记技术微卫星标记技术真核生物基因组中广泛存在着串联重复序列。根据重复单位大真核生物基因组中广泛存在着串联重复序列。根据重复单位大小的不同，将重复序列分为三小的不同，将重复序列分为三 类：卫星序列、小卫星序列类：卫星序列、小卫星序列和微卫星序列。和微卫星序列。卫星卫星DNA: 序列重复

16、单位的长度最常见的是序列重复单位的长度最常见的是100300bp,有时可有时可达几千达几千bp,这些基元的拷贝数是这些基元的拷贝数是1000100000,形成很长的成形成很长的成串的重复结构串的重复结构.通常存在于异染色质，主要分布在着丝粒区通常存在于异染色质，主要分布在着丝粒区域。域。小卫星小卫星DNA:是一些重复单位在是一些重复单位在1060bp,总长度由几百到几千总长度由几百到几千个个bp串联重复序列串联重复序列,它主要存在于近端粒处它主要存在于近端粒处,在不同的个体间在不同的个体间存在着串联数目的差异存在着串联数目的差异,表现出高度的个体特异性表现出高度的个体特异性,且以孟德且以孟德尔

17、方式稳定地遗传和分离尔方式稳定地遗传和分离,通常又被称为通常又被称为DNA指纹指纹.该类可通该类可通过过RFLP的方法加以鉴别的方法加以鉴别.简单序列重复标记，简单序列重复标记，SSRn又称微卫星又称微卫星DNA(Micro-satellite DNA)DNA(Micro-satellite DNA)标记；标记；n属高度重复序列，重复单元属高度重复序列，重复单元26bp，如，如(CA)n、(AT)、(GGC)n等重复，重复区大多几十等重复，重复区大多几十几百几百bp，分散在基因组中，大多不存在于编码序列内，具，分散在基因组中，大多不存在于编码序列内，具有较高的多态性。有较高的多态性。呈现孟德尔

18、式遗传。呈现孟德尔式遗传。目前微卫星目前微卫星DNADNA已经发现了万余个位点。已经发现了万余个位点。TTCAGCTAGCTTTCAGCTAGCTCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGAGCTTGCAGCTTGCAAGTCGATCGAAAGTCGATCGAGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCTCGAACGTCGAACG一个家系的微卫星PCR检测结果SSR标记的主要特点标记的主要特点（1）数量丰富，广泛分布于整个基因组；）数量丰富，广泛分布于整个基因组；（2）具有较多的等位性变异；）具有较多的等位性变异；（3）共显性标记，可鉴

19、别出杂合子和纯合子）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；（4）实验重复性好，结果可靠；）实验重复性好，结果可靠；（5）由于创建新的标记时需知道重复序列两）由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，因此其开发有一定困难，费端的序列信息，因此其开发有一定困难，费用也较高。用也较高。微卫星微卫星DNA多态形成的机制多态形成的机制 微卫星位点由其核心序列微卫星位点由其核心序列(core sequence)和两和两侧的侧翼序列侧的侧翼序列(flanking sequence)共同构成共同构成,侧翼侧翼序列具有位点特异性序列具有位点特异性,而微卫星本身的重复数变异则而微卫星本身的重复数变异则提供了微

20、卫星位点产生多态性的基础提供了微卫星位点产生多态性的基础.重复数越大重复数越大,其其变异性也越大变异性也越大,等位基因数也越多等位基因数也越多. 引起微卫星位点发生突变的原因主要为引起微卫星位点发生突变的原因主要为“滑链错滑链错配配”（slipped-strand mispairing)。在。在DNA 复制合复制合成的过程中，新生链和模板链之间在微卫星重复区成的过程中，新生链和模板链之间在微卫星重复区域可能发生错配，使得一个或者几个重复单位形成域可能发生错配，使得一个或者几个重复单位形成环状，未能参与配对。如果未配对的重复单位位于环状，未能参与配对。如果未配对的重复单位位于新生链，则最终得到的

21、新生链未配对重复单位数目新生链，则最终得到的新生链未配对重复单位数目比模板链多。反之，如果未配对的重复单位位于模比模板链多。反之，如果未配对的重复单位位于模板链，则最终得到的新生链未配对重复单位数目比板链，则最终得到的新生链未配对重复单位数目比模板链少模板链少.微卫星的检测微卫星的检测n 1基因组基因组DNA制备制备n2微卫星微卫星DNA的扩增：反应总体积为的扩增：反应总体积为25L3SSR标记电泳检测：分标记电泳检测：分3个主要环节。个主要环节。1）电泳：）电泳： 采用采用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳,设恒定功率设恒定功率,预预电泳约电泳约30min后后,加扩增样品加扩增样品DN

22、A46L,电泳电泳4060min(视分子量大小及差异带的可辨度调整视分子量大小及差异带的可辨度调整电泳时间电泳时间)。 2）染色：）染色： SSR PCR扩增产物电泳之后用银染法来检扩增产物电泳之后用银染法来检测扩增产物测扩增产物,不仅可避免使用同位素不仅可避免使用同位素,而且分辨率很高而且分辨率很高,甚至能检测出甚至能检测出1ng以下的以下的DNA。3）统计分析：根据不同的研究目的）统计分析：根据不同的研究目的,应用相关软件进行应用相关软件进行分析。分析。基因型判定基因型判定n由于在变性胶中由于在变性胶中PCR产物是单链，并且不产物是单链，并且不受其碱基组成影响，因此，如果微卫星受其碱基组成

23、影响，因此，如果微卫星PCR产物两条互补链分子质量相近，在变性胶中产物两条互补链分子质量相近，在变性胶中纯合子为单带，杂合子为双带；如果微卫星纯合子为单带，杂合子为双带；如果微卫星PCR产物两条互补链分子质量相差较大，在产物两条互补链分子质量相差较大，在变性胶中纯合子为双带，杂合子为四条带。变性胶中纯合子为双带，杂合子为四条带。单核苷酸多态性单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism SNP)A. 定义定义n单核苷酸多态性单核苷酸多态性(SNP)主要是指在主要是指在基因组水平上由基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性序列

24、多态性。 不同个体间，基因组DNA某部位的 单核苷酸的变异。1996年，Lander报道了用单核苷酸多态性标记（single nucleotid polymorphism SNP）制备第三代遗传连锁图的遗传标记。nB. SNP在人类基因组中出现的频率SNP在人类基因组中广泛存在，平均每在人类基因组中广泛存在，平均每5001000个碱基对中个碱基对中就有就有1个，估计其总数可达个，估计其总数可达1700万个甚至更多。万个甚至更多。 There is one SNP in every 1000 bases leads to an estimate that any two individuals

25、differ by up to three million SNPs. 在基因组在基因组DNA中，任何碱基均有可能发生变异，因此中，任何碱基均有可能发生变异，因此SNP既有可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编既有可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。总的来说，位于编码区内的码序列上。总的来说，位于编码区内的SNP(coding sNP,cSNP)比较少，因为在外显子内，其变异率仅及周围比较少，因为在外显子内，其变异率仅及周围序列的序列的1/5。但它在遗传性疾病研究中却具有重要意义，因。但它在遗传性疾病研究中却具有重要意义，因此此cSNP的研究更受关注。的研究更受关注。nC.

26、 SNP检测方法目前已有多种方法可用于目前已有多种方法可用于SNP检测检测：直接测序直接测序.单链构像多态性单链构像多态性single strand conformationpolymorphism,SSCP).寡聚核苷酸特异的连接寡聚核苷酸特异的连接； DNA芯片以及芯片以及TaqMan系统等。系统等。但不管哪一种方法，首先必须进行靶序列的扩但不管哪一种方法，首先必须进行靶序列的扩增，然后才能进行其它检测。增，然后才能进行其它检测。nD. SNP用作遗传标记的优点n(1) SNP在人群中是二等位基因性的，在任何人群中其等位在人群中是二等位基因性的，在任何人群中其等位基因频率都可估计出来。基因

27、频率都可估计出来。n(2)它在基因组中的分布较微卫星标记广泛得多。它在基因组中的分布较微卫星标记广泛得多。n(3)与串联重复的微卫星位点相比，与串联重复的微卫星位点相比，SNP是高度稳定的，尤是高度稳定的，尤其是处于编码区的其是处于编码区的SNP(cSNP),而前者的高突变率容易引起而前者的高突变率容易引起对人群的遗传分析出现困难。对人群的遗传分析出现困难。n(4)部分位于基因内部的部分位于基因内部的SNP可能会直接影响产物蛋白质的可能会直接影响产物蛋白质的结构或基因表达水平，因此，它们本身可能就是疾病遗传结构或基因表达水平，因此，它们本身可能就是疾病遗传机制的候选改变位点。机制的候选改变位点

28、。n(5)易于进行自动化分析，缩短了研究时间。易于进行自动化分析，缩短了研究时间。单链构像多态性单链构像多态性single strand conformationpolymorphism,SSCP).n日本日本Orita等研究发现，单链等研究发现，单链DNA片段呈复杂的空间折叠构片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或少作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异

29、的单链单链DNA分子在聚丙烯酰分子在聚丙烯酰 胺凝胶中受排阻大小不同胺凝胶中受排阻大小不同.因此，因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常敏锐地，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开将构象上有差异的分子分离开.作者称该方法为单链构象多作者称该方法为单链构象多态性态性 (Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)分析分析.在随后的研究中，作者又将在随后的研究中，作者又将SSCP用于检查用于检查PCR扩增产物的基因突变，从而建立了扩增产物的基因突变，从而建立了PCR-SSCP技术，技术，进一步提高了检测

30、突变方法的简便性和灵敏性进一步提高了检测突变方法的简便性和灵敏性. n其基本过程是其基本过程是:PCR扩增靶扩增靶DNA;将特异将特异的的PCR扩增产物变性，而后快速复性，使之扩增产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链成为具有一定空间结构的单链DNA分子分子;将适量的单将适量的单 链链DNA进行非变性聚丙烯酰胺进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶电泳;最后通过放射性自显影、银染最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果或溴化乙锭显色分析结果.若发现单链若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断该

31、以判定该链构象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变片段中有碱基突变. nSSCP的结果断定的结果断定:由于在由于在SSCP分析中分析中非变性非变性PAG电泳电泳不是不是根据单链根据单链DNA分子和带电量分子和带电量 的大小来分离的，而是以单链的大小来分离的，而是以单链DNA片段空片段空间构象的立体位阻大小间构象的立体位阻大小来实现分离的，因此，这来实现分离的，因此，这种分离不能反映出分子量的大小种分离不能反映出分子量的大小。有时正常链与突变链的迁有时正常链与突变链的迁移率很接近，很难移率很接近，很难 看出两者之间的差别看出两者之间的差别.因此一般要求电泳因此一般要求电泳长度在长度在16-

32、18cm以上，以检测限为指标来判定结果以上，以检测限为指标来判定结果.检测限检测限是指突变是指突变DNA片段与正常片段与正常DNA片段可分辨的电泳距离差的片段可分辨的电泳距离差的最小值最小值.大于检大于检 测限则判定链的迁移率有改变，说明该测限则判定链的迁移率有改变，说明该DNA序列有变化，小于检测限则说明链之间无变化序列有变化，小于检测限则说明链之间无变化.例如，一般例如，一般检测限定为检测限定为3mm，那么当两带间距离在，那么当两带间距离在3mm以上，则说明以上，则说明两链之间有两链之间有 改变改变.另外检测限不能定的太低，否则主观因素另外检测限不能定的太低，否则主观因素太大，易造成假阳性

33、结果太大，易造成假阳性结果.另外，另外，SSCP 分析中其它条件，分析中其它条件，如如PCR产物的上样量，产物的上样量，PAG的交联度、以及胶的浓度等，的交联度、以及胶的浓度等，都应根据具都应根据具 体实验进行选择确定体实验进行选择确定.n一般一般SSCP图谱是二条单链图谱是二条单链DNA带，但有时有的带，但有时有的DNA片段可能只呈现一条片段可能只呈现一条SSDNA带，或者三条以带，或者三条以上，这主要是由于两条单链上，这主要是由于两条单链DNA之间存在相似的之间存在相似的 立体构象立体构象.有时三条以上的有时三条以上的SSCP图谱是由于野型图谱是由于野型DNA片段和突变型片段和突变型DNA片段共同存在的结果片段共同存在的结果.