农残分析12--农药残留的酶抑制法与免疫测定课件

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1、农残分析12-农药残留的酶抑制法与免疫测定农药农药(nngyo)残留的酶抑制法与免疫残留的酶抑制法与免疫测定技术测定技术第一页，共十六页。农残分析12-农药残留的酶抑制法与免疫测定6.1 酶抑制分析测定法酶抑制分析测定法 1951年年,Giang与与Hall应用有机磷和氨基甲酸酯农应用有机磷和氨基甲酸酯农药在体外对胆碱酯酶具有抑制作用的机理来测定其含药在体外对胆碱酯酶具有抑制作用的机理来测定其含量量. 1968年年Mendoza利用利用(lyng)薄层薄层-酶抑制技术测定酶抑制技术测定10种有机磷和氨基甲酸酯农药种有机磷和氨基甲酸酯农药,最小检出量可达纳克水平最小检出量可达纳克水平. 1975

2、年年Kramer与与Gamson用一种与靛酚乙酸酯相似用一种与靛酚乙酸酯相似的化合物的化合物,测定测定110g的各种有机磷酸酯化合物的各种有机磷酸酯化合物,与此同与此同时时,Zweig等也测定了甲萘威等农药等也测定了甲萘威等农药. 进入进入20世纪世纪80年代年代,人们开始以来源丰富人们开始以来源丰富,取材和制取材和制备都十分方便的备都十分方便的植物酶源植物酶源,建立薄层建立薄层-植物酯酶抑制方植物酯酶抑制方法法,为酶抑制法的进一步推广和应用创造了条件为酶抑制法的进一步推广和应用创造了条件.第二页，共十六页。农残分析12-农药残留的酶抑制法与免疫测定6.1.2 酶法检测原理酶法检测原理 有机磷

3、和氨基甲酸酯类农药有机磷和氨基甲酸酯类农药 对参与神经生理传递过程的乙对参与神经生理传递过程的乙酰胆碱酯酶酰胆碱酯酶AChE具有抑制作用具有抑制作用,使该酶的分解作用不能正使该酶的分解作用不能正常进行常进行,从而导致底物乙酰胆碱的积累从而导致底物乙酰胆碱的积累,影响动物正常的神影响动物正常的神经传导经传导,引起中毒引起中毒(zhng d)或死亡或死亡. 可将这一昆虫毒理学原理应用到农药残留检测中可将这一昆虫毒理学原理应用到农药残留检测中,如如果农产品样品提取液中不含有或含有很低的有机磷或氨果农产品样品提取液中不含有或含有很低的有机磷或氨基甲酸酯类农药基甲酸酯类农药,酶的活性就不被抑制酶的活性就

4、不被抑制,试样中加入的基质试样中加入的基质就被酶水解就被酶水解,或少部分水解或少部分水解, 水解产物与加入的显色剂反应产生水解产物与加入的显色剂反应产生颜色颜色;反之反之,如果试样提取液中含有一定量的有机磷或氨基如果试样提取液中含有一定量的有机磷或氨基甲酸酯类农药甲酸酯类农药, 酶的活性就被抑制酶的活性就被抑制,试样中加入的基质就不试样中加入的基质就不被酶水解被酶水解, 从而不显色或颜色很浅从而不显色或颜色很浅,用分光光度计测定吸光用分光光度计测定吸光度值度值,计算出抑制率计算出抑制率,就可判断出样品中农药残留情况就可判断出样品中农药残留情况.第三页，共十六页。农残分析12-农药残留的酶抑制法

5、与免疫测定6.1.3 酶源选择与提取酶源选择与提取 酶源选择是生物酶技术应用的基础酶源选择是生物酶技术应用的基础,其其性质的好坏性质的好坏,特异性大小特异性大小,稳定与否直接关系稳定与否直接关系到检测的结果到检测的结果. 在酶抑制检测的技术中在酶抑制检测的技术中,既有应用既有应用AChE的的,也有应用非特异性酯酶的也有应用非特异性酯酶的,其来源其来源既有动物的既有动物的,也有植物的也有植物的.6.1.4 底物和底物和 显色剂显色剂 酶抑制剂显色反应酶抑制剂显色反应(fnyng)可使用的底物和可使用的底物和显色剂很多显色剂很多,大致可分为以下几类大致可分为以下几类:第四页，共十六页。农残分析12

6、-农药残留的酶抑制法与免疫测定(1)乙酰胆碱乙酰胆碱-溴百里酚蓝显色溴百里酚蓝显色;(2) 乙酸乙酸-萘酯萘酯-固蓝固蓝B盐显色反应盐显色反应;(3)乙酸羟基吲哚显色法乙酸羟基吲哚显色法;(4)乙酸靛酯显色法乙酸靛酯显色法;6.1.5 检测方法检测方法(1)比色法比色法: 我国农业部农药我国农业部农药(nngyo)检定所利用检定所利用酶抑制产生的显色反应酶抑制产生的显色反应,通过分光光度计比通过分光光度计比色测定酶的抑制率色测定酶的抑制率,以测定有机磷和氨基甲以测定有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量酸酯类农药残留量.第五页，共十六页。农残分析12-农药残留的酶抑制法与免疫测定(2)酶片法酶片法:

7、酶片即为浸渍有胆碱酯酶或其他敏感酶类的滤酶片即为浸渍有胆碱酯酶或其他敏感酶类的滤纸或类似载体物质纸或类似载体物质.(3)固相酶速测技术固相酶速测技术6.2 免疫检测技术免疫检测技术 免疫分析概述免疫分析概述 当细菌、病毒和有害物等病原入侵时当细菌、病毒和有害物等病原入侵时,能产生抵御外来能产生抵御外来物的抗体，这就是动物的免疫反应物的抗体，这就是动物的免疫反应(fnyng)，致病的外，致病的外来物称为抗原。来物称为抗原。 免疫分析是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应免疫分析是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析技术。为基础的分析技术。第六页，共十六页。农残分析12-农药残留的酶抑

8、制法与免疫测定酶联免疫吸附测定法酶联免疫吸附测定法(ELISA) 原理是在测定过程，样品提取液中的农药与已知数原理是在测定过程，样品提取液中的农药与已知数量的酶联剂竞争有限数量的抗体量的酶联剂竞争有限数量的抗体(kngt)吸附位点。吸附位点。 为了观察测定结果，往往加入底物和显色剂，以为了观察测定结果，往往加入底物和显色剂，以产生颜色变化。根据样品颜色和标准物质颜色的吸光产生颜色变化。根据样品颜色和标准物质颜色的吸光度之差就可计算出样品中农药的含量度之差就可计算出样品中农药的含量. 农药残留免疫分析方法的建立，一般包括待测农药的农药残留免疫分析方法的建立，一般包括待测农药的选择、半抗原合成、人

9、工抗原合成、抗体制备和样品前选择、半抗原合成、人工抗原合成、抗体制备和样品前处理方法等几个步骤处理方法等几个步骤.第七页，共十六页。农残分析12-农药残留的酶抑制法与免疫测定(1)直接直接ELISA原理原理: 是在抗原与抗体发生反应后，直接进行显色的非是在抗原与抗体发生反应后，直接进行显色的非均相固相反应免疫分析方法。均相固相反应免疫分析方法。 1类类:首先将抗原固定在聚苯乙烯反应板孔内壁，然首先将抗原固定在聚苯乙烯反应板孔内壁，然后加入后加入待测抗原待测抗原和和酶标记酶标记(bioj)抗体，固相抗原与待测游离抗体，固相抗原与待测游离抗原竞争抗原竞争有限量有限量的酶标记抗体，反应后洗去可溶性的

10、的酶标记抗体，反应后洗去可溶性的游离抗原与抗体的结合物，加入酶作用底物，测定固游离抗原与抗体的结合物，加入酶作用底物，测定固相抗原与抗体结合物上的酶活性，便可得到待测抗原相抗原与抗体结合物上的酶活性，便可得到待测抗原的量。酶反应活性与待测抗原的量呈负相关的量。酶反应活性与待测抗原的量呈负相关.第八页，共十六页。农残分析12-农药残留的酶抑制法与免疫测定2类: 首先固定抗体，然后同时加入待测抗原首先固定抗体，然后同时加入待测抗原(kngyun)和酶标和酶标记抗原记抗原(kngyun)，待测抗原，待测抗原(kngyun)与酶标记抗原与酶标记抗原(kngyun)竞竞争争有限量有限量的固相抗体，反应后

11、测定固相抗体与酶标记的固相抗体，反应后测定固相抗体与酶标记抗原结合物上的酶活性，便可得到待测抗原的量。抗原结合物上的酶活性，便可得到待测抗原的量。 酶活性强度与待测抗原呈负相关。酶活性强度与待测抗原呈负相关。(2) 间接间接ELISA原理原理 首先固定抗原，然后加入待测抗原和抗体，固相抗原首先固定抗原，然后加入待测抗原和抗体，固相抗原与待测抗原竞争有限的第一轮抗体，反应后洗去游离的与待测抗原竞争有限的第一轮抗体，反应后洗去游离的结合物，再加入酶标记的第二抗体结合物，再加入酶标记的第二抗体(以第一抗体为抗原的以第一抗体为抗原的酶标记抗体酶标记抗体)，反应后吸取酶标记的游离抗体，测定结，反应后吸取

12、酶标记的游离抗体，测定结合物上的酶活性。酶活性与待测抗原浓度呈负相关。合物上的酶活性。酶活性与待测抗原浓度呈负相关。第九页，共十六页。农残分析12-农药残留的酶抑制法与免疫测定(3)半抗原的制备 抗原是指一切能刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞，抗原是指一切能刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞，并能与之结合发生特异性免疫反应的物质。并能与之结合发生特异性免疫反应的物质。 抗原具有抗原具有免疫原性免疫原性和和反应原性反应原性。 免疫原性免疫原性是指能刺激机体产生抗体或能诱导机体产是指能刺激机体产生抗体或能诱导机体产生免疫应答反应；生免疫应答反应； 而而反应原性反应原性是指能与其是指能与其(yq)诱导产生

13、的抗体或致敏诱导产生的抗体或致敏淋巴细胞进行反应的特性。淋巴细胞进行反应的特性。 既具有免疫原性反又具有反应原性的抗原称为既具有免疫原性反又具有反应原性的抗原称为完全完全抗原抗原, 而只具有而只具有反应原性反应原性而没有免疫原性的抗原称为而没有免疫原性的抗原称为不完不完全抗原全抗原,也称也称半抗原半抗原.第十页，共十六页。农残分析12-农药残留的酶抑制法与免疫测定(4)人工免疫抗原的合成人工免疫抗原的合成 首先将半抗原活化，然后通常是在条件温和的水溶首先将半抗原活化，然后通常是在条件温和的水溶液中将半抗原与载体蛋白共价结合。液中将半抗原与载体蛋白共价结合。 如半抗原分子含有羧基，可用碳二亚胺法

14、或混合如半抗原分子含有羧基，可用碳二亚胺法或混合酸酐法，如具有羟基活性基团则采用琥珀酸酐法酸酐法，如具有羟基活性基团则采用琥珀酸酐法.(5)农药农药(nngyo)抗体制备抗体制备 农药抗体是经由小分子农药与大分子载体偶联后的农药抗体是经由小分子农药与大分子载体偶联后的复合物复合物免疫动物使机体产生抗农药的抗体，并取其免免疫动物使机体产生抗农药的抗体，并取其免疫动物血清，然后进行分离、鉴定其特异性而得到的。疫动物血清，然后进行分离、鉴定其特异性而得到的。农药抗体的产生一般可采用两种途径农药抗体的产生一般可采用两种途径.第十一页，共十六页。农残分析12-农药残留的酶抑制法与免疫测定1)多克隆抗体技

15、术多克隆抗体技术 多克隆抗体是由许多多克隆抗体是由许多B淋巴细胞克隆产生的混合抗体淋巴细胞克隆产生的混合抗体.2)杂交瘤技术生产单抗杂交瘤技术生产单抗 单克隆抗体是指由一个单克隆抗体是指由一个B淋巴细胞分化增殖的浆细胞产生淋巴细胞分化增殖的浆细胞产生的针对单一抗原决定簇的抗体的针对单一抗原决定簇的抗体.(6)ELISA方法的选择方法的选择分为五种类型分为五种类型:1)酶标抗原直接竞争抑制法酶标抗原直接竞争抑制法;2)酶标抗体直接竞争抑制法酶标抗体直接竞争抑制法;3)酶标抗体间接酶标抗体间接(jin ji)竞争抑制法竞争抑制法;4)抗体夹心法抗体夹心法; 5)间接夹心法间接夹心法第十二页，共十六

16、页。农残分析12-农药残留的酶抑制法与免疫测定(7)实验条件的选择实验条件的选择 必须注意以下几个方面必须注意以下几个方面: 1)确定酶结合的最适浓度确定酶结合的最适浓度. 2) 确定包被确定包被(bo bi)物质的最适浓度物质的最适浓度. 3)样品往往会产生交叉反应样品往往会产生交叉反应. 4)样品前处理时样品前处理时,使用的溶液必须考虑其影响抗体对分使用的溶液必须考虑其影响抗体对分析物识别的可能性析物识别的可能性.(8)ELISA法的特点法的特点: 1)适用现场快速筛选适用现场快速筛选; 2)适用常规方法难以检测的农药适用常规方法难以检测的农药; 3)适用环境监控适用环境监控.第十三页，共

17、十六页。农残分析12-农药残留的酶抑制法与免疫测定6.3 生物传感器在农药残留检测中的应用6.3.1 生物传感器的原理生物传感器的原理 生物传感器是指由一种生物敏感部件与转换器紧生物传感器是指由一种生物敏感部件与转换器紧密配合密配合,对特定种类物质或生物活性物质具有选择性和对特定种类物质或生物活性物质具有选择性和可逆响应的分析装置可逆响应的分析装置. 传感器的生物敏感层与复杂样品中特定的目标分析传感器的生物敏感层与复杂样品中特定的目标分析物之间物之间,如酶与底物如酶与底物,抗原与抗体抗原与抗体,外源凝集素与糖外源凝集素与糖,核酸与核酸与其互补片段之间的识别反应其互补片段之间的识别反应(fnyn

18、g)会产生一些物理化学信会产生一些物理化学信号的变化号的变化,这些变化通过不同原理的传感器转换成这些变化通过不同原理的传感器转换成第二信第二信号号,经放大后显示记录经放大后显示记录.第十四页，共十六页。农残分析12-农药残留的酶抑制法与免疫测定6.3.2 电化学生物传感器测定农药残留电化学生物传感器测定农药残留 生物传感器中信号的测量主要有电化学和光化学两种生物传感器中信号的测量主要有电化学和光化学两种.电化学生物传感器可分为电位型和安培型两种电化学生物传感器可分为电位型和安培型两种.免疫传感器免疫传感器 是利用抗体是利用抗体(kngt)与抗原之间的免疫化学反应与抗原之间的免疫化学反应.第十五页，共十六页。农残分析12-农药残留的酶抑制法与免疫测定内容(nirng)总结农药残留的酶抑制法与免疫测定技术。原理是在测定过程(guchng)，样品提取液中的农药与已知数量的酶联剂竞争有限数量的抗体吸附位点。抗原是指一切能刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞，并能与之结合发生特异性免疫反应的物质。首先将半抗原活化，然后通常是在条件温和的水溶液中将半抗原与载体蛋白共价结合。4)样品前处理时,使用的溶液必须考虑其影响抗体对分析物识别的可能性.。是利用抗体与抗原之间的免疫化学反应.第十六页，共十六页。