酶法解析PPT课件

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1、酶分析法： 酶活力测定（酶研究的一部分） 酶法分析（酶作为分析的工具） 前者的目的在于检知样品中某种前者的目的在于检知样品中某种酶的含量或活性，后者则主要用于测酶的含量或活性，后者则主要用于测定与生物学有关的样品中酶以外其它定与生物学有关的样品中酶以外其它物质的含量物质的含量。两者检测对象不同，但原理基本一致：酶的专一性、高效性，通过酶反应速度测定物质的变化进行定量分析。第1页/共85页 酶分析 （Enzyme AssayEnzyme Assay） 以酶为分析对象，目的是检测食品、药物体液等生物样品中酶的含量或活性；如：血液中谷丙转氨酶、淀粉酶等测定； 葡萄糖氧化酶生产发酵液中葡萄糖氧化酶活

2、力测定等； 第2页/共85页 酶法分析（ENZYME ANALYSISENZYME ANALYSIS） 酶法分析是一种以酶为分析工具（分析试剂）的分析法，分析的对象可以是底物、辅酶、活化剂、酶抑制剂。主要用于测定与生物样品有关的样品中酶以外其他物质的含量。 常用于食品、药物、体液等样品中成分含量检测如血糖、胆固醇等测定。第3页/共85页第一节、酶活力的测定一、酶活力测定（一）基本定义第4页/共85页二、 酶活力（一） 酶活力 酶活力activity： 酶催化一定化学反应的能力。用酶催化的反应速度来表示酶活力，即用单位时间内，单位体积中底物的减少量或产物增加量来表示。 转换频率：单位时间转化的底

3、物分子数。 Kcat,单位1/s第5页/共85页（二）酶活力单位及比活力 酶活力单位U（active unit）：是根据某种酶在最适条件下，单位时间内被酶作用的底物的减少量或产物的生成量来规定的，表示酶活力高低。 IU：umol/min Kat：mol/s 1 Kat=6107 IU 酶的比活力 指每mg酶蛋白（或每mg蛋白氨）所含的酶活力单位数即：比活力=活力单位数/酶蛋白（氮）mg 表示酶制剂的纯度，比活力愈高，酶愈纯。 第6页/共85页（二）测定方式有二： 1.测定一定时间内的化学反应的量 通常测定在一定时间内最适于酶的条件下酶促反应产物的生成量。 如蛋白酶的活力，可据酶催化酪蛋白水解生

4、成的酪氨酸与酚试剂作用蓝色反应，再用比色法测定之。 2. 测定完成一定量反应所需的时间，测定酶所催化的一定量底物的减少或一定量产物的生成所需的时间，酶活力与之成反比。第7页/共85页 测酶活力就是在确定的最适反应条件下测定酶促反应速度， 酶促反应速度取决于那些因素 ？速度方程第8页/共85页 测定酶活力的基本要求：1 1、要使反应系统中除待测酶浓度是影响反应速度的唯一限制性因素（反应速度定量酶活力）；2 2、其余一切均应最适合于酶发挥作用（表现最大能力）； 所以，要建立一个酶活力测定方法，要针对以下几方面做工作： 底物？ pHpH？ 温度？ 样品？第9页/共85页二、测定中应注意的问题1.初速

5、度第10页/共85页第11页/共85页底物浓度对酶速的影响第12页/共85页第13页/共85页第14页/共85页 浓度选择： a a） s=100Kms=100Km； b b） 有时不宜采用高底物浓度（有 毒性、价高、溶解度小、抑制 酶反应等) )则根据具体条件，通 过实验选一适当浓度。 第15页/共85页第16页/共85页第17页/共85页第18页/共85页第19页/共85页第20页/共85页第21页/共85页第22页/共85页第23页/共85页 作用于待测酶产物的其它酶； （如腈水合酶与酰胺酶） 其它因素。第24页/共85页第25页/共85页 空白是指待测酶反应以外的其它反应（杂酶、自发反

6、应）引起的变化量 空白值可通过不加底物、不加酶、或两者都加而预先使酶失效而测定 例如： GPT GPT 测定中 先不加底物； 酸性磷酸酯酶中 先不加酶； 对照是指用标准酶（或纯酶）测得的结果，与样品酶对照来定量。第26页/共85页三 酶活力的测定方法（一）终止法 是使酶促反应进行一定时间后，终止其反应，再用化学或物理方法测定产物或底物变化的量。第27页/共85页第28页/共85页第29页/共85页三 酶活力的测定方法（二）动力学法 是连续测定酶反应过程中底物、产物或辅酶的变化量，可以直接测定酶促反应的初速度。第30页/共85页第31页/共85页第32页/共85页第33页/共85页第34页/共8

7、5页第35页/共85页三 酶活力的测定方法（三）酶偶联法 指选择另一种酶与酶发生偶联反应，即第一种酶E1所催化的产物作为E2的底物，通过测定第二个酶促反应产物的量变化来测的活力，此法适用于活力不高或所催化产物不便测定的一些酶活力测定。第36页/共85页第37页/共85页 A B CE1E2 被测反应的产物是某脱氢酶的底物, ,即B B是脱氢酶E2E2的底物, ,测定系统中加入足量的脱氢酶E2E2和NADHNADH, ,使反应进行到C C, ,然后通过NADHNADH的特征变化而测知。 G + ATP G-6-P + ADPHK被测反应：偶联指示反应：G-6-P+NADPNADPH+6-PGCO

8、OH（关键是工具酶的专一、高纯、且过量，以保证被测反应的v v是总反应系统中的限速因子，测得的指示反应速度 和E1E1浓度间呈线性关系）G6PDH第38页/共85页第39页/共85页第40页/共85页第41页/共85页第42页/共85页举例：-淀粉酶活力测定1.标准碘液法 原理：淀粉对碘呈蓝黑色的特异性逐渐消失，消失的速率与酶活性有关。方法：终止法 稀盐酸 测吸光度2.DNS法-淀粉酶可随机地作用于淀粉中的-1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。方法：终止法 热变性 测吸光度第43页/共85页第二节酶法分析第44页/共85页 在进行

9、酶法分析时，先要根据分析对象选择适它的“工具酶”，然后再通过酶反应的测定，并借助相应的校正曲线来检知它们的浓度或含量。在上述几种检测对象中，除了底物可以采用总变量分析法（终点法）外，其它都只能用动力学分析法。第45页/共85页第46页/共85页第47页/共85页条件：条件： 和酶活力测定的基本相同，但其和酶活力测定的基本相同，但其所用的酶量必须一定，除了相应的被所用的酶量必须一定，除了相应的被测因素的浓度应控制在限速水平以外，测因素的浓度应控制在限速水平以外，其它反应成份均须保证处于恒定和最其它反应成份均须保证处于恒定和最适。适。第48页/共85页应用时应考虑两个问题，即工具酶的用量与反应的平

10、衡点。第49页/共85页 终点法要操作中应注意：终点法要操作中应注意： (1)(1)被测的底物浓度必须十分小，并控制反被测的底物浓度必须十分小，并控制反应于应于1 1级反应水平。因为这样可以使反应迅速级反应水平。因为这样可以使反应迅速达到平衡点防止过多的产物生成，避免逆反达到平衡点防止过多的产物生成，避免逆反应；减少工具酶的用员。应；减少工具酶的用员。 (2)(2)其它因素应尽量处于最适水平，双底物其它因素应尽量处于最适水平，双底物反应的另一底物应具有足够高的浓度。反应的另一底物应具有足够高的浓度。 (3)(3)酶的用量要高，以保证反应较快地达到酶的用量要高，以保证反应较快地达到终点。终点。第

11、50页/共85页第51页/共85页第52页/共85页第53页/共85页第54页/共85页第55页/共85页第56页/共85页（三）、酶法分析包括两个步骤： 1.酶反应 在适宜的条件下进行催化反应 2.检测 测定反应前后物质的变化情况，可以测定底物的减少、产物的增加或辅酶的变化第57页/共85页（四）酶法分析分类1.单酶反应定量 使用单一酶与底物反应，然后测出物质前后变化，确定底物的量。2.偶联酶反应定量 利用两种或以上酶的联合作用，使底物通过两步或多步反应，转化为易于检测的产物，从而测定被测物质的量。 单酶反应的底物或产物不便用常规方法检测时。第58页/共85页第59页/共85页 三、酶标免疫

12、分析法 Enzyme Immunoassay (EIA) 在7070年代初，从放射免疫分析发展起来的一种称为“酶标免疫”的分析方法，它是将免疫学的专一性和酶的高效催化能力有机地结合在一起，建立的一种高度特异、灵敏的分析方法。 第60页/共85页 放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA)(Radioimmunoassay,RIA)是用放射性同位素标记抗原AgAg* *，该抗原与未标记抗原AgAg竞争结合抗体(Ab)(Ab)结合位点时的能力相同，所以反应生成的AgAg* *-Ab-Ab复合物与AgAg的量呈负相关。AgAg* *-Ab-Ab的生成量可通过测定其放射活性得到，然后根据

13、已知浓度抗原的标准曲线就可以计算出样品中抗原浓度，这种分析方法称为放射免疫分析。 第61页/共85页第62页/共85页 优点：不需要特殊复杂的设备和仪器灵敏度高重复性好对健康无害第63页/共85页第64页/共85页第65页/共85页第66页/共85页第67页/共85页第68页/共85页第69页/共85页第70页/共85页第71页/共85页 应用前景食品卫生环境污染生化指标临床医学第72页/共85页“瘦肉精”快速检测新技术 竞争酶标免疫法 “瘦肉精”（学名盐酸克伦特罗）为一种人工合成的作用于肾上腺受体的兴奋剂，常用来防治哮喘、肺气肿等肺部疾病，当其应用剂量达到治疗量的5 51010倍时，可使肌肉

14、合成增加，脂肪沉积减少，因此将其俗称为“瘦肉精”。第73页/共85页 当人们食用含有残留的肉品（特别是内脏）后常造成心动过速，低血钾，低磷酸盐血症，肌肉震颤，头晕，口干，失眠甚至瘫痪等中毒症状，重则引起人的死亡。 色谱分析法一直是用作检测“瘦肉精”的方法，但是昂贵的设备及复杂的前处理工作不适用于基层的快速检测，而采用竞争酶标免疫检测试剂盒则可经济、快速地检测（100100个样品3 3个小时）。 第74页/共85页 海洋污染生化指标研究 金属硫蛋白酶免疫法 原理： 金属硫蛋白是一种能被重金属诱导的富含半胱氨酸的低分子量蛋白质。当环境存在着诸如汞、银、铅、镉等重金属时，便能诱导生物体内金属硫蛋白的

15、合成，且在一定浓度范围内成正比。因此，海洋生物体内的金属硫蛋白可作为重金属污染的指标来研究。 第75页/共85页 试验内容：试验内容：筛选了对镉敏感的底栖鱼类筛选了对镉敏感的底栖鱼类, ,并确定了镉诱导并确定了镉诱导鱼金属硫蛋白的最适诱导条件。鱼金属硫蛋白的最适诱导条件。从镉诱导的鱼肝脏分离纯化金属硫蛋白并对从镉诱导的鱼肝脏分离纯化金属硫蛋白并对某些性质（氨基酸组成、分子量、等电点等）某些性质（氨基酸组成、分子量、等电点等）进行研究。进行研究。纯化的金属硫蛋白对兔进行免疫，兔抗血清纯化的金属硫蛋白对兔进行免疫，兔抗血清纯化后并标记辣根过氧化酶，纯化后并标记辣根过氧化酶，ELISA法测定法测定金

16、属硫蛋白。金属硫蛋白。第76页/共85页 非典型肺炎ELISAELISA检测技术 酶联免疫吸附分析的特点是特异性强、反应灵敏、检出率高，是世界卫生组织(WHO)(WHO)推荐的病原抗体临床检测的主要方法。第77页/共85页 检测方法： 当人体被“非典”病毒感染并产生抗体之后，即用病人的血清( (抗体) )与检测试剂进行反应，呈阳性反应的说明受试者已受病毒感染。 但对于发病早期还未产生抗体的病人，阴性结果也不能说明受试者未受病毒感染。仍需进行跟踪检测，如果超过“非典”潜伏期之后仍没有检测出抗体则可排除患病的可能。所以，在ELISAELISA法中，有IgMIgM，IgGIgG两种抗体产生的患者即可

17、确定为“非典”感染者。而对阴性结果仍需进行跟踪检测。第78页/共85页 在对SARSSARS这种高传染性疾病的斗争中， ELISAELISA能够作出快速的检测，尽量缩短具传染性的病人与人群的接触。第79页/共85页 综上所述，酶标免疫分析法具有广阔的应用前景，这需要我们去逐步开发！第80页/共85页酶标仪酶标仪 即酶联免疫检测仪，是酶联免疫吸附即酶联免疫检测仪，是酶联免疫吸附试验的专用仪器。可简单地分为半自动和试验的专用仪器。可简单地分为半自动和全自动全自动2 2大类，但其工作原理基本上都是大类，但其工作原理基本上都是一致的，其核心都是一个比色计一致的，其核心都是一个比色计, ,即用比即用比色

18、法来分析抗原或抗体的含量。色法来分析抗原或抗体的含量。 ELISA ELISA测测定一般要求测试液的最终体积在定一般要求测试液的最终体积在250u l250u l以以下，用一般光电比色计无法完成测试，因下，用一般光电比色计无法完成测试，因此对酶标仪中的光电比色计有特殊要求。此对酶标仪中的光电比色计有特殊要求。第81页/共85页第82页/共85页 四四 酶循环分析法酶循环分析法 酶循环分析法是在上述酶分析基础上，酶循环分析法是在上述酶分析基础上，为适应神经生化等定量测定单个神经细胞为适应神经生化等定量测定单个神经细胞中的酶及其它微量物质的需要，通过两种中的酶及其它微量物质的需要，通过两种相关的酶反应组合、放大而发展起来的一相关的酶反应组合、放大而发展起来的一种超微量分析法，它具有极高的灵敏度，种超微量分析法，它具有极高的灵敏度，可测定可测定10-1510-15克分子水平的生物物质。克分子水平的生物物质。第83页/共85页 原理原理：酶循环分析法是利用在专一性上：酶循环分析法是利用在专一性上相互关联的两种酶反应相互组合、循环，相互关联的两种酶反应相互组合、循环，使微量的酶活性或其它物质增幅放大以达使微量的酶活性或其它物质增幅放大以达到定量测定目的的分析方法。到定量测定目的的分析方法。第84页/共85页感谢您的观看！第85页/共85页