MMP和NFκB在肺癌组织中的表达及相关性分析

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1、原创性声明木人郑重声明：本人所呈交的学位论文，是在导师的指导下独立 进行研究所取得的成果。学位论文中凡引用的他人已经发表或未发表 的成果、资料、观点等，均已明确注明出处。除文中已经注明引用的 内容外，不包含任何其个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对 本文的研究成果做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式 标明。本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：3呈垒盐：。日期：狸!量：皇!z呈关于学位论文使用授权的声明本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归 属兰州大学。本人完全了解兰州大学有关保存、使用学位论文的规定， 同意学校保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电

2、子版， 允许论文被查阅和借阅；本人授权兰州大学可以将本学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用任何复制手段保存和 汇编本学位论文。本人发表、使用学位论文或与论文直接相关的学术 论文或成果时，第一署名单位仍然为兰州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名：匿盟彗：导师签名蘧塑至茎日期：地生墨!尘：丛II兰州大学硕士学位论文姗一9和NFK B在肺癌组织中的表达及相关性分析摘要目的探讨基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase一9，MMP9)和核 转录因子(Nuclear factor ofkappa B，NFK B)在肺癌组织中的表达及相关性。 材

3、料与方法：标本取自2004年6月2007年5月兰州大学第二医院、甘肃省肿 瘤医院胸外科住院手术切除及气管镜活检的标本，经病理确诊为原发性支气管肺 癌79例，男54例，女25例；年龄2773岁，中位年龄57岁。本实验的组织标本中小细胞肺癌(SCLC)21例(男14例，女7例)，鳞癌34例(男31例，女3例)， 高分化8例，中分化14例，低分化12例，腺癌20例(男9例，女11例)，高分化5 例，中分化10例，低分化5例，大细胞癌4例(男3例，女1例)，均为未分化。临 床分期：依据2002年国际抗癌联盟(UICC)TNM分期标准，I期16例(Ia 4例，Ib 12 例)，II期21例(IIa4例，

4、IIb 17例)，III期41例(IIIa 33例，IIIb 8例)，IV期l 例。有淋巴结转移组49例，无淋巴结转移组30例。所有患者术前均未接受化疗、 放疗和其它治疗。以非肿瘤性肺组织标本(肺炎18例，肺结核12例，炎性假瘤lO 例)40例作为对照组，男28例，女12例，年龄2668岁，中位年龄46岁。方法： 所有标本经10甲醛溶液固定，石蜡包埋，制成厚4 u m的切片，采用SP法进行 NFK B、MMP9免疫组化染色。结果判断：细胞浆或细胞核中见清晰棕黄色颗 粒者为NFK B和MMP9阳性表达细胞。根据每张切片的阳性细胞显色深浅及阳 性细胞比率计分，(1)显色深浅：不显色为0分；浅黄色1

5、分；棕黄色2分：深褐 色3分。(2)阳性细胞百分率：无阳性细胞显色0分；阳性细胞显色50为3分。二者得分相加：O分为阴性(一)；12分为弱阳性(+)；3-4分为阳性(+)；5“分为强阳性(十H)。 结果：肿瘤组织中NFK B和MMP9蛋白阳性表达呈棕黄色颗粒状，前者主要位于细胞质，部分位于细胞核。后者弥漫分布于细胞浆，部分位于细胞核。 在正常肺组织中仅见细胞浆中散在分布，细胞核中则无表达。NFK B和MMP9 在肺癌组织中高表达，阳性率分别为6582和6962，正常肺组织中表达较低， 阳性率分别为1750和1250，二者相比差异显著。NFK B和MMP9的表达与 患者的年龄、性别无关(P005

6、)，而与肿瘤的组织类型、临床分期、分化程 度及是否伴有淋巴结转移密切相关，在肺癌组织中NFK B、MMP9表达在淋巴兰州大学硕士学位论文结转移组、IIIIV期及低分化癌组织中的阳性表达显著高于非淋巴结转移组、III 期及高分化组的表达， (P005)。在肺癌组中，NFK B与MMP9Z者均阳性 表达46例，二者均阴性表达16例，二者呈正相关关系。结论：根据NFK B和MMP9在不同类型肿瘤中表达的差异，有可能将其用 于肺癌与非肺癌、小细胞肺癌与非小细胞肺癌及腺癌的鉴别诊断，NFK B和 MMP9也有望成为判断肺癌预后的指标之一。关键词：肺癌；基质金属蛋白酶9；核因子K B(P65)：免疫组织化

7、学2兰州大学硕士学位论文Expressions and relationship of matrix metaUoproteinase一9 and Nuclear factor of kappa B in human lung cancerAbstractobjectiveTo investigate the expression，clinical significance and relationship of matrix metalloproteinase-9(MMP一9)and Nuclear factor of kappa B(NFK B)in human lung cancer t

8、issueMethodsThe expression of MMP一9，NFK B in 79 cases of lung cancer and 40 cases of nocancerous lung disease were assessed by immunohistochemistry，and their correlations with cliniopathological factors were statistically analyzedResultsThe positive rate of MMP一9，NF-K B was 6962， 6582in lung cancer

9、and 1250，1 750(p005)in nocancerous lung disease respectivelyThe expression of MMP-9 and NFK B correlated with TNM stages and lymph node metastasisThat of MMP-9correlated with differentiation of lung cancer(pO05)In addition，the expression of NFK B had a positive correlation with the expression of MMP

10、一9(FO5 13，p001)ConclusionThe high expression of MMP-9 and NFK B may bepresent in lung cancer tissuesThe high positive rate of MMP一9 and NF K B may correlate to malignant degree and lymph node metastasis NFK B may promote invasion and metastasis of lung cancer through up regulating the expression of

11、MMP-9The expression of MMP一9 and NF兰州大学硕十学位论文K B may help to judge invasion and metastasis lung cancerKey wordsLung cancer；matrix metalloproteinase一9；Nuclearfactor of kappa B；immunohistochemistry4兰州大学硕士学位论文_J-_-_翩青肺癌是当今世界各地最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在男性居恶 性肿瘤的第一位，女性居第二位。虽然近年来其诊疗技术取得了长足的进步，但 肺癌患者的生存率并未得到明显提高

12、，肿瘤细胞的侵袭和转移是恶性肿瘤致死的 主要原因，因而揭示肿瘤转移的机制，预测肿瘤的转移潜能，将有助于判断预后 和选择合理有效的治疗方案，延长患者的生存期，提高生活质量。已有研究表明， 肿瘤组织及其间质的基底膜是肿瘤细胞浸润扩散过程中的一道天然屏障。正常基 底膜是由IV型胶原等成分构成，为一致密的网状结构，固有细胞不能正常通过。 MMP9是降解型胶原最主要的酶。研究发现，在多种恶性肿瘤中存在着MMP9的高表达。NFK B(p65是NFK B活性形式中具有转录启动作用的主要成分) 是一类重要的细胞转录因子，参与多种细胞增殖、凋亡相关基因的转录调控。 在许多恶性肿瘤的发生及转移过程中发挥了重要作用

13、。Huang等【11研究显示， NFK B的抑制信号能有效的抑制高转移性前列腺癌PC23细胞的血管内皮生 长因子(VEGF)、IL8和细胞外基质金属蛋白酶9(MMP9)3种主要前血管生 成分子的表达，减少肿瘤血管的生成，抑制肿瘤的侵袭、转移，同时还可通过上 调基质金属蛋白酶9(MMP9)的表达活性影响肿瘤的侵袭转移。因此两者近年来成为肿瘤发生、发展及浸润、转移研究中的热点。一MMP9与肿瘤基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPS)是重要的金属酶之一， 最早是由Gss和Lapiere在研究蝌蚪形态变化时发现的。MMPS家族至今已发现 26个成员，按其作用底物可分

14、为4类：胶原酶、明胶酶、基质溶解酶、膜型酶。 其中明胶酶只有两种MMP2(明胶酶A)和MMP9(明胶酶B)，这两种酶通常 在中性PH值下发挥作用，并依赖金属锌离子，有钙离子参与时活性最大。这种 酶主要功能是分解细胞外基质，参与人体许多生理和病理过程【2一钉，该酶在体内 可广泛表达【5。MMP9是MMPS家族成员之一，分子量为Mr92103，其基本结构包括信 号肽区、N一末端前肽区、催化基团区、C一末端血红素结合蛋白样区和铰链区，前 肽区的主要作用是保持酶的稳定性。其命名方式有依作用底物名称法和数字编号 法，根据作用底物删P一9又叫明胶酶B，依据发现的先后顺序MMP9又名基质金兰州大学硕士学位论

15、文属蛋白酶一9。人的MMP-9基因长77Kb，含13个外显子。1994年Reponen和SahIberg 首次描述了在小鼠胚胎发育中破骨细胞MhdP9的表达。大量研究表明MMP9存 在于多种生物体内，并且表达于多种细胞。明胶酶主要来源于单核细胞、巨噬细 胞、角化细胞、中性粒细胞、成纤维细胞、破骨细胞、软骨细胞、内皮细胞和各 种肿瘤细胞等【67J。NLMP9的主要作用是在人体正常PH值时，在金属锌离子作用下，参与细胞 外基质的降解与重建，故又称基质因子。在正常生理情况下，能够切断任何细胞 外基质成分，调节细胞粘着；作用于细胞外成分或其它蛋白成分而启动潜在生物 学功能；直接或间接的参与胚胎发育、组

16、织模型再塑及创伤修复的生物学功能。 金属锌离子在该酶中起到稳定酶的构象，参与催化反应，传递电子，并在酶与底 物间起桥梁作用，中和阴离子，降低反应中的静电斥力的作用。此外，钙离子可 以调节其表达，Muk hopadhyay等在研究口腔鳞状细胞癌时发现在正常鳞癌及癌 变前鳞癌的角化细胞中钙离子可以对MMP-9产生剂量依赖性诱导，在低分化、高 侵入性鳞癌中却没有此特性呻1。目前国内外对MMP一9的研究主要在其病理学方面， Shubayev等在研究神经再生时发现MMP一9可以增强神经生长因子活性，促进原有 神经生长，但不能生成新的神经分支嘲。Dechow等在组织移植过程中发现MMP一9 的表达增加n

17、01。最近研究表明通过检测删P一9浓度也可以估计损伤或疾病的程度 n，并可以初步预测治疗效果n 2131。同时，有研究证明删P一9在COPD的发生、发 展中也起到促进作用。目前，对MMPS在肿瘤发生、发展及转移中的作用已有较多 的研究。近年来有关MMPS的研究为它们在肿瘤的侵袭转移中的作用提供了一些依 据n引：(1)已建立的哺乳动物类细胞株，其体内和体外的侵袭，转移行为与MMPS 的产生呈正相关；(2)一些刺激分化的生长因子，女IEGF、成纤维细胞生长因子、 血小板衍生生长因子(PDEF)等促进多种MMP-9的生成，提示MMPS的产生与细胞 分化的调节路径可能是共同的；(3)ECM蛋白，包括层

18、粘连蛋白与肿瘤细胞表面 相应受体的结合不仅可刺激几种MMPS的产生，而且还可促进肿瘤的侵袭能力：(4) 诱导和促进MMPS产生的基因调控同时也诱导和促进了细胞的侵袭和转移行为： (5)MMPS抑制因子在抑制肿瘤MMPS活性的同时，也抑制了肿瘤细胞的侵袭和转 移能力。删PS中对肿瘤侵袭和转移所起作用最重要的是MMP9、MMP2和MMP3。6兰州大学硕士学位论文体内外研究表明，MMP-9在肿瘤发生、发展的多个阶段均有作用，影响肿瘤的起 始、生长、血管生成、进入血管、离开血管和转移。IV型胶原是MMP-9最主要的 作用底物，同时也是ECM和细胞基底膜的主要成分，MMP-9可对IV型胶原进行有效 的降

19、解，而MMP一9与基底膜的相互作用则是肿瘤侵袭转移的起始信号，也是肿瘤 细胞侵袭转移过程中必须克服的生理屏障。研究发现，MMP一9可剪切细胞粘附分 子如Ecad和CD44等，促进肿瘤的侵袭与转移；同时MMP一9还可以调节VEGF从ECM 中释放，促进肿瘤血管生成。MMP-9作为金属的一种也具有酶的普遍性质，受到 体内多种因素的调控，在MMP-9的5侧翼调控区已鉴定出NF-K B位点、TRE效应 组件、Sp一1位点、PEA3位点、GA盒和GT盒等多种顺式作用元件。研究表明，TPA 等外在因素在肿瘤中的作用主要是通过包括删P一9在内的一些相关基因上的TRE 效应组件来实现的，TRE效应组件可被AP

20、-1蛋白家族成员识别与结合，目前认为 这在恶性肿瘤启动姗P一9转录中发挥重要作用，促进MMP一9在肿瘤中的过表达。MMP-9在肺癌中的表达目前也多有报导，在吸烟者增生肥大和鳞状化生的支 气管上皮细胞中，有MMP一9的弱表达，而在形成支气管原位癌时则删P一9的表达明 显增强n酊，说明在肺癌中，脚P一9与恶性肿瘤表现出良好的相关性。Thomasn硝等 报导NSCLCJ中瘤组织中MMP-9的阳性表达明显高于正常组织和良性肺病组织，具有 显著的统计学意义，而正常组织和良性肺病组织之间无明显差异，提示MMP一9可 作为肺癌诊断的一个生物学指针。同时发现MMP-9的表达与NSCLCI临床分期、病理 分级以

21、及有无淋巴结转移有关。删P一9主要通过以下几种机制促进肿瘤的侵袭性 生长：(1)删P一9作用使肿瘤细胞周围的物理屏障破坏；(2)删P一9可重塑细胞 间粘附力，以便肿瘤细胞向周围生长；(3)MMP一9作用于基质成分后，激发其它 的一些潜在的生物活性，参与肿瘤的免疫过程：(4)通过对细胞外基质的改建， 促进肿瘤新生血管的形成。二NF-K B与肿瘤转录因子NF-K B是1986年由Bltimore和Rwiansen在浆细胞和成熟B细 胞中发现的，这种蛋白能与免疫球蛋白K轻链内含增强子的特异性序列结合，所 以命名为K Bn刀。NF-K B广泛存在于真核生物中，属于一个由复杂的多肽亚单 位组成的蛋白家族

22、，目前的研究认为它与免疫、肿瘤的发生发展、细胞的凋亡以 及胚胎发育等重要事件有着密切联系。对NFK B的研究已成为当前一个非常7兰州大学硕士学位论文引入关注的热点。转录因子NFK B家族包括以下蛋白质：p50(NFK B1)、 P52(NFK B一2)、p50B、p65(relA)、CRel、vRel、RelB。他f门均 以二聚体形式存在，活性最强的NFK B是p65和p50蛋白质的异源二聚体， 他们是最早被认识的，在细胞内含量最丰富n 8。，p50含核定位信号是核因子与DNA 结合部分，而p65含转录活化区域，参与基因转录的起始调节，并可促进p50与 DNA结合n引。在大多数细胞中，RelN

23、FK B存在于胞浆中，与抑制性蛋白 I K B结合成复合物，处于无活性状态。NF-K B是一类普遍存在的转录调节因子，它参与细胞存活、增殖和凋亡调 控。NF-K B活性失控与人类肿瘤的发生发展、浸润转移、治疗和耐药、预后等 密切相关。因此，深入探讨NFK B在体内病理状态下的活化机制及其与细胞、 基因之间的调节，对探索恶性肿瘤的发生发展机制，为肿瘤治疗提供新思路将大 有裨益。最初发现的NF-K B是由p50和p65两个亚单位组成的异二聚体。但后来发现 存在着一个NF-K B家族，它有多个成员，且与Rel家族有较强的同源性，所以 又将二者合称为RelNFK B家族。其成员主要有RelA(p65)

24、、RelB、cRel、 NF-K B一1(p50)、NFK B一2(p52)等。通常所说的NFK B或RelNF_K B是指 p50-p65异二聚体，它是NFK B活性形式的主要成分。NF-K B受多种因素的反馈调节。上述TNF等多种物质使NFK B启动后可以增 力flTNF、白细胞介素一1等的转录，后者又反过来启动NF-K B，这是正反馈调节。 同时，由于NF-K B的启动导致I K B、p102基因的转录上调(因这两种基因上均 有NF-K B的作用位点)，p102降解产生p50，随着p50的增加，p50一p50同源二 聚体也增加，后者是转录抑制复合体，可降低NF-K B介导的基因表达呦1，

25、这是负 反馈调节。此外，有研究发现NF-K B可以将带有K B位点的I K B Q基因启动， 而所产生的I K B Q可以直接进入细胞核内，把NF-K B二聚体从DNA上拽下来， 并将它重新带回胞浆。由此可见，I K B a不只是在胞浆中调控NFK B，而且 可以进入胞核内调控NF-K B，这或许就是在生理条件下NFK B活性时间不会太 持久的原因。NF-K B与多种肿瘤的发生、发展和浸润转移有关，并参与了肿瘤细胞抵抗 放化疗的作用机制乜羽。NF-K B可启动与浸润转移相关的某些重要因子的表达从8兰州大学硕士学位论文而发挥其在肿瘤进展中的重要作用，这些因子包括表皮生长因子、基质金属蛋白 酶、尿

26、激酶型血纤维蛋白溶酶原启动剂(urokinase type plasminogen activator。uPA)和细胞粘附分子一1等。尽管目前对NF-K B的研究已取得不少进展，但其在肺癌发生发展中的各种机 制尚未完全清楚，而且NF-K B在人体内的作用广泛，尤其在炎症、免疫等方面发 挥着重要作用，目前包括人工合成在内的一些NFK B活性抑制剂均为非特异性 的，治疗中由于非特异性抑制NFK B可能会出现严重的副反应，因此对NFK B 进步深入研究明确其在肿瘤发病中的各个机制，寻找安全而有效的NFK B活 性抑制剂，增强其对NFK B抑制的特异性将会是肺癌的基因治疗新的方向，为肺癌的临床治疗开辟

27、新的途径。综上所述，MMP-9及NF-K B在肺癌的诊断及预后的判断中具有重要的应用价 值。但目前对二者的研究仅在各自独立的层面上，且其精确的调节机制和二者之 间的关系至今尚未完全阐明，而其在肿瘤细胞中的作用机理及对瘤细胞的影响等 仍需进一步研究。二者有望成为鉴别肺癌与非肺癌、肺癌的类型及判断肺癌分期 及预后的一项临床指标。本文通过观察二者在常见不同类型肺肿瘤组织中的表达 差异，进一步探讨其在肺部肿瘤鉴别诊断及预后判断中的作用与意义。9兰州大学硕士学位论文材料与方法一临床病理资料标本取f12004年6月-2007年5月兰州大学第二医院、甘肃省肿瘤医院胸外科 住院手术切除及气管镜活检的标本，经病

28、理确诊为原发性支气管肺癌79例，男54 例，女25例；年龄2773岁，中位年龄57岁。本实验的组织标本中小细胞肺癌 (SCLC)21例(男14例，女7例)，鳞癌34例(男3l例，女3例)，高分化8例， 中分化14例，低分化12例，腺癌20例(男9例，女11例)，高分化5例，中分化10 例，低分化5例，大细胞癌4例(男3例，女1例)，未分化。临床分期：依据2002 年国际抗癌联盟(U ICC)TNM分期标准，I期16例(Ia 4例，Ib 12例)，II期21例 (IIa4例，lib 17例)，III期41例(Ilia 33例，IIIb 8例)，IV期1例。有淋巴结 转移组49例，无淋巴结转移组3

29、0例。所有患者术前均未接受化疗、放疗和其它治疗。以非肿瘤性肺组织标本(肺炎18例，肺结核12例，炎性假瘤10例)40例作为 对照组，男28例，女12例，年龄26-,68岁，中位年龄46岁。二主要试剂与仪器 1试剂 鼠抗人MMP9单克隆抗体 兔抗人NFK B多克隆抗体 柠檬酸抗原修复缓冲液 PBS缓冲液(PH=74)DAB显色剂 苏木素即用型免疫组织化学超敏SP试剂盒，包括：试剂A(内源性过氧化酶阻断剂)： 试剂B(正常非免疫动物血清)；试剂C(生物素标记的第二抗体)；试剂D(链 霉素抗生物素蛋白过氧化酶)。以上试剂均购自福州迈新生物工程。2。仪器 切片机(德国LEICA，砌订2025) 摊片烤

30、片机(德国LEICA，CSB型) 脱水机(德国LEICA，TPl020)lO兰州大学硕士学位论文DH型电热恒温箱(北京科伟永兴仪器公司) 18cm不锈钢高压锅(迈新公司产品编号：HPC1001) 便携式免疫组化电子定时器(迈新公司产品编号：TIM1001) 免疫组化染色孵育盒(迈新公司产品编号：BOX1003) 塑料耐高温切片架(迈新公司产品)光学显微镜(Olympus Japan) 1000W电炉一台 冰箱(184)三方法 1石蜡组织切片抗原修复方法：(1)常规组织切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水后，浸泡于蒸馏水中1小时 后，用PBS液冲洗三次，每次3分钟。(2)取1000ml PH=60柠檬

31、酸盐缓冲液于压力锅中，加热至沸腾，将脱蜡水 化后的组织切片置于耐高温切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，盖上锅盖，扣上 压力阀，继续加热至喷气，从喷气开始计时，2分钟后压力锅移开电炉，冷却至 室温，取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，再用PBS液冲洗三次，每次3分钟。2SP法染色步骤 (1)每张切片加一滴过氧化酶阻断溶液(试剂A)，以阻断内源性过氧化酶的活性，在恒温箱内与室温相等下孵育10分钟，之后取出用PBS液冲洗三次，每 次3分钟。(2)甩去PBS液，每张切片加一滴非免疫动物血清(试费UB)，在恒温箱内 与室温相等下孵育10分钟。(3)甩去血清，每张切片加一滴第一抗体(MMP9、NFK B)，在冰箱

32、内4下孵育过夜，之后取出用PBS液冲洗三次，每次3分钟。 (4)甩去PBS液，每张切片加一滴生物素标记的第二抗体(试剂C)，在恒温箱内与室温相等下孵育10分钟，之后取出用PBS液冲洗三次，每次3分钟。 (5)甩去PBS液，每张切片加一滴链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶(试剂D)，在恒温箱内与室温相等下孵育10分钟，之后取出用PBS液冲洗三次，每次3分钟。 (6)甩去PBS液，每张切片加两滴新鲜配置的DAB溶液染色5分钟，同时在兰州大学硕士学位论文显微镜下观察。(7)自来水冲洗，苏木素复染后自来水冲洗返蓝。 (8)切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。 (9)光学显微镜下观察染色结果。

33、阳性对照为已知的肺癌阳性片，用PBS液代替一抗作阴性对照。 四结果判断MMP一9与NFK B的阳性细胞为瘤细胞浆或细胞核染成棕黄色，高倍镜下取 55-不同视野，各计数200个癌细胞，根据每张切片的阳性细胞显色深浅及阳性细 胞比率计分，(1)显色深浅：不显色为0分；浅黄色1分；棕黄色2分：深褐色3分。 (2)阳性细胞百分率：无阳性细胞显色0分；阳性细胞显色50为3分。二者得分相加：O分为阴性(一)；12分为弱阳性(+)；3,-4分为阳性(+)；5,-6分为强阳性(卅)。五统计处理应用SPSS 1 15统计分析软件包进行统计学分析，MMP9和NFK B各组中阳 性率的比较采用行列表x 2检验，二者

34、之间的相关性用Spearman相关分析，PO05)，而与肿瘤的组织类型、临床分期、 分化程度及是否伴有淋巴结转移密切相关，在肺癌组织中NFK B、MMP9表 达在淋巴结转移组、IIIIV期及低分化癌组织中的阳性表达显著高于非淋巴结 转移组、III期及高分化组的表达， (PO05)。 (见表2)。13兰州大学硕士学位论文四NFK B与MMP9的关系：在肺癌组中，NFK B与MMP9二者均阳 性表达46例，二者均阴性表达16例，二者呈正相关关系(P001， r=0513)。 (见表3)。14兰州大学硕士学位论文表3NF-K B与MMP一9的关系NFK B名称+一阳性率相关系数P+465902051

35、312cm 累及脏层胸膜扩展到肺门的肺不张或阻塞性肺炎，但不累及全肺T3任何大小的肿瘤已直接侵犯下述结构之一者：胸壁(上沟 瘤)、膈肌、纵隔、胸膜、心包，肿瘤位于距隆突2cm以内 的主支气管但尚未累及隆突，全肺的肺不张或阻塞性肺炎T4任何大小的肿瘤已直接侵犯下述结构之一者：纵隔、心脏、 大血管、气管、椎体、隆突，恶性胸腔积液或恶性心包积 液；原发肿瘤在同一叶内出现单个或多个卫星结节区域淋巴结NNX区域淋巴结不能评价N0没有区域淋巴结转移N1转移至同侧支气管淋巴结和(或)同侧肺门淋巴结，和原 发肿瘤直接侵及肺内淋巴结N2转移至同侧纵隔或隆突下淋巴结N3转移至对侧纵隔、对侧肺门淋巴结、同侧或对侧斜

36、角肌或 锁骨上淋巴结2l兰州大学硕士学位论文远处转移(M)D(远处转移不能评价MO无远处转移M1有远处转移注：任何大小的不常见的局限于支气管的管壁表浅肿瘤，即使累及 主支气管，也定义为T1；大部分肿瘤患者的胸腔积液是由肿瘤所引起的， 但如果胸水多次细胞学检查未能找到癌细胞，胸水又非血性和非渗出性，临 床判断该胸水与肿瘤无关，这种类型的胸水不影响分类；同侧非原发肿瘤所 在的叶的其他肺叶出现转移性结节定义为M1，心包积液的定义原则等同于 胸腔积液。二、TNM与临床分期的关系兰州大学硕士学位论文讨论 肿瘤的浸润与转移是肿瘤细胞与肿瘤基质成分共同参与的过程。肿瘤浸润有三个过程，即粘附、降解和移动。转移

37、的过程极其复杂，涉及细胞的粘附、 运动、降解基底膜和细胞外基质以及新生血管的形成。包括下列环节：肿瘤细 胞从原发肿瘤灶脱离降解基底膜，向外浸润、迁移粘附于血管内皮进入循环系统，随着血流到达并停留于远处血管壁穿过血管，侵入细胞外基质，最后在特定的组织器官形成转移灶肿瘤灶的新生血管形成。其中的最 基本步骤是癌细胞对细胞外基质和血管基底膜的降解和破坏。肿瘤细胞分泌组 织蛋白酶、胶原酶粘蛋白酶等多种水解酶，其中MMPS是降解细胞外基质最重 要的酶。李红梅【23】报导，肿瘤侵袭转移的能力与其产生或诱导产生MMPS的能 力呈正相关。MMP9是MMPS家族成员之一，其主要作用是在人体正常PH值作用下， 在金

38、属锌离子作用下，参与细胞外基质的降解与重建，故又称基质因子。MMP9 在肿瘤发生、发展的多个阶段均有作用，影响肿瘤的起始、生长、血管生成、 进入血管、离开血管和转移。IV型胶原纤维是MMP9最主要的底物，也是ECM 和基底膜的重要组成部分，MMP9能有效将型胶原纤维降解【241，有利于快 速增殖的肿瘤细胞摆脱ECM的束缚而进行转移，是肿瘤细胞向周围组织浸润 的生化基础【25,261。大量研究证实MMP9是降解ECM最重要的酶类。Lioffat27】 首先证实了肿瘤与MMP2、MMP9降解基底膜之间的关系，其后众多研究进 一步证实上调的MMP活性与肿瘤侵袭转移力之间的关系。Powell等【28】

39、使用人 前列腺癌细胞株DN145高表达MMP9，然后以此细胞株予裸鼠腔内注射，发 现该细胞株侵袭隔膜的能力明显增加，反之，如果将MMP的反义核酸序列导 入高侵袭转移潜能的细胞，可使其侵袭力减弱。对人体不同部位、不同组织类型的肿瘤组织进行的研究表明，MMP9在 多种肿瘤组织中有不同程度的阳性表达。而且MMP9在肿瘤组织中的表达和 活性明显高于周围正常组织或良性病变组织。本实验通过免疫组化SP法测定 79例肺癌患者肿瘤组织中MMP9阳性表达率明显高于正常组织，具有显著的 统计学意义，与Farias29】等结论一致，提示MMP9可能作为肺癌诊断的一个生 物学指针。本实验中研究发现MMP9表达与肺癌患

40、者的年龄和性别无关，且兰州大学硕士学位论文其阳性率随着组织分化级别、临床分期升高而升高，有淋巴结转移的肿瘤组织 MMP9阳性率明显高于无淋巴结转移者，与大多数报导一致【30l，提示MMP9 阳性表达与肿瘤的恶性程度相关。核转录因子NFK B是1986年由Bltimore和Rwiansen在成熟B细胞中 发现的，这种蛋白能与免疫球蛋白K轻链内含增强子的特异性序列结合，所以 命名为K B。NFK B是一类重要的细胞转录因子，参与多种细胞增殖、凋亡相 关基因的转录调控，在许多恶性肿瘤的发生、转移过程中发挥了重要作用，同 时与令人棘手的肿瘤耐药问题也密切相关【31321。在大多数细胞中P50和P65是

41、 NFK B活性形式的主要成分，P50的主要功能是结合DNA，一般不具有转录 启动作用，在NFK B中发挥转录启动作用的是P65。正常情况下，NFK B在细胞质中与核转录因子K B抑制蛋白IK B结合，当NFK B路径启动因子出现 时，磷酸化K B与NFK B解离并降解，NFK B进入细胞核中开始转录。放射 线和一些细胞毒性药物可启动NFK B；NFK B参与抗凋亡mJ、细胞周期和细 胞间粘附中起重要意义的基因转录调控34】。抑制NFK B可减少肿瘤的生长并 提高肿瘤细胞对TNFQ、抗肿瘤药物【35】和13射线36】介导的凋亡敏感性。Mayo 等f37】报道：原癌基因ras诱导的致癌变作用需要

42、NFK B的过度活化。G-ilmore 等【38】发现活化的NFK B可直接作用于细胞周期或DNA复制，导致癌症的发生。 最近又发现NFK B参与肿瘤的转移【391。在大多数细胞中P50和P65是NF-K B 活性形式的主要成分，P50的主要功能是结合DNA，一般不具有转录激活作用， 在NFK B中发挥转录激活作用的是P65(RelA)。P65参与基因转录的起始调 节，并可促进P50与DNA结合，当P65与细胞质内抑制蛋白I K B结合后，可 掩盖P50上核定位信号2。本研究中采用特异性NFK B P65单抗，这种单抗在 RelA与其抑制蛋白I K B Q结合时不能与RelA结合，故特异性NF

43、K B P65单 抗可识别细胞质及细胞核内处于活化(游离)状态的RelA，因此RelA活化的 肿瘤细胞的细胞质和细胞核均出现免疫组化阳性染色。本实验证实：非恶性肺 部疾病组织中可出现NFK B P65的微弱表达，说明NFK B处于不断的激活和 失活的有序调控中，是维持细胞正常生理功能及生理平衡所必需的；当NFK B 被过度激活，某些下游基因也被异常激活，导致细胞癌变，本组79例肺癌组织 中NFK B P65的表达与肺部非恶性组织相比，差异有显著性，这说明NFK B兰州大学硕士学位论文在肺癌中表达增强，即NFK B在肺癌中有过度活化的现象。本研究发现有远 处转移组和小细胞肺癌组的NFK B表达分

44、别高于无远处转移组和鳞癌及腺癌 组，众所周知，小细胞肺癌的恶性程度高于鳞癌及腺癌，且易于侵袭和转移。 故研究结果提示NFK B P65的表达高低与肺癌的侵袭和转移相关，NFK B P65 表达越强预示肺癌的恶性程度越高、侵袭和转移能力越强。而在不同性别、年 龄的患者肺癌组织中，其NFK B P65的表达无显著性差异，说明肺癌的侵袭和 转移能力与性别、年龄的关系不大。一般来说，低分化癌组织的侵袭和转移能 力高于分化程度高的癌组织，临床分期中的晚期患者一般都已经有局部或远处 转移，本实验中低分化癌组织及临床分期中的晚期癌组织中NFK B P65有过度 表达的趋势。且不同分化程度及不同临床分期的肺癌

45、组织中NFK B P65的表达 有显著性差异，说明肿瘤的分化程度越低越易侵袭转移。另外，当肿瘤细胞发生浸润转移时，淋巴细胞和白细胞分泌jtIIL1、TNF等 细胞因子杀灭癌细胞，激活了淋巴管、血管内皮细胞内的NFK B，而内皮细胞 存在NFK B激活ICAM1140J启动子的部位，NFK B的过度活化可使内皮细胞 ICAM-1活化增加，进入血液或淋巴结的癌细胞与淋巴结细胞竞争性地与内皮细 胞结合，使癌细胞能在淋巴结或其他脏器中粘附、生长、增殖。另一方面，癌细 胞内活化的NFKB还可诱导IL6和尿激酶纤溶酶原激活物调控其周围的成纤维 母细胞基质产生血管生成因子和细胞外基质降解酶，促使肿瘤细胞的浸

46、润和转 移。同时，NFK B的抑制信号能有效地抑制高转移性前列腺癌PC23细胞的 血管内皮生长因子(VEGF)、IL8和细胞外基质金属蛋白酶9(MMP9)3种主 要前血管生成分子的表达，减少肿瘤血管的生成，抑制肿瘤的侵袭、转移，同时 还可通过上调基质金属蛋白酶9(MMP9)的表达活性影响肿瘤的侵袭转移。 NFK B(P65)造成肺癌侵袭能力增强的作用机制可能是通过NFK B(P65)的 激活，活化许多与浸润、转移相关的重要因子：包括血管内皮生长因子(VEGF)、 基质金属蛋白酶(MMP)、尿激酶型血纤维蛋白溶酶原激活剂(uPA)和细胞粘附 分子(ICAM1)等。可以说NFK B的活化是肿瘤发生

47、发展、获得浸润转移恶 性表型的关键。本研究结果表明，MMP9与肺癌的侵袭转移密切相关，而且NFK B与MMP9表达呈正相关关系，提示在肺癌中MMP9的高表达可能与NFK B有关，推测当NFK B激活后，发挥基因调控作用，增强了MMP9基因的转兰州大学硕士学位论文录活性，使MMP9表达上调，导致癌细胞的侵袭转移。NFK B和MMP-9表达 的检测有助于肺癌侵袭转移的判断。综上所述，同时检测肺癌组织中MMP9和NFKB的表达对判断肿瘤的恶 性程度和估计预后具有一定意义。兰州人学硕士学位论文结论 l在肺癌组织中，NFK B及MMP9表达增强。2在肺癌组织中，NFK B及MMP9的表达与肿瘤的分化程度

48、、临床分期、淋巴结转移均有相关性，与患者的性别、年龄无关。3 NFK B及MMP一9二者在肺癌组织中的表达呈正相关。4联合检测NFK B和MMP9对肺癌患者的转移及预后评估有一定的指导意义。兰州大学硕士学位论文参考文献n 1JOshiro MM，Watts GS，Wozniak RJ，et a1Mutant p53 and aberrant cytosme methylation cooperate to silence gene expressionJ】Oncoqene，2003；22 (23)：3624-3634口 1j Takahara M， Naruse T，Takagi MetalM

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