PCR技术的基本原理.doc

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1、PCR技术的基本原理PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的

2、半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟， 23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。(Plateau)。 到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y(1X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。 反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增

3、的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应” ，这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。PCR扩增产物 可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中， 以两条互补的DNA为模板，引物是从3端开始延伸， 其5端是固定的，3 端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外

4、，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结时， 由于新链模板的5端序列是固定的， 这就等于这次延伸的片段3端被固定了止点， 保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加， 而“长产物片段”则以算术倍数增加， 几乎可以忽略不计， 这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析 1. Polymerase Chain Reaction 具体内容点击： 聚合酶链式反应，简称PCR。又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。 由美国科学家PE（Perkin Elmer珀金-

5、埃尔默）公司遗传部的Dr. Mullis发明，由于PCR技术在理论和应用上的跨时代意义，因此Mullis获得了1993年化学诺贝尔奖。 是一种体外快速扩增DNA的方法，用于放大特定的DNA片段，数小时内可使目的基因片段扩增到数百万个拷贝的分子生物学技术。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热

6、变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 所有的DNA的复制都是从一个固定的起始点开始的，而DNA聚合酶只能延长已存在的DNA链，不能从头合成DNA链，新DNA的复制是如何形成的？经大量实验研究证明，DNA复制时，往往先由

7、RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物，再由聚合酶从RNA引物3端开始合成新的DNA链。引物科技名词定义中文名称：引物 英文名称：primer 定义1：在聚合作用的起始时，可以刺激合成另一种大分子，并与反应物以共价键形式连接的序列。在核酸化学中，引物是一段短的单链RNA或DNA片段，可结合在核酸链上与之互补的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3端开始合成新的核酸链。体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应、测序和探针合成等。 所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；总论（二级学科） 定义2：在多聚酶链式反应中，用于引导脱氧核糖核酸合成的一段核苷酸序列。 所属学

8、科：水产学（一级学科）；水产生物育种学（二级学科） 定义3：（1）DNA复制时，由引物酶催化合成的DNA复制的RNA引导序列。（2）体外人工合成DNA中，可与模板结合的单链核苷酸片段。 所属学科：细胞生物学（一级学科）；细胞遗传（二级学科） 定义4：含游离3-羟基并引发聚合反应的寡核苷酸序列。 所属学科：遗传学（一级学科）；分子遗传学（二级学科） 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 百科名片 引物引物（primer），是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的3-OH上，核苷酸以二酯链形式进行合

9、成，因此引物的3-OH，必须是游离的。目录类型 引物设计原则 1. 1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 2. 2.引物长度一般在1530碱基之间。 3. 3.引物GC含量在40%60%间，Tm值最好近72 4. 4.引物3端要避开密码子的第3位。 5. 5.引物3端不能选择A，最好选择T。 6. 6. 碱基要随机分布。 7. 7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。 8. 8. 5 端和中间G值应相对较高3 端较低 9. 9.引物的5端可以修饰，而3端不可修饰。 10. 10. 扩增产物的单链不能形成二级结构。 11. 11. 引物应具有特异性。常用引物设计软件类型 引物设计原则 1

10、. 1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 2. 2.引物长度一般在1530碱基之间。 3. 3.引物GC含量在40%60%间，Tm值最好近72 4. 4.引物3端要避开密码子的第3位。 5. 5.引物3端不能选择A，最好选择T。 6. 6. 碱基要随机分布。 7. 7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。 8. 8. 5 端和中间G值应相对较高3 端较低 9. 9.引物的5端可以修饰，而3端不可修饰。 10. 10. 扩增产物的单链不能形成二级结构。 11. 11. 引物应具有特异性。常用引物设计软件展开编辑本段类型存在有自然中生物的DNA复制引物（RNA引物）和聚合酶链式反应(PCR

11、)中人工合成的引物（通常为 DNA引物）。一般所说引物，指DNA引物，以下简称引物。 编辑本段引物设计原则引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。 在PCR（聚合酶链式反应）技术中，已知一段目的基因的核苷酸序列，根据这一序列合成引物，利用PCR扩增技术，目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环，延伸后得到的产物同样可以和引物结合。 PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。如前述，引物的优劣直

12、接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。 1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。 2.引物长度一般在1530碱基之间。引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。 3.引物GC含量在40%60%间，Tm值最好近72

13、GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值510。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为5580，其Tm值最好接近72以使复性条件最佳。 4.引物3端要避开密码子的第3位。如扩增编码区域，引物3端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 5.引物3端不能选择A，最好选择T。引物3端错配时，不同碱基

14、引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3端最好选择T。 6. 碱基要随机分布。引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。 7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hai

15、rpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。 两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3 端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Cross dimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。 引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。 8. 5 端和中间G值应相对较高3 端较低G值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，G值越大，则双链越稳定。应当选用5 端和

16、中间G值相对较高，而3 端G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3 端的G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。（不同位置的G值可以用Oligo 6软件进行分析） 9.引物的5端可以修饰，而3端不可修饰。引物的5 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5 端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。 引物的延伸是从3 端开始的，不能进行任何修饰。3 端也不能有形成任何二级结构可能。 10. 扩增产物的单链不能形成二级结构。

17、某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（G）小于58.6l kJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。 11. 引物应具有特异性。引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。 值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适

18、的引物；用作克隆目的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。 做Real Time时,用于SYBR Green I法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求： 避免重复碱基，尤其是G. Tm=58-60度。 GC=30-80%. 3端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C. 正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。 PCR扩增产物长度： 引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80150 bp最为合适（可以延长至300 bp）。 引物的退火温度要高，一般要在60度以上； 要特别注意

19、避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。 而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。 做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备-寻找合适的引物非常不容易。 关于BLAST的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在GENEBANK中公开的不物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那

20、么这个引物的特异性就很差，从而不能用。 编辑本段常用引物设计软件Oligo 6 Oligo 6是目前使用最为广泛的一款引物设计软件，除了可以简单快捷地完成各种引物和探针的设计与分析外，还具有很多其 他同类软件所不具有的高级功能： 已知一个PCR引物的序列，搜寻和设计另一个引物的序列； 按照不同的物种对MM子的偏好性设计简并引物； 对环型DNA片段，设计反向PCR引物； 设计多重PCR引物； 为LCR反应设计探针，以检测某个突变是否出现； 分析和评价用其他途径设计的引物是否合理； 同源序列查找，并根据同源区设计引物； 增强了的引物/探针搜寻手段。设计引物过程中，可以Lock每个参数，如Tm值范围

21、和引物3端的稳定性等； 以多种形式存储结果；支持多用户，每个用户可保存自己的特殊设置。 Primer Premier 5.0 Primer Premier 5.0 是一种用来帮助研究人员设计最适合引物的应用软件利用它的高级引物搜索引物数据库巢式引物设计引 物编辑和分析等功能可以设计出有高效扩增能力的理想引物也可以设计出用于扩增长达50kb以上的PCR产物的引物序列。 该软件主要由GeneTank 序列编辑，Primer 引物设计，Align 序列比较，Enzyme 酶切分析和Motif 基序分析等几个主要功能板块组成。基本概念PCR技术又称为“多聚酶链式反应” 基本原理PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR是一种体外DNA 扩增技术，是在模板DNA、引物和种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性低温退火引物延伸”三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。