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1、多功能粘质沙雷氏菌的筛选鉴定及其甲基对硫磷水解酶基因的克隆有机磷农药的共性是分子中含有一个P 原子 , 可与乙酰胆碱酯酶（ AChE）共价结合形成磷酰化酶 , 抑制 AChE活性 , 对人和动物产生毒性。 目前 , 常用处理有机磷农药方法主要有絮凝沉降、化学水解、氧化、光催化和生物降解。其中 , 微生物菌株及其生物酶降解污染物具有无毒、无残留、无二次污染等优点 , 得到业界人士的广泛认可和充分肯定。从自然环境中分离有机磷农药高效广谱降解功能菌株和高效降解有机磷农药的酶是有机磷农药废水处理的基础和保障。通过对采集于沙湖周边的水样经过富集培养, 再经过乐果做唯一碳源的无机盐平板划线筛选 , 得到
2、9 株有机磷农药降解菌 , 其中中间苍白杆菌MEW68降解乐果的效果最好（降解率为80.45%）, 但是它在农药降解方面的研究较多, 因此选择在该方向研究较少的粘质沙雷氏菌MEW96作为降解农药的菌株。在LB 平板培养24 h,MEW96菌落表面光滑、微隆起 , 不透明 , 边缘稍带锯齿状 , 生化分析表明 MEW96能在 1%8%NaCl中生长 , 具有鸟氨酸脱羧酶、酯酶和DNA酶, 但是没有精氨酸双水解酶和脲酶活性 , 甲基红染色阴性 , 能水解糊精、明胶、肌苷 , 不能水解 Tween40;结合形态观察 , 生理生化鉴定和 16S rDNA 测序分析 , 将 MEW96鉴定为粘质沙雷氏菌
3、（ S.marcescens subsp.marcescens ）。MEW96对甲基对硫磷有比较好降解效果, 在 5 d 内完全降解 50 mg/L 的甲基对硫磷 ;MEW96对对氧磷的降解效率为90.3%, 且在降解对氧磷的过程中PNP逐渐积累 ,PNP的增加量与对氧磷的减少量保持一致;MEW96也能够降解乐果 , 第 7 d,降解率为 87.2%; 说明 MEW96是一株降解多种农药的高效菌株。对MEW96的多功能性质进行初步分析 , 发现 MEW96能水解几丁质和卵磷脂 , 而且能明显抑制尖刀镰孢菌、苹果轮纹菌、花生叶霉和草莓灰霉菌丝的生长, 对水稻纹枯菌和灰葡萄孢菌也具有一定的抑制作用
4、, 同时还能富集无机磷 , 当磷含量为 10 mg/L,24 h聚磷率为 99.94%。因此 ,MEW96既能在有机磷农药降解方面有良好应用, 同时又可应用于生物防治领域。在 MEW96基因组中发现编码甲基对硫磷水解酶的基因GM004539,且基因表达量受甲基对硫磷诱导而明显上调。将 MEW96 mpd基因表达到 E.coli BL21 （DE3）, 得到重组菌 MBW300,经过最佳条件（温度 37 oC,IPTG 浓度 0.3 mM,时间 8 h）诱导 , 得到大量可溶性蛋白 , 经镍柱纯化 ,SDS-PAGE和 western blot显示约 35 kDa 的位置有单一条带 ,Nativ
5、e-PAGE 分析在约 66 kDa 处出现一条清晰的蛋白条带, 推测 MPH活性形式是同源二聚体。 纯化的甲基对硫磷水解酶最适反应温度为35 oC,最适 pH 为 11;Co2+、Cd2+、Fe2+对酶有激活作用 ,Cu2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+对酶有抑制作用。35 oC, 反应液 pH为 9 时, 以甲基对硫磷作为底物, 甲基对硫磷水解酶酶比活为 3.66U/mg, 米氏常数（ Km）为 430.5 49.5 mol/L, 转换数（ kcat ）为 1467.2 6.1 min-1,催化效率（ kcat/Km ）为 3.41 M-1min-1 。经 HPLC检测 ,MEW96甲基对硫磷水解酶通过水解 P-O 键, 将甲基对硫磷转化成对硝基苯酚。当酶浓度为 300g/mL, 经过约 24 h 的水浴反应 , 甲基对硫磷被完全转化为对硝基苯酚 , 此时对硝基苯酚浓度为24.74 mg/L 。重组菌 MBW300能在 96 h 内完全降解 50 mg/L 的甲基对硫磷 , 相比于野生菌 MEW96,重组菌对甲基对硫磷的降解能力更强。
多功能粘质沙雷氏菌的筛选鉴定及其甲基对硫磷水解酶基因的克隆
