体外培养人羊膜上皮细胞的表型及分化能力

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1、www.CRTER.org连建春，等. 体外培养人羊膜上皮细胞的表型及分化能力体外培养人羊膜上皮细胞的表型及分化能力连建春1，刘 洋2，刘 畅2, 3，吕世杰4，郭 昕2，南 丰5，孙广炜2，贺 欣1，马小军2 (1大连医科大学检验医学院，辽宁省大连市 116044；2中国科学院大连化学物理研究所生物医用材料工程组，辽宁省大连市 116023；3中国科学院大学，北京市 100049；4大连市妇产医院，辽宁省大连市 116021；5大连医科大学附属第二医院骨科，辽宁省大连市 116023)文章亮点：1 实验分析了体外培养对羊膜上皮细胞表型以及分化能力的影响，探讨原代羊膜上皮细胞干性标志物SSEA

2、-4的表达水平与体外培养后羊膜上皮细胞表型以及分化能力变化的关联性。2 结果提示需要建立临床样本筛选指标以实现羊膜上皮细胞的质量监控；需要继续优化培养条件以维持体外培养过程中SSEA-4等干性标志物的高表达；羊膜上皮细胞的向心肌样细胞分化的能力受到个体差异与培养条件的影响，还需要进一步探讨。 关键词：组织构建；组织工程；羊膜上皮细胞；体外培养；SSEA-4；羊膜上皮细胞标志物；心肌样细胞分化；国家自然科学基金主题词：干细胞；羊膜；上皮细胞；细胞分化；肌细胞, 心脏；抗原, 表面基金资助：国家自然科学基金(31271055)：模拟细胞微环境强化干细胞体外定向预分化体系的研究及其工程化构建；国家自

3、然科学基金(81101757)：利于肿瘤干细胞扩增的基质刚度与乏氧微环境的构建及调控。国家自然科学基金(21076207)：细胞间质体外模拟系统的构建及物质传递基本规律的研究。国家科技重大专项(2012ZX10002-011-013)：肝癌细胞三维培养模型标准化构建和规模化制备技术研究；大连市科学技术基金(2012J21DW029)：体外肿瘤干细胞培养体系的建立及应用摘要背景：人羊膜上皮细胞具有多系分化能力，是再生医学中重要的细胞来源。目前的研究多集中于对其分化能力的考察，而体外培养过程中羊膜上皮细胞的生物学特征如何变化尚不清楚。目的：分析体外培养对人羊膜上皮细胞生长、表型及向心肌样细胞分化的

4、能力等生物学特性的影响，探讨原代人羊膜上皮细胞干性标志物SSEA-4的表达水平与人羊膜上皮细胞生物学特性变化之间的关联性。方法：使用统一分离方法获得原代羊膜上皮细胞并进行体外培养。利用CCK-8、流式细胞仪及real-time PCR等手段检测不同培养阶段人羊膜上皮细胞的增殖、表型以及向心肌样细胞分化的能力。结果与结论：不同胎儿样本来源的原代人羊膜上皮细胞的SSEA-4表达在26.7%-97%，存在很大的个体差异。并且，随着传代次数的增加，人羊膜上皮细胞的SSEA-4表达水平显著降低，其下降程度与原代SSEA-4的表达水平无关。另外，培养后人羊膜上皮细胞的心肌分化潜能也存在很大个体差异，且其差

5、异与原代人羊膜上皮细胞的SSEA-4表达水平的高低无关。结果提示，不同胎儿样本来源的原代人羊膜上皮细胞的SSEA-4表达水平受到个体差异的影响，需要建立更准确的临床样本筛选指标来稳定获得原代高表达SSEA-4的胎儿样本，以实现对人羊膜上皮细胞的质量监控。另外，体外培养过程中SSEA-4的表达水平受到培养条件的影响，需要继续优化培养条件以维持其高表达。此外，人羊膜上皮细胞向心肌样细胞分化的能力受到样本个体差异以及培养条件的影响，在今后还需要进一步研究。连建春，刘洋，刘畅，吕世杰，郭昕，南丰，孙广炜，贺欣，马小军. 体外培养人羊膜上皮细胞的表型及分化能力J.中国组织工程研究，2014，18(2):

6、211-217.Phenotype and differentiation capacity of human amniotic epithelial cells cultured in vitro Lian Jian-chun1, Liu Yang2, Liu Chang2, 3, Lv Shi-jie4, Guo Xin2, Nan Feng5, Sun Guang-wei2, He Xin1, Ma Xiao-jun2 (1The Laboratory Medical College, Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning

7、Province, China; 2Laboratory of Biomedical Material Engineering, Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, Liaoning Province, China; 3University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 4Dalian Maternity Hospital, Dalian 116021, Liaoning Province

8、, China; 5Department of Orthopedics, the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116023, Liaoning Province, China)连建春，男，1986年生，山西省大同市人，汉族，大连医科大学在读硕士，主要从事干细胞生物学以及生物材料研究。并列第一作者：刘洋，男，1979年生，辽宁省昌图县人，汉族，2007年大连理工大学毕业，博士，副研究员，主要从事(干)细胞生物学、生物材料以及组织工程研究。通讯作者：孙广炜，博士，副研究员，中国科学院大连化学物理研究

9、所生物医用材料工程组，辽宁省大连市 116023并列通讯作者：贺欣，硕士，副教授，大连医科大学检验医学院，辽宁省大连市 116044doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.02.009 http:/www.crter.org中图分类号:R318文献标识码:B文章编号:2095-4344(2014)02-00211-07稿件接受：2013-10-16AbstractBACKGROUND: Human amniotic epithelial cells are an important source of cells in regenerative medicine a

10、s its 3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 kf23385083multipotentation, but new studies mainly focused on differentiation features and there were little research onLian Jian-chun, Studying for masters degree, the Laboratory Medical College, Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning Province, China

11、Liu Yang, Doctor, Associate investigator, Laboratory of Biomedical Material Engineering, Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, Liaoning Province, ChinaLian Jian-chun and Liu Yang contributed equally to this paper. Corresponding author: Sun Guang-wei, Docto

12、r, Associate investigator, Laboratory of Biomedical Material Engineering, Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, Liaoning Province, ChinaCorresponding author: He Xin, Master, Associate professor, the Laboratory Medical College, Dalian Medical University, Da

13、lian 116044, Liaoning Province, ChinaAccepted: 2013-10-16effect of culture in vitro on biological property of amniotic epithelial cells. OBJECTIVE: To analyze the effects of in vitro culture on growth, cell phenotype and differentiation capacity of human amniotic epithelial cells into cardiomyocyte-

14、like cells, and explore the correlation of primarily cultured human amniotic epithelial cells marker SSEA-4 expression level and the change of biological characteristics of human amniotic epithelial cells. METHODS: Primarily cultured human amniotic epithelial cells were obtained from amniotic tissue

15、s by using the same separation protocol. Human amniotic epithelial cells were cultured in vitro. The proliferation, cell phenotype and the differentiation capacity of human amniotic epithelial cells into cardiomyocyte-like cells were evaluated by means of cell counting kit-8, flow cytometry and real

16、-time PCR. RESULTS AND CONCLUSION: The SSEA-4 positive cells in primarily cultured human amniotic epithelial cells from different fetal tissues were between 26.7%-97%, which indicated that there was great individual difference among amniotic tissue samples. Moreover, with passage, the SSEA-4 express

17、ion in human amniotic epithelial cells decreased significantly, which did not correlate with the SSEA-4 expression in primarily cultured human amniotic epithelial cells. Results indicated that there was great individual difference in SSEA-4 expression level in primarily cultured human amniotic epith

18、elial cells from different amniotic tissue samples. Thus, it is necessary to set up clinical screening indexes to get samples with higher SSEA-4 expression stably and to control the quality of human amniotic epithelial cells. In addition, during culture period, SSEA-4 expression level was affected b

19、y culture conditions. The culture conditions of human amniotic epithelial cells should be optimized to maintain SSEA-4 expression at a high level. In addition, the differentiation capacity of human amniotic epithelial cells into cardiomyocyte-like cells was also affected by individual difference amo

20、ng different samples and culture conditions, which will be further studied in the future. Subject headings: stem cells; amnion; epithelial cells; cell differentiation; myocytes, cardiac; antigens, surfaceFunding: the National Natural Science Foundation of China, No. 31271055, 81101757, 21076207; the

21、 National Key Science and Technology Project of China, No. 2012ZX10002-011-013; Science and Technology Foundation of Dalian, No. 2012J21DW029Lian JC, Liu Y, Liu C, Lv SJ, Guo X, Nan F, Sun GW, He X, Ma XJ. Phenotype and differentiation capacity of human amniotic epithelial cells cultured in vitro. Z

22、hongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2014;18(2):211-217.215ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction羊膜是胎盘的重要组成部分之一，由羊膜上皮细胞层、基底膜及间充质细胞层组成1-2。人羊膜上皮细胞作为一种干细胞，表达SSEA-4等干性标记物，同时具有向心肌、肝以及胰岛细胞等多系分化的潜力3-6，另外，人羊膜上皮细胞来自临床废弃物，且免疫原性低，使用人羊膜上皮细胞不会给供者带来痛苦，不存在伦理问题，适合异体移植7-8，因此人羊膜上皮细胞具有广泛的临床应用前景9-11。此外，除

23、了造血干细胞、间充质干细胞，近年来国内脐血库也开始收集和保存羊膜上皮细胞，其不断增长的样本数量和标准化样本处理流程为未来羊膜上皮细胞的大规模临床应用奠定了重要的产业化基础12-14。但是，单份胎儿羊膜样本所获得的干细胞数量有限，为了满足干细胞移植治疗的目的，需要对干细胞进行体外培养15。但是，研究发现体外培养过程会对胎儿来源干细胞的生物学特性造成一定的影响，如脐带来源间充质干细胞随着传代次数的增加出现了明显的衰老，并且其向成骨、脂肪以及心肌细胞的分化能力发生了明显改变17-19。对于人羊膜上皮细胞，目前的研究多集中在对其分化能力的考察20-24，关于体外培养过程中人羊膜上皮细胞的表型和分化能力

24、等生物学特性变化的研究还比较少。另外，SSEA-4作为一个主要的人羊膜上皮细胞干性标志物，其表达水平是否与人羊膜上皮细胞生物学特征变化具有一定的内在联系还不明确。因此，实验初步考察了体外培养对人羊膜上皮细胞表型及分化能力的影响，着重探讨了原代人羊膜上皮细胞的SSEA-4表达水平与人羊膜上皮细胞生物学特性变化之间的关联性，从而为人羊膜上皮细胞的生物学研究以及未来的临床应用提供了一定的依据。1 材料和方法 Materials and methods 设计：细胞学水平，对比实验。时间及地点：于2012年10月至2013年7月在中国科学院大连化学物理研究所生物医用材料工程组完成。材料：8例人羊膜组织样

25、本来自大连市妇产医院。实验获得了大连市妇产医院伦理委员会的批准，相关孕妇均签署了知情同意书。提供样本的孕妇无合并症及并发症，均采用阴道分娩方式。由协和干细胞基因工程有限公司大连分公司统一将人羊膜上皮细胞由羊膜组织中分离，并获得原代人羊膜上皮细胞。实验方法：人羊膜上皮细胞的传代培养：当人羊膜上皮细胞生长至90%融合时，使用PBS洗涤，之后用0.25%胰蛋白酶(含0.02% EDTA)于37 消化3 min，然后加入培养基终止胰蛋白酶作用，之后1 000 r/min离心 5 min，弃上清，细胞沉淀用培养基重新悬浮后，按照12的比例进行传代培养。每3 d更换新鲜培养液，使用相差显微镜观察细胞形态。

26、人羊膜上皮细胞培养、分化及检测实验的主要试剂及仪器：试剂及仪器来源商业化培养液协和干细胞基因工程有限公司大连分公司心肌分化的RPMI 1640 培养基、胎牛血清Hyclone公司抗坏血酸磷酸钠Sigma-Aldrich公司CCK-8试剂日本同仁公司0.25%胰蛋白酶(含0.02% EDTA)Gibco公司mouse anti-human HLA-DR、CD34、CD45、mouse IgG-FITC、IgG-PE以及SSEA-4 (PE)BD Pharmingen公司TRIzol、PrimeScriptTM RT、2X SYBR Premix Ex TaqTM IITAKARA公司相差显微镜(

27、Eclipse TE2000-U)Nikon公司酶标仪Labsystems Dragon公司流式细胞仪(Well Scan MK3)BD FASCaliburReal-time PCR仪(Stratagenes Mx3000 P Real-Time Cycler)Agilent Technology公司人羊膜上皮细胞的增殖检测：按照CCK-8试剂的说明，将细胞接种于96孔培养板，接种密度为4103/cm2。每天更换新鲜培养基，并取3个平行孔加入含20 L CCK-8的培养基200 L/well，于培养箱内孵育1 h后，用酶标仪测定每孔的吸光度，测定波长为450 nm，参考波长为630 nm。人

28、羊膜上皮细胞的表型鉴定：将对数生长期的人羊膜上皮细胞用胰蛋白酶消化并洗涤后，细胞浓度均调至1 109 L-1。取细胞悬液200 L，加入荧光标记单抗3 L混匀，在室温下避光孵育30 min洗涤后用流式细胞仪检测，以mouse IgG-FITC、IgG-PE作为阴性对照。人羊膜上皮细胞的心肌诱导：参照文献报道的方法进行心肌诱导8，将第2代人羊膜上皮细胞以104/cm2的密度接种于培养瓶中，加入含有体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养48 h后，更换为含有1 mmol/L抗坏血酸磷酸钠的分化培养液，继续培养14 d，每3 d更换新鲜分化培养液。以正常人羊膜上皮细胞作为对照组。Rea

29、l-time PCR：待细胞于平面培养至对数生长期，按照试剂盒说明书提取RNA，并进行反转录合成cDNA和实时荧光定量PCR。反转录条件为：37 15 min，85 15 s。实时荧光定量PCR条件为：预变性95 30 s，PCR反应95 5 s，60 34 s，扩增45个循环。心肌标志物为Nkx2.5及Gata4，以-actin作为管家基因(表1)。主要观察指标：体外培养过程中造血细胞抗原CD34、CD45以及白细胞抗原HLA-DR、人羊膜上皮细胞干性标志物SSEA-4变化情况，诱导后细胞心肌标志物Nkx2.5、Gata4表达情况。统计学分析：利用OriginPro 7.5进行数据统计，使用

30、one-way方差分析，当P 0.05时认为差异有显著性意义。2 结果 Results 2.1 原代人羊膜上皮细胞的生长以及表型分析 原代人羊膜上皮细胞呈现鹅卵石样上皮细胞形态，细胞之间排列紧密，核位于细胞中央，清晰可见(图1)。流式细胞仪分析显示，不同样本来源的原代人羊膜上皮细胞的造血细胞抗原CD34、CD45以及白细胞抗原HLA-DR表达均低于1%，为阴性；而人羊膜上皮细胞干性标志物SSEA-4的表达在26.7%-97%，最高和最低表达之间相差约4倍(图1B)，这说明尽管分离方法相同，来源于不同个体的原代人羊膜上皮细胞的SSEA-4表达仍存在很大个体差异。2.2 体外培养后人羊膜上皮细胞的

31、生长和表型变化 流式细胞仪分析显示，与原代人羊膜上皮细胞相比传代后人羊膜上皮细胞(第2代，P2)的CD34、CD45及HLA-DR的表达水平无变化(图2A)，而干细胞标志物SSEA-4的表达则由(46.829.8)%下降到(27.921.6)%，且样本之间仍存在较大个体差异(图2B)。另外，第2代人羊膜上皮细胞在培养第9天达到平台期，细胞扩增了约9倍，提示这一代数的人羊膜上皮细胞具有较好的增殖能力(图2B)。由于原代人羊膜上皮细胞的SSEA-4表达存在很大差异，为了解体外培养后SSEA-4的表达和原代细胞SSEA-4表达之间的关联性，接下来作者选取了SSEA-4分别高(97%，标记为high)

32、、中(51.6%，标记为medium)、低(26.7%，标记为low)表达的3个原代人羊膜上皮细胞样本进行体外培养，观察培养后各个样本人羊膜上皮细胞形态和表型的变化。实验结果显示，不同样本之间以及相同样本培养前后细胞形态无明显差别(图3)，在传代过程中大部分细胞均保持了上皮细胞形态，同时也具有少量间质形态的细胞。细胞表型分析则显示，培养后3个样本的SSEA-4表达均出现了明显降低，分别下降了88.3%(高)、56.2%(中)及8.6%(低)。由此可见，原代SSEA-4表达较高的样本在培养后下降得最快，而表达较低的样本培养后下降得最慢，此结果提示原代SSEA-4的表达高低与传代后人羊膜上皮细胞干

33、性标志物SSEA-4表达水平无关。表1 体外培养的人羊膜上皮细胞表型及分化能力所用引物序列Table 1 Primer sequence of differentiation capacity of human amniotic epithelial cells cultured in vitro TargetPrimer sequence (5-3)Genbankacc No.Nkx2.55-CCC CTG GAT TTT GCA TTC AC-35-CGT GCG CAA GAA CAA ACG-3NM_004387Gata45-GTT TTT TCC CCT TTG ATT TTT GA

34、T C-35-AAC GAC GGC AAC AAC GAT AAT-3NM_002052-actin5-TGG CAC CCA GCA CAA TGA A-35-CTA AGT CATA GTC CGC CTA GAA GCA-3NM_001101100908070605040BA阳性细胞比例(%)210CD34 CD45 HLA-DR SSEA-4图1 原代人羊膜上皮细胞的形态和表型分析Figure 1 Morphology and phenotype analysis of primarily cultured human amniotic epithelial cells 图注：图中A

35、为原代人羊膜上皮细胞的形态(标尺100 m)；B为原代人羊膜上皮细胞的细胞表型分析。相差显微镜观察显示，原代人羊膜上皮细胞呈现上皮细胞形态；流式细胞仪分析则显示，CD34、CD45以及HLA-DR均低于1%，呈阴性，而原代人羊膜上皮细胞干性标志物SSEA-4的表达水平在26.7%-97%，这说明不同胎儿样本来源的人羊膜上皮细胞的SSEA-4表达水平具有很大的个体差异。SSEA-阳性细胞比例(%)P0P22.01.51.00.508060402001.00.80.60.40.20B2B11B4B6B5A3A2A1阳性细胞比例(%)AB3CD34 CD45 HLA-DR 0 1 2 3 4 5 6

36、 7 8 9 10 11 12P0 P2培养时间(d)A4SSEA-4阳性细胞比例(%)P0P2100806040200高 中 低样本中SSEA-4表达图2 体外培养后人羊膜上皮细胞的表型变化及增殖曲线Figure 2 Phenotype changes and proliferation curve of human amniotic epithelial cells after culture in vitro 图注：(1) 图中A1为原代(P0)以及体外培养后(P2)人羊膜上皮细胞的CD34、CD45及HLA-DR表达；A2为原代(P0)以及体外培养后(P2)人羊膜上皮细胞的SSEA-4

37、表达；A3为第2代人羊膜上皮细胞(P2)的细胞增殖曲线；A4为原代人羊膜上皮细胞SSEA-4高、中、低表达样本体外培养后SSEA-4表达的变化。(2) 图中B1，B4为高表达样本，B2，B5为中表达样本，B3，B6为低表达样本，不同样本之间以及相同样本培养前后并无明显细胞形态差别，大部分细胞均保持了上皮细胞形态，同时也具有少量间质形态的细胞；B1，B2，B3为第1代细胞，B4，B5，B6为第2代细胞。(3) 如图A1所示，与原代细胞(P0)相比，体外培养后(P2)人羊膜上皮细胞的CD34、CD45及HLA-DR表达水平无明显变化；如图A2所示，与原代细胞(P0)相比，体外培养后(P2)人羊膜上

38、皮细胞的SSEA-4的表达水平显著降低；如图A3所示，第2代人羊膜上皮细胞在培养第9天达到平台期，细胞扩增了约9倍，增殖能力良好。(4) 如图A4所示，与原代细胞(P0)相比，体外培养后人羊膜上皮细胞的SSEA-4表达水平均明显降低，分别下降了88.3%(高)、56.2%(中)及8.6%(低)。可见，原代SSEA-4表达最高样本在培养后下降得最快，而表达最低的样本培养后下降得最慢，结果提示，原代细胞SSEA-4的表达水平高低与培养后人羊膜上皮细胞的SSEA-4表达水平无关。IHGCBEDAF图3 原代SSEA-4高、中、低表达样本心肌诱导后细胞形态(标尺100 m)Figure 3 Morph

39、ology of cells derived from primarily cultured human amniotic epithelial cells with different SSEA-4 expression (high, moderate, and low) after cardiac differentiation (scale bar=100 m) 图注：图中A，B，C为高表达样本，D，E，F为中表达样本，G，H，I为低表达样本；A，D，G为第3天高、中、低表达样本，B，E，H为第7天高、中、低表达样本，C，F，I为第14天高、中、低表达样本。选取SSEA-4分别高(97%

40、，标记为high)、中(51.6%，标记为medium)、低(26.7%，标记为low)表达的3个原代HAEC样本进行向心肌细胞的诱导分化，随着诱导时间的延长，3个样本的细胞形态出现了显著不同。BA图4 出现上皮-间质转化现象样本的人羊膜上皮细胞形态 (标尺100 m)Figure 4 Morphology of human amniotic epithelial cells with epithelial-mesenchymal transition (scale bar=100 m)图注：图中A为原代细胞形态，B为第3代细胞的形态。原代人羊膜上皮细胞呈现鹅卵石样上皮细胞形态；而第3代细胞形

41、态则发生了明显改变，大量细胞变得狭长，出现了间质细胞的形态。以上结果提示，目前的培养条件无法维持人羊膜上皮细胞干细胞标志物SSEA-4的稳定表达。此外，在实验中还发现随着传代次数的增加，某些样本来源的人羊膜上皮细胞形态发生了明显改变，即逐渐失去上皮细胞形态，大量细胞变得狭长，出现了间质细胞形态(图4)。细胞表型分析则显示，在人羊膜上皮细胞干性标志物SSEA-4表达下降的同时，间质细胞标志物CD73、CD90以及CD105的表达则显著升高，超过90%。该结果提示，在目前的培养条件下，体外培养可能会使得某些样本来源的人羊膜上皮细胞出现上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal t

42、ransition, EMT)的现象，这与已报道的研究结果是符合的24。2.3 体外培养后人羊膜上皮细胞心肌分化的潜能 为阐明人羊膜上皮细胞的SSEA-4表达水平与分化能力的关联性，实验考察了上述SSEA-4表达水平不同的3个人羊膜上皮细胞标本的心肌分化能力。结果显示，随着诱导时间的延长，3个样本的细胞形态出现了显著不同(图5)。Real-time PCR检测结果显示，诱导后SSEA-4中表达样本心肌标志基因Nkx 2.5和GATA4明显上调；高表达样本仅出现了GATA4的升高，Nkx2.5未表达；低表达样本并未出现心肌标志物表达(图5)。654321014121086420AB对照组诱导组G

43、ATA4基因表达Nkx2.5基因表达高 中 低高 中 低样本中SSEA-4表达样本中SSEA-4表达原代SSEA-4高、中、低表达样本诱导后心肌标志物Nkx2.5的表达 原代SSEA-4高、中、低表达样本诱导后心肌标志物GATA4的表达。图5 原代SSEA-4高、中、低表达样本诱导后心肌标志物表达Figure 5 Cardiac gene marker expression of cells derived from primarily cultured human amniotic epithelial cells with different SSEA-4 expression (high

44、, moderate, and low) after cardiac differentiation图注：(1) Real-time PCR检测结果显示，心肌诱导后SSEA-4中(medium)表达样本中心肌标志基因Nkx2.5和GATA4明显上调了；高表达样本仅出现了GATA4的升高，Nkx2.5未表达；低表达样本并未出现心肌标志物表达。(2) 结果提示，原代SSEA-4表达水平的高低与培养后HAEC心肌分化潜能无关，原代SSEA-4高表达的样本，培养后其心肌分化潜能不是最高；同时，也发现培养后SSEA-4的表达高低与心肌分化潜能表达也无关，培养后SSEA-4表达居中的样本，诱导后并未出现心

45、肌标志物。以上结果提示，人羊膜上皮细胞的心肌分化能力存在个体差异，而此差异与原代人羊膜上皮细胞的SSEA-4 表达水平无关。3 讨论 Discussion目前SSEA-4被认为是人羊膜上皮细胞主要的干性标志物之一，其表达越高代表人羊膜上皮细胞的干性越强11, 25-26。此次实验首先发现，在相同分离条件下，不同胎儿样本来源的原代人羊膜上皮细胞的SSEA-4蛋白表达水平存在很大的差异，阳性细胞比例在26.7%-97.0%，最高和最低表达之间相差约4倍，这说明不同样本之间原代细胞SSEA-4表达存在很大的个体差异，提示需要建立更准确的临床样本筛选指标来稳定获得SSEA-4高表达的样本，以更好地进行

46、人羊膜上皮细胞的质量监控。已有的研究表明，孕龄对人羊膜上皮细胞干性标记物表达有重要影响，与晚期妊娠相比，来自中期妊娠的羊膜上皮细胞高表达Nanog、Sox-2，Tra-1-60 和 Tra-1-8027。除此之外与胎儿发育相关的指标，如双顶径、体质量等也与SSEA-4的表达相关，但是对于以上结论还需要大量样本的统计和验证。通过探索临床各类指标与人羊膜上皮细胞干性标志物表达等生物学特性之间的关联，将有助于建立完善的人羊膜上皮细胞样本筛选指标，便于为人羊膜上皮细胞样本的质量监控与合理使用提供帮助。另外，虽然本实验使用的商业化培养液中添加了多种利于人羊膜上皮细胞生长的因子，但仍无法维持SSEA-4的

47、稳定表达。其他实验也表明，人羊膜上皮细胞干性标记物的种类及水平受到了培养方法的影响28-30，并且难以稳定维 持18, 31。因此可知，目前的培养条件还不足以维持人羊膜上皮细胞干性标志物的高表达。那么，同样具有SSEA-4等表达的胚胎干细胞、多能诱导干细胞等的体外培养方法可能会给人羊膜上皮细胞的体外培养提供一些启发，如与某些特殊基质细胞进行共培养，或使用条件培养液及添加细胞外基质等，这些问题还需要在今后的工作中进一步探讨。此外，这次实验还发现，不同样本来源人羊膜上皮细胞的心肌分化能力也存在很大个体差异，且与原代细胞的SSEA-4表达水平无关，类似结果在向其他组织分化的研究中也有报道32。因此，

48、想要找到影响体外培养后人羊膜上皮细胞定向分化的关键因素，还需要明确特异性高的人羊膜上皮细胞样本筛选指标及优化维持干性的培养条件。总之，本研究表明人羊膜上皮细胞的表型及分化潜能存在较大的个体差异，而体外培养过程又对其生物学特性产生了显著的影响。建立临床样本筛选指标，获得维持人羊膜上皮细胞干性标志物高表达的培养条件是人羊膜上皮细胞临床应用所需要解决的关键问题。作者贡献：衷心感谢中科院大连化学物理研究所生物医用材料工程组各位老师、同学给予的技术指导及帮助。作者贡献：通讯作者和第一作者(刘洋)负责实验设计，第一、二、三、四、五和八作者负责实验实施，实验评估成文为两位共同第一作者，通讯作者对文章负责。利

49、益冲突：文章及内容不涉及相关利益冲突。伦理要求：人羊膜组织样本来自大连市妇产医院。本研究获得了大连市妇产医院伦理委员会的批准，所有样本均有产妇签署的知情同意书。学术术语：SSEA-4-目前SSEA-4被认为是人羊膜上皮细胞主要的干性标志物之一，其表达越高代表人羊膜上皮细胞的干性越强。作者声明：文章为原创作品，无抄袭剽窃，无泄密及署名和专利争议，内容及数据真实，文责自负。4 参考文献 References1 罗晓婷,李舒梅,文道源等.新鲜制备及中长期保存的羊膜细胞外基质结构特征J.中国临床康复.2006,10(1):79-81.2 高振,罗晓婷,邓炜等.羊膜与羊膜细胞外基质在组织工程中的应用J.

50、中国组织工程研究与临床康复,2007,11(32):6450-6453.3 Heeger PS. Amnion and Chorion Cells as Therapeutic Agents for Transplantation and Tissue Regeneration:A Field in Its Infancy. Transplantation.2004;78(10):1411-1412.4 Akle CA, Adinolfi M,Welsh KI, et al.Immunogenicity of human amniotic epithelial cells after tran

51、splantation into volunteers. Lancet.1981;2(8254):1003-1005. 5 Adinolfi M, Akle CA, Mccoll I, et al.Expression of HLA antigens,beta 2-microglobulinand enzymes by human amniotic epithelial cells. Nature.1982;295 (5847):325-327.6 Sakuragawa N, Tohyama J, Yamamoto H. Immunostaining of human amniotic epi

52、thelial cells: possible use as a transgene carrier in gene therapy for inborn errors of metabolism. Cell Transplant.1995;4(3):343-346.7 Hancheran S, Michalska A, Peh G, et al. Stem cells derived from fetal membranes display multi-lineage differentiation potential. BiolReprod. 2007;77(3):577-588.8 Il

53、ancheran S, Moodley Y, Manuelpillai U. Human fetal membranes: a source of stem cells for tissue regeneration and repaire. Placenta. 2009;30(1):2-10.9 Akle CA, Adinolfi M, Welsh KI, et al. Immunogenicity of human amniotic epithelial cells after transplantation into volunteers. Lancet. 1981;2(8254):10

54、03-1005.10 Sakuragawa N, Tohyama J, Yamamoto H. Immunostaining of human amniotic epithelial cells: possible use as a transgene carrier in gene therapy for inborn errors of metabolism. Cell Transplant. 1995;4(3):343-346.11 Miki T, Lehmann T, Cai H, et al.Stem cell characteristics of amniotic epitheli

55、al cells. Stem Cells. 2005;23(10):1549-1559.12 Hou Y, Huang Q, Liu T, et al. Human amnion epithelial cells can be induced to differentiate into functional insulin-producing cells. ActaBiochimBiophys Sin. 2008; 40(9): 830-839.13 Ursula M, Jorge T, Dinushka L, et al. Transplantation of human amnion ep

56、ithelial cells reduces hepatic fibrosis in immunocompetent CCl4-treated mice. Cell Transplant. 2010; 19(9):1157-1168.14 Wei JP, Zhang TS, Kawa S, et al. Human amnion-isolated cells normalize blood glucose in streptozotocin-induced diabetic mice.Cell Transplant. 2003;12(5):545-552.15 Toda A, Okabe M,

57、 Yoshida T, et al. The potential of amniotic membrane/ amnio- derived cells for regeneration of various tissues. Pharmacol Sci.2007;105(3):215-228.16 Cheng H, Qiu L, Ma J, et al. Replicative senescence of human bone marrow and umbilical cord derived mesenchymal stem cells and their differentiation t

58、o adipocytes and osteoblasts. MolBiol Rep. 2011;38(8): 5161-5168.17 Majore I, Moretti P, Stahl F, et al. Growth and differentiation properties of mesenchymalstromal cell populations derived from whole human umbilical cord. Stem Cell Rev. 2011; 7(1): 17-31.18 PratamaG,VaghjianiV,Tee JY, et al. Change

59、s in culture expanded human amniotic epithelial cells: Implications for potential therapeutic applications. PloS one. 2011;6(11): e26136.19 张路,方宁,陈代雄,等.人羊膜上皮细胞有向心肌样细胞分化的特性J.中国组织工程研究与临床康复,2008,12(3):401-405.20 王建,彭琳,卢光琇.人羊膜上皮细胞干细胞特性及向胰岛素分泌细胞分化的研究J.南方医科大学学报,2011,31(9):1484-1487.21 朱梅,陈东,孟晓婷,等.羊膜上皮细胞移植

60、治疗帕金森病大鼠的实验研究J.中国老年学杂志,2006,2(26):227-230.22 Kakishita K, Elwan MA, Nalkao N, et al. Human amniotic epithelial cells produce dopamine and survive after implantation into the striatum of a rat model of parkinsons disease: A potential source of donor for transplantation therapy. ExpNeurol. 2000;165(1)

61、:27-34.23 Enosawa S, Sakuragawa N, Suzuki S. Possible use of amniotic cells for regenerative medicine. Nippon Rinsho. 2003;61(3):396-400.24 KakishitaK,NakaoN,Sakuragawa N, et al. Implantation of human amniotic epithelial cells prevents the degeneration of nigral dopamine neurons in rars with 6-hydroxydopamine lesions. Brain Res. 2003;980(1):48-56.25 Lv S, Liu Y, Lian J, et al. Proliferation, Stemness and Cardiac Dif