人3型腺病毒重组六邻体蛋白的纯化及免疫学研究研究生

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1、Q260046902 专业做论文目 录中文摘要 2英文摘要 3文献综述 4前言 13实验材料 15实验方法 21实验结果 27讨论 32结论 35参考文献 36致谢 41个人简历 42中文摘要目的 腺病毒(Adenovirus,AdV)是引起人类呼吸道和消化道感染的重要病原之一，严重威胁着人类的健康。腺病毒导致小儿肺炎，尤其是6个月至2岁的婴幼儿腺病毒肺炎最为严重，感染主要是以3, 5, 7型为主,所以建立有效的防治腺病毒感染措施意义重大。六邻体是腺病毒主要的结构蛋白，能够刺激机体产生相应的抗体，抑制病毒体构象的改变，从而中和病毒体。本实验组已经成功克隆并表达了重组人3型腺病毒六邻体L1、L2

2、亚基，本次实验旨在纯化重组六邻体亚基蛋白，检测其抗原性、特异性及体外保护情况。方法在原核表达系统E.coli M15中高效表达重组人3型腺病毒六邻体蛋白。利用Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱进行蛋白纯化。用纯化的重组六邻体蛋白免疫新西兰家兔,利用免疫印迹技术检测其血清中抗体，鉴定该蛋白的免疫原性和反应原性。利用固定病毒-稀释血清方法进行中和实验，计算其中和抗体效价。结果得到纯化的重组人3型腺病毒六邻体蛋白，该蛋白免疫动物后产生高效价抗体,达到1：1024000，该抗体能与人3型腺病毒、含有该蛋白的重组工程菌株以及重组六邻体蛋白发生特异性的免疫印迹反应(Western blot)，不与E.coli

3、M15菌株、BSA蛋白、柯萨奇病毒和Hela细胞等反应，证明该重组六邻体蛋白具有良好的免疫原性和反应原性以及3型腺病毒特异性。在中和实验中，该抗体可以有效地中和人型腺病毒的感染，中和效价为1:800，结论所获得的重组人3型腺病毒六邻体蛋白具有良好的抗原性和特异性,其产生的抗体具有良好的保护作用，为开发研制高效、无毒的腺病毒基因工程疫苗奠定基础。 关键词 六邻体；纯化；免疫保护；中和抗体Purification and study on the immunology of recombinant hexon of human type-3 adenovirusAbstractObject: Th

4、e adenovirus one of the main pathogeny which cause respiratory tract and alimentary infection and cause more and more serious. Adenovirus can cause child pneumonia and the major infected types are type 3, 5 and 7 et al，so to establish an effective step to prevention and cure Adenovirus infection has

5、 a significant meaning. Hexon is the major structure protein of adenovirus. It stimulates the body to produce anti-body and inhibits construct shift of virus to neutralize the virus body itself.we have already cloned and expressed the recombinant hexon of human type-3 adenovirus.Now we intend to pur

6、ify the recombinant hexon of human type-3 adenovirus and detect its antigenicity、specificity and conservation ex vitro. Methods： Under the optimum expression conditions, the hexon protein of human type 3 adenovirus was efficiently expressed in E Coli. The expressed proteins were purified by means of

7、 Ni-NTA affinity chromatography. Using the purified hexon to immune rabbit and test the hexons antigenicity with the method of Western-blot technique. to test neutralization antibody by means of fixed virus-diluted serumway.Results： The hexon of human type 3 adenovirus was purified and was proved to

8、 immune the rabbit with high antibody titer (1:1024000)and the antibody reacted specific with the purified recombinant hexon,not reacted with E.coli、BSA、Coxsackie virus and Hela cell , the recombinant E.coli strain containing the hexon protein and the type 3 adenovirus itself. Thus it was proved tha

9、t the recombinant protein possessed both of the high antigenicity and high specificity to type 3 adenovirus.In NA test , the antibody can neutralize adenovirus effectively and its neutralization antibody titer is 1：800 .Conclusions： The recombinant hexon has high immunogenicity and reactionogenicity

10、 and specificity.Its antibody has remarkable protection. This is very important to produce eficient and nontoxic genetic engineering vaccine against adenovims infectionKey words： hexon, protein purification, immunogenicity,neutralization antibody文献综述腺病毒(Adenovirus,AdV)是引起人类呼吸道和消化道感染的重要病原之一，严重威胁着人类的健

11、康1。在5岁儿童的急性呼吸系统疾病中，腺病毒引起的肺炎较为严重；在3岁以下儿童还易引起急性肺炎，以3，5，7型为主2。近些年在北方地区曾有过腺病毒的暴发流行，严重地威胁着儿童的健康和生命安全，因此，对腺病毒进行快速、特异性诊断和预防具有重大意义。腺病毒六邻体是腺病毒的主要抗原，刺激机体产生抗体，抑制病毒体构象的改变，从而中和病毒体3。本文综述了近些年来腺病毒的国内外研究现状，对其致病性、一般特征、免疫学特性、疫苗及应用进行探讨。一.腺病毒(Adenovirus,AdV)是引起人呼吸道和消化道感染的重要病原之一。腺病毒肺炎是由腺病毒感染肺部引起的肺炎,是病毒性肺炎中最严重的一种。它是由3 型和7

12、 型腺病毒所引起的,主要是由腺病毒造成的气管、支气管上皮广泛坏死,引起支气管管腔闭塞,致使病情加重,最终导致肺功能损害和其他功能障碍。不少危重患儿虽然经过抢救挽回了生命,但由于肺组织破坏较重,遗留不同程度的慢性肺部疾病,如支气管扩张症等,对儿童的健康危害极大4 。肠腺病毒(enteric adenovirus)是婴幼儿腹泻的重要病原体。属于普通腺病毒的40 ,41 血清型,外形与普通腺病毒相同,为直径7080nm 的双链DNA 病毒,主要侵犯婴幼儿,通过人与人的接触传播,也可经粪口途径及呼吸道传播5 。本病无明显季节性,夏秋季略多,可呈暴发流行。临床表现为较重的腹泻,稀水样便,每日330 次。

13、常有呼吸道症状。如咽炎、鼻炎、咳嗽等,发热及呕吐较轻,可有不同程度的脱水征。病程812 d。多数患儿病后57 个月内对蔗糖不耐受,并可伴有吸收不良。二、 腺病毒的分类及其一般特征腺病毒在自然界分布十分广泛，存在于各种动物体内, 分为感染鸟类(Aviadenovirus)和哺乳动物(Mastadenovirus)的两个属。后者从9种不同的宿主中共分离到101种,其中研究最广泛的是人腺病毒。目前,人类腺病毒共发现51种血清型6（以英文字母和数字表示）,可分为AF六个亚属。它们在组织趋向性等方面都有着不同的特性7。AE各组型病毒能在人的组织细胞（肾细胞）常规培养中增殖, 称为普通腺病毒,F组的40、

14、41型病毒是从粪便中发现用常规细胞培养不能增殖的腺病毒,称为肠道腺病毒。有些腺病毒在动物体内可致瘤，在体外能转化细胞8。 腺病毒无包膜，20面体对称，直径为7090nm，有252壳粒，其中20面顶角壳粒为12个五邻体（penton，82KD），每个五邻体有2条纤维，长度相同或不同纤维上带有主要的种特异性抗原决定簇和次要的亚属特异性抗原决定簇。除五邻体外有240个非顶角壳粒，称为六邻体（Hexon,120KD），后者带有主要的属和亚属特异性抗原决定簇和次要的种特异性抗原决定簇9（图一）。 图一、腺病毒的结构Fig 1. Structure of adenovirus腺病毒的形态是特征性的二十面体

15、病毒壳体（Stewart et al., 1993）。其病毒壳体含有三种主要的蛋白：六邻体（II），五邻体基底（III）和纤突（IV），还有多种其他的辅助蛋白VI，VIII，IX，IIIa和Iva2（Fig. 1）。腺病毒基因组是一个线性的双链DNA，其5端与一种末端蛋白（TP）共价结合，5端上还具有末端反向重复序列（ITRs）。病毒DNA与核心蛋白VII和一个称为mu的小肽紧密结合。另一种蛋白V包被在DNA-蛋白复合物上，并且通过蛋白VI为DNA-蛋白复合物和病毒壳体间提供了结构上的联系10。病毒含有一种病毒自身编码的蛋白酶，这种蛋白酶对于加工某些结构蛋白从而产生成熟的具有感染性的病毒是必需

16、的11。腺病毒家族（Adenoviridae）的成员可感染种类相当广泛的有丝分裂后细胞，甚至包括来自高度分化的组织中的细胞，例如骨骼肌细胞，肺细胞，脑细胞和心脏细胞。因为腺病毒可将自身的基因组递送到细胞核中，并且高效率地复制，所以腺病毒成为表达和传递治疗基因的主要候选者12，13。三、六邻体蛋白的结构和功能目前,已对六邻体蛋白（图二）进行了广泛的结构和功能的研究14。每个六邻体是六邻体蛋白的同源三聚体，是大于900个残基的复杂蛋白15。三聚体的六邻体分子有一个五面体的基底和三角形的塔尖，基底包含两个区域P1、P2区，经过对Ad2电子显微镜观察和x线衍射分析，P1、P2在内部卷曲成8个稳定的折叠

17、反向平行结构,塔区由三个环构成Loop1、Loop2、和Loop4。通过用一组单克隆抗体来检测不同型的纯化的六邻体蛋白表明，在六邻体表面有许多的抗原决定簇存在在这几个环上。对Loop1、Loop2、Loop4进行了研究，其中Loop2、Loop4卷曲成团，和三聚体中的其它两个多肽链的相应区域相互作用,环间相互指状突起使得三聚体的结构相当稳定16。Loop1是最长、最复杂的环，自身折叠许多倍，向外突起最大限度的与周围环境相互作用。对15个不同型的腺病毒的六邻体蛋白的核酸序列研究表明基底的P1、P2区是保守的，变化区主要集中在Loop1、Loop2区17。Loop1、Loop2的所对应的氨基酸是1

18、4191428个氨基酸，其中有250个变化的残基，存在有七个独特的超变区（HVR），在这七个HVRS中，HVR1HVR6出现在Loop1中，HVR7在Loop2的塔尖。这些HVRS在不同的血清型之间的长度有所不同，变化范围在238个氨基酸之间。其中HVR1、HVR2、HVR4、HVR5、HVR7中含有中和抗原决定簇的一部分18，而且抗原决定簇的至少包括两个或两个以上的HVRS。在这五个HVRS中包括大于99%的六邻体型特异性残基。在Loop1、Loop2当中，这些保守性残基形成HVR区的框架，代表着临近区域的不连续链的相互作用，2/3的保守序列是疏水性的更说明它们承担的是结构功能。在HVRS区

19、中，HVR1、HVR6是Loop1内部支持区，而且HVR1是残基变化最多的区域。HVR4、HVR5是Loop1的主要外部支持区，HVR5位于塔尖，塔区的重量变化主要由这两个区域来决定。目前，这五个HVRS区相应的氨基酸序列以及所对应的核苷酸序列已经确定。由于这五个HVRS位于Loop1、Loop2, 所以Loop1、Loop2是较好的中和抗原决定簇19。图二、六邻体蛋白的结构Fig 2.Structure of hexon六邻体是病毒的主要抗原蛋白,含有大量的抗原表位,如型、型间及组特异性抗原表位及中和性表位。但大部分抗原表位在蛋白的一级结构上还没有被确切定位20。不同型别的六邻体有很高的保守

20、(78%95%)21，型间与组特异性抗原表位定位于这些保守的区域，可能具有一定的抗原性，可作为病毒感染性疾病诊断的靶抗原位点。在六邻体的前段和中段,有大量的抗原性高峰及较密的亲水性高峰区域。该区域含有大量的保守区，可能具有较强的抗原性及很好的暴露性，并期望能够作为型间特异性表位，诱导高效价的抗HAdV特异性抗体。六邻体的后段主要由环4、P2区组成，尽管该区域在病毒颗粒上亦有较好的抗原暴露性，并且序列的同源性较高，但疏水性氨基酸残基较多。抗原性预测分析显示，六邻体后段的抗原性高峰较稀少，相反，疏水性高峰多而密，提示该区域的总体抗原性较弱。四、腺病毒血清型的确定腺病毒血清型的确定是根据感染性中和反

21、应，它是型特异性，直接针对六邻体蛋白的中和抗原决定簇。血清型又根据核苷酸的同源性、纤维蛋白的特性以及生物学特性来区分为六个亚型（A、B、C、D、E、F）另据研究发现，在这几个中和抗原决定簇所在的几个超变区HVR1、HVR2、HVR4、HVR5、HVR7当中，发生了广泛的染色体的非正常重组22，包括短的直接重复序列的缺失、插入、重叠。而且Adv血清型的进化是由于在HVRS中发生非正常的重组（抗原行迁移），并伴随有单一碱基的突变。，而且六邻体蛋白的血清特异型也位于Loop1、Loop2的七个HVRS中。在HVRS的重组又形成独特的新的血清型，这种独特的血清型由组成中和抗原决定簇的残基的数目、位置、

22、生物学特性所决定。此处需要指出的是血清型的鉴定不局限于中和反应，有研究者利用限制性酶切分析，鉴定特异性区域(SSR)来确定血清型，而且所需的时间比中和反应所需的时间少的多，前者只需一周，后者要三周，最后二者的结果完全相同。也有人利用六邻体蛋白的一个结构部分pIX进行亚型的鉴定，pIX是14.3KDa六邻体很小的组成蛋白，它位于每个六邻体壳粒的中间，C末端序列暴露在壳粒表面，N末端伸向壳粒内部，pIX的作用是作为一个粘性因子连接六邻体六邻体，而且它在DNA包装的过程中也起到重要作用。pIX的核甘酸序列在不同的亚型间表现出明显的差别。有研究小组设计特异的引物，应用聚合酶链反应(PCR)，可以是全部

23、的pIX基因以亚型特异的方式进行扩增，说明利用pIX进行PCR分析，有助于腺病毒亚型的鉴定23,24。另据研究发现，在这几个中和抗原决定簇所在的几个超变区HVR1、HVR2、HVR4、HVR5、HVR7当中,发生了广泛的染色体的非正常重组，包括短的直接重复序列的缺失、插入、重叠。而且Ad血清型的进化是由于在HVRs中发生了染色体非正常的重组(抗原性迁移)，并伴随有单一碱基的突变。HVRs的重组又形成了独特的新的血清型，这种独特的血清型由组成中和抗原决定簇的残基的数目、位置、生物学特性所决定。五、六邻体的免疫学反应为了研究腺病毒衣壳的三个主要成分所引起的免疫反应，将复制缺陷型腺病毒（Rec-Ad

24、）注射到BALB/C小鼠体内进行研究。实验结果表明，采用不同的免疫方式，产生的免疫反应有所不同。通过iv途径进行免疫，产生anti-Fi(抗纤维)、anti-Pb(抗五邻体)、anti-Hx(抗六邻体)的抗体；通过ip途径进行免疫，则可以产生anti-Hx抗体。由此表明腺病毒有三个结构性抗原25，抗体可以与其结合，发生感染性失活：这些抗原分别是纤维、五邻体、六邻体。Anti-Fi抗体的作用主要是聚集病毒体；Anti-pb抗体的中和作用是阻断酸性细胞进入细胞浆；Anti-Hx抗体，既可以通过聚集病毒体起中和作用又可以在低PH值（PH5.0-PH6.0）下部分抑制病毒体的构象改变，从而中和病毒体2

25、6。病毒的六邻体包膜在最初的感染阶段起着很大的作用，在PH值降低的情况下，六邻体蛋白发生构象的改变，暴露出分子的N-端。PH值诱导的六邻体构象的改变，对于以后五邻体基底的暴露，或是参与病毒体脱去包膜是很必要的27。1983年，有研究人员认为六邻体蛋白为型特异性抗原决定簇，是中和抗原的靶点，是病毒体对免疫选择压力最敏感的部分。它的特异型很可能氨基酸的靶序列决定28。为了研究不同腺病毒六邻体的抗原决定簇的组成，应用61个小鼠腹水（包含Mab），分为三组进行。其中不同的抗原决定簇的分布和标志由Mab进行识别。在研究抗原决定簇组成的过程中，反应型和所有的61个Mab的滴度间接由ELISA来确定29。由

26、Mab识别的抗原决定簇是六邻体型特异性抗原决定簇。用Mab来区分21个不同的六邻体，这61个Mab用交叉反应类型和滴度的相关系数进行处理，由此识别出25个抗原决定簇类型，而且型特异性表位只存在于同源六邻体的表面30。有研究表明，anti-Hx抗体有着极强的中和反应，而且anti-Fi和anti-pb抗体在anti-Hx抗体所获得的中和反应上有着协同效应，而且在由iv中可以引起最强的中和反应活性。Anti-Fi抗体虽然存在，但是它们不能有效的阻断病毒感染，所以说纤维蛋白不是一个很强的中和抗原决定簇，只具有很弱的免疫原性。腺病毒的中和抗原决定簇主要在于六邻体上，在当六邻体被替代或突变将会导致中和免

27、疫反应的缺失。因为六邻体作为腺病毒的主要结构蛋白，参与各种各样的复杂蛋白的相互作用31。有研究者应用比色法进行中和反应的分析。用于定量测定Adv抗体的血清学滴度；在血清学的流行病研究中筛选型特异性中和抗体。尤其当抗体的水平低于50-80%时，用比色法来确定低水平感染更为有效。使用这种方法来大规模地筛选血清和Mab，以获得存在血清标本中的中和抗体值32。六、疫苗的研究八十年代，在军队中广泛应用Ad7作为减毒活疫苗，来预防呼吸道疾病和眼疾病33。有人研究过应用六邻体亚单位通过阴离子交换层析纯化，以获得纯化的牛型腺病毒型的六邻体免疫刺激复合体进行免疫，它可以在兔和牛体内诱导产生中和抗体。由此表明BA

28、V-3六邻体可以制备成多价亚单位疫苗，保护牛抵抗多种呼吸道疾病34。目前国际上主要集中研制腺病毒的基因工程疫苗。病毒的复制及病毒基因表达的减少，对于开发活疫苗和用做基因疗法的载体是所必要的。例如，细胞毒性基因的失活，对于产生减毒活疫苗是很有意义的35。在转导细胞内减少病毒基因的表达，可以导致病毒载体安全性增加。在腺病毒体内，病毒基因的复制和病毒基因的表达可以通过转换控制因素，启动子的替换来减少。曾有人通过E4启动子的转换，使启动子功能减少，减少病毒后期基因的表达。在H1229细胞内，通过E4启动子的替换而构建的载体，所诱导表达的纤维，与野生型相比，大大减少36。随着分子生物学技术的开展，对腺病

29、毒的基因工程疫苗的研究也开展了起来。国际上，有人应用Ad2的loop1区的抗原决定簇在B组苛萨奇病毒中的表达。以苛萨奇病毒作为载体，重组腺病毒六邻体蛋白的L1环，以使其在HeLa细胞内稳定地表达，所表达的蛋白，可以诱导产生既抗腺病毒又抗苛萨奇病毒的中和抗体，进而研制多价的基因工程疫苗37,38。七、病毒感染的特异性免疫（一）体液免疫作用病毒的抗体可自感染者血清中检出，因此较早被发现并进行了较深入的研究。病毒感染后最先出现的是IgM类特异抗体，一般在感染后23d血清中开始出现39。以后则出现IgG类抗体，并随不同病毒种类而持续时间长短不等。一般经粘膜感染并在粘膜上皮细胞中复制的病毒在局部可诱生I

30、gA类抗体。特异性抗体可用于诊断。在体内，中和抗体的抗病毒作用至为重要。1、中和抗体 这种抗体能与病毒结合后消除病毒的感染能力，故在杀灭细胞外的游离病毒中起主要作用。其作用机制是改变病毒表面构型，或与吸附于易感细胞受体的病毒表位结合，阻止病毒吸附并侵入易感细胞和增殖。病毒与中和抗体形成的免疫复合物更容易被巨噬细胞所吞噬、清除或改变抗原递呈途径。有包膜的病毒表面抗原与中和抗体结合后，激活补体，可致病毒裂解。IgG、IgM、IgA三种不同类型免疫球蛋白的中和抗体具有不同的生物学特性。由于IgG分子量小，通过胎盘，新生儿可具有来自母体的中和抗体而得到约6个月的被动免疫保护期。IgM因分子量大，不能通

31、过胎盘。如在新生儿血中测得被动特异性IgM抗体，可诊断为宫内感染。病毒感染后最早出现IgM抗体，故检查IgM抗体可作早期诊断。IgA抗体主要来源于粘膜固有层的浆细胞，存在于粘膜分泌液中，在局部免疫中起主要作用，常可阻止病毒的局部粘膜入侵。2、非中和抗体 有些抗体是针对有包膜病毒的基质或其中的核蛋白，有些抗体是针对病毒表面具有细胞融合功能的酶或病毒复制酶等。因这类抗原与病毒入侵易感细胞不相关，故相应抗体无中和作用，但有时具有诊断价值。病毒抗体的诊断方法随不同病毒而异。3、抗体介导对靶细胞的作用 因有包膜的病毒感染细胞后，细胞膜可出现病毒编码的蛋白，能与相应抗体结合，在补体参与下裂解细胞；也可通过

32、抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）裂解与破坏病毒感染的细胞。4、抗体介导促进作用（enhancement） 抗体与某些病毒结合后，可促进病毒在感染细胞中的复制，如登革病毒、呼吸道合胞病毒等。对抗体增强作用的机制还不明确。实验发现IgG抗体有促进作用，而IgM抗体则无此作用，推测可能当抗体与病毒结合后，更多的病毒进入巨噬细胞而增殖，在细胞表面出现的病毒抗原激发了机体的免疫应答。其中，巨噬细胞释放多种酶（如蛋白激酶、凝血酶等），进一步激活补体和凝血系统，释放血管通透因子而引起一系列病理变化而发生严重疾病。（二）胞免疫作用 对细胞内的病毒，机体主要通过CTL及T细胞释放的淋巴因子发挥抗病毒作

33、用。细胞免疫主要在病毒感染的局部发挥作用，其作用方式为通过免疫细胞接触靶细胞后杀伤靶细胞或在局部释放细胞因子，因此检测细胞免疫的技术较体液免疫为复杂。1、杀伤性T细胞（CTL） CTL的杀伤性作用具有病毒特异性，一般出现于病毒感染后7d左右。当CTL活性开始表现则NK细胞活性逐步降低。CTL接触病毒感染的细胞后，特异地识别与MHC分子结合靶细胞表面的病毒抗原特异肽段。在识别中还有一些附加因子如CD3、CD2和一些粘附分子等。CTL接触靶细胞后被激活并释放穿孔素及细胞毒素，穿孔素是一组酶的统称，其作用类似补体的C9，致靶细胞出现许多小孔。细胞毒素可激活靶细胞内的一些酶、细胞，或自身裂解，或发生凋

34、亡。在多数病毒感染中，因CTL可以杀伤靶细胞达到清除或释放在细胞内复制的病毒体，从而在抗体的配合下消除病毒。因此被认为是使病毒感染恢复的主要机制。2、辅助性T（Th）细胞 Th 细胞可以促进B细胞生长与分化，并活化CTL 及巨噬细胞。由于在小鼠中发现有分泌不同淋巴因子的T细胞类型，对可分泌IL2和IFNg的T细胞称为Th1类型，对分泌IL4，IL5和IL10的T细胞称为Th2类型。在人类亦有类似的分类，但不如鼠中明确。在病毒感染中已发现当患者的Th细胞有上述类型的转换时，病程可以变化，但其机制及意义还有待于对细胞因子在免疫网络中的作用进一步分析后方可阐明。Th细胞功能低下则可影响机体的抗体产生

35、及CTL的作用。3、细胞因子 在实验动物及病毒感染者研究中发现，个别病毒感染后虽CTL有抗病毒作用，但并未发生靶细胞死亡的现象。这一现象在神经系统病毒感染，以及乙型肝炎病毒持续感染中已被证实，其机制是由于释放IFNg等细胞因子所致。有人称这一现象为非溶细胞性T细胞的作用，即通过CD4T细胞在感染病灶的聚集，受特异的病毒抗原所激活，分泌大量抗病毒因子（IFN、TNF）。这些细胞因子又可进一步激活T细胞（CTL，Th细胞）、巨噬细胞或甚至NK细胞，在抑制病毒复制及清除靶细胞内的病毒协同发挥作用。腺病毒六邻体蛋白的Loop1、Loop2是较好的中和抗原决定簇，本实验组已经对这段基因的进行了克隆、表达

36、并优化表达条件，现将其大量表达，纯化重组蛋白，并进一步进行活性鉴定，用作抗原动物免疫，并检测其所产生的抗体。通过中和实验检测其体外保护情况。应用该方法进行疫苗的研制，将是一种安全、可靠、行之有效的方法。因此本实验组针对Loop1、Loop2区(六邻体抗原决定簇所在区)的基因工程疫苗的研制，将可能成为未来高效疫苗研制的一个重要手段。前 言腺病毒(Adenovirus)是DNA病毒,可引起多种疾病,如呼吸道感染、流行性角膜结膜炎、腹泻等。目前已知的人腺病毒有41个血清型,其中某些型别无论是在成人中还是在儿童中可引起急性呼吸道感染的现象已经备受关注 40、41 ,其中人3 型腺病毒(Ad3)是引起急

37、性呼吸道疾病和咽膜热的常见病原体,严重者可引起支气管肺炎。2003年“非典”在我国部分地区流行以来，给我国人民生命健康和国民经济带来了极大的危害，也给人类上了严肃的一课。因而，开展对远比冠状病毒种类多、宿主范围广、感染途径多、致病性强、病死率高、危害严重的腺病毒的预防性研究具有重大的社会意义和经济意义。预防传染性疾病的最好方法就是疫苗，目前，3、4、7型腺病毒口服减毒活疫苗经国外小规模应用已证明有预防效果，但尚未大规模生产和应用，国内还没有相关报道。基因工程疫苗正在研制过程中。六邻体是腺病毒感染的主要抗原蛋白，其中Loop1、Loop2区是较好的中和抗原决定簇，能够刺激机体产生相应的抗体，抑制

38、病毒体构象的改变，从而中和病毒体，本实验通过免疫家兔，观察其状态变化，检测其血清中抗体的产生及特异性，并通过体外实验验证了其具有保护作用，为今后研制高效、无毒的腺病毒基因工程疫苗奠定了基础。实验材料一、菌株及病毒1、工程菌大肠杆菌M15pQE31Hexon本课题组构建42。2、Hela 细胞、人腺病毒3型病毒、M15菌株由哈医大微生物学教研室保存。二、主要试剂盒1、SDS-PAGE中分子量标准蛋白质购自中科院上海生化所。2、Ni-agarose层析柱购自QIAGEN公司。3、DAB显色试剂、羊抗兔IgG抗体购自中山生物制品有限公司。4、预染Marker购自中山生物制品有限公司。三、主要试剂及配

39、制方法（一）SDS-PAGE电泳所需试剂 1、 12%SDS-PAGE分离胶 10.0mlddH2O 3.3 ml30%丙烯酰胺溶液4.0 ml1.5mol/L Tris-cl(pH8.8)2.5 ml10%SDS0.08 ml10%过硫酸铵0.08 mlTEMED0.008 ml2、5% SDS-PAGE 积层胶 3.0mlddH2O2.1ml30%丙烯酰胺溶液0.5ml1.0 mol/L Tris-cl(pH6.8)0.38ml10%SDS 0.03ml10%过硫酸铵0.03mlTEMED0.003ml3、 30%丙烯酰胺溶液丙烯酰 30.0g 亚甲双丙烯酰胺 0.8g离子水（ddH2O）

40、 100.0ml4、10%过硫酸铵 1 g过硫酸铵溶解于10 ml的水中，于4贮存。室温、避光保存。5、2XSDS凝胶加样缓冲液4 X Tris-HCl/SDS,Ph6.8(0.1mol/L) 25ml 甘油 20%（W/V） 20mlSDS 4%（W/V） 4g溴酚兰 0.001%（W/V） 1mg加ddH2O 至100 ml并混匀，等量分装成1ml于-70贮存。6、5 X Tris-甘氨酸电泳缓冲液Tris碱15.1 gGlycine（pH 8.3）94.0 gSDS (电泳极) 5.0 g加ddH2O至1000 ml，使用时1：5稀释，室温贮存。7、025%考马斯亮兰R250染液取考马斯

41、亮兰R2501.25 g，溶解在500 ml甲醇：水：冰乙酸=45：45：10（体积比）的溶液中，用whatman 1 号滤纸过滤，于室温保存。8、高浓度脱色液 甲醇：水：冰乙酸=45：45：10（体积比）混匀于室温贮存。 9、低浓度脱色液甲醇：水：冰乙酸=3：1：6（体积比）混匀于室温贮存。 10、81 mol/L DTT（二硫苏糖醇）用20ml 0.01mol/L 乙酸钠溶液 （pH5.2）溶解3.09g DTT，过滤除菌后分装成1ml 小份贮存于-20（二） 纯化试剂1、 Buffer B (裂解液)磷酸二氢钠 13.8gTris碱 1.2g尿素 480.5g加ddH2O至1000 ml

42、,用NaOH调pH至8.0。2、 Buffer C (洗液)磷酸二氢钠 13.8gTris碱 1.2g尿素 480.5g加ddH2O至1000 ml,用NaOH调pH至6.3。3、 Buffer E （洗脱液）磷酸二氢钠 13.8gTris碱 1.2g尿素 480.5g加ddH2O至1000 ml,用NaOH调pH至4.5。（三）Western-blot所需试剂1、 电转液 1L Glycine 2.9g Tris碱 5.8g SDS 0.37g 甲醇 200ml 用ddH20 定容至1L2、 封闭液（5%脱脂奶粉） 脱脂奶粉 5g PBS 100ml3、1%BSABSA 1gPBS 100m

43、l4、PBS (0.02M PH7.4) 1L NaCl 8g KCl 0.2g Na2HPO4.12H2O 3.6g KH2PO4 0.24g ddH2O 800ml定容至1000ml 调PH至7.4(四) 细胞培养液1、生长液：1X1640培养液 88% 胎牛血清 10% 双抗（P、S） 1%用5.6% NaHCO3溶液调pH至7.2-7.42、维持液：DMEM液 96% 胎牛血清 2% 双抗（P、S） 1%用5.6% NaHCO3溶液调pH至7.27.4(五)SB培养基及其所需试剂SB 培养基胰化蛋白胨 20g酵母提取物 10g 氯化钠 10g加去离子水 950ml并搅拌使之完全溶解，用

44、5mol/L的NaOH调pH值至7.0，定容至1L，高压蒸汽灭菌(15磅，1.034105 Pa)2030 min，4保存。 （六） 其它常用溶液1、1mol/L HCl按以下顺序混合913.8mlH2O86.2ml浓盐酸2、10mol/L NaOH 将400g NaOH溶于450 ml水中，补加水到1L，高压灭菌。3、 0.5 mol/L EDTA（乙二胺四乙酸）称取186 g EDTA溶于800 ml去离子水中，加入NaOH调pH8.0，补加水至1L，高压灭菌。4、50%甘油50 ml甘油，加水至100 ml，高压灭菌。5、10% SDS 在 900 ml水中溶解100 g SDS，加热助

45、溶，加入浓盐酸调节溶液的pH 值至7.2，加水定容至1L，分装备用。 6、 IPTG（异丙基硫代-D半乳糖苷）在8ml蒸馏水中溶解2gIPTG后，用蒸馏水定容至10ml，用滤膜过滤除菌，分装成1ml小份，-20贮存。7、1mol/L Tris在800ml 水中溶解 121.1g Tris碱，加入浓盐酸调节pH值至所需值。 PH HCl7.470ml7.6 60ml 8.0 42ml应使溶液冷至室温方可最后调节pH值，加水定容至1L，分装后高压灭菌。8、乙二胺四乙酸钠（EDTA）用去离子水溶解EDTA，浓度为0.02%，高压灭菌，分装小瓶，于4oC冰箱保存。9、青/链霉素储存液（10000U/m

46、L青霉素和10mg/mL链霉素）称取121mg(1650U/mg)的青霉素和200mg链霉素，溶于20mL去离子水中，经0.22m 的滤膜滤过除菌，分装并储存于20oC避光保存。使用时以1:100倍稀释。四、主要仪器设备1. Heraeus Biofuge 17RS 型低温高速离心机2. HITA CHI 低温高速离心机3. TLT-13V-85V14 型超低温冰箱4. Minsk 16E冰箱5. WS2-261-79HW1型恒温水浴箱6. HH.B11-500 型恒温培养箱7. ML-902 型定时恒温磁力搅拌器8. Microfuge Lite 离心机9. THZ-C 恒温震荡器10. B

47、io-RAD1000/500 型电泳仪11. ZF-4 型紫外透射反射分析仪12. LIBROR HEL-200型电子天平13. UV-265 风光光度计，Shimaduzu14. QL-901 型旋涡混合15. YJ-875 医用净化工作台16. DT-BI 型脱色摇床17. Milli-Q 型纯水器18. HW-8B 型恒温器19. 松下 NN-K563S 微波炉实验方法一、大量诱导表达目的蛋白421、将重组工程菌M15/pQE31hexon接种在含氨苄（100ug/ml）和卡那（50ug/ml）的培养基中培养，同时设空白菌M15作对照，过夜培养。2、将菌液按1：50的比例转接到800ml

48、 LB培养基中，当菌液的OD600值达到0.5时，加入IPTG(诱导剂)至终浓度为1mM进行诱导，37，150转/分钟，培养4小时，离心，6000rpm，10min，收集沉淀。同时取不加诱导剂的菌液作对照。3、加入2SDS上样缓冲液，煮沸5分钟，进行SDS-PAGE电泳，检测蛋白表达情况。二、六邻体蛋白的纯化（一）裂解细菌1、加入12ml Buffer B，充分混匀，裂解细菌，1h；2、辅助超声，工作10s，停10s，功率400w，工作次数20；3、溶液澄清后，离心，12 000rpm，25min；4、收集上清液，以备纯化；（二）大量纯化目的蛋白1、加3.2ml 50% Ni-NTA 的混合物

49、于12ml裂解液，室温下摇床振荡60min；将裂解液-树脂混合物移入空的柱子；移去尾端帽，收集流出液；2、用8ml Buffer C洗去未结合Ni-NTA的蛋白；3、用8ml Buffer D洗脱目的蛋白；4、用4ml Buffer E洗脱目的蛋白；三、蛋白定量 Bradford法431、标准蛋白质溶液：用PBS配制结晶牛血清清蛋白（BSA）成10mg/ml的标准蛋白溶液。2、标准曲线的测定：取7个EP管以10mg/ml的BSA为母液分别配制0，0.1，0.25，0.5，0.75，1.0，1.5mg/ml的标准蛋白质溶液；另取7个EP管每管中加入300l考马斯亮蓝G-250试剂，并在各管分别加

50、入以上浓度的标准蛋白质溶液5l，在室温（2025C）下放置5-15min，通过蛋白质核酸微量检测仪检测。用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。用未加蛋白质溶液的第一支试管液作为空白对照液.3、样品的测定：用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。四、动物免疫1、初次免疫 将500ug纯化的重组人腺病毒六邻体亚基蛋白与完全弗氏佐剂等体积混合，碾磨至油包水状44。背部皮下注射新西兰家兔，观察记录家兔的状态变化.2、2周耳缘静脉进行采血，离心分离血清,分装保存至-20度冰箱中

51、.3、加强免疫 第3周，以减半量(250ug)纯化的重组人腺病毒六邻体蛋白与不完全弗氏佐剂等体积混合,采用通过注射入腹腔的方法进行加强免疫。观察记录家兔的状态变化. 4、第4周耳缘静脉采血，离心分离血清,分装保存至-20度冰箱中。检测抗体效价。根据血清效价决定大量采血，第6周心脏采血，离心分离血清,分装保存至-20度冰箱中。五重组蛋白抗原性鉴定（western-blot）：（一）抗原性鉴定1、安装玻璃板2、配制12的分离胶溶液，依次混合各成分。15%SDS-PAGE分离胶 10 mlddH2O 3.3 ml30%丙烯酰胺溶液4.0 ml1.5mol/L Tris-cl(pH8.0)2.5 ml

52、10%SDS0.1 ml10%过硫酸铵0.1 ml TEMED 0.004 ml一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混和物并进入下步操作。3、.速在两玻璃板的间隙中灌注分离胶溶液，留出灌注积层胶的空间（梳子的尺长再加一厘米）。用吸管小心的在分离胶溶液上盖一层异丁醇。将凝胶垂直放于室温。4、分离胶聚合完全后（30min），清出覆盖液体，用去离子水洗涤凝胶顶部数次以除去未聚合的丙稀酰胺。尽可能除去凝胶上的液体，再用纸巾的边缘吸净残留的液体。5、配制5积层胶溶液，依次混合各成分。5% SDS-PAGE 积层胶 3 mlddH2O2.1ml30%丙烯酰胺溶液0.5ml10%SDS0.03

53、ml1.0 mol/L Tris-cl(pH6.8)0.38ml10%过硫酸铵0.03ml TEMED 0.003ml一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应快速旋动混合物并进入下步操作。6、在已经聚合的分离胶上直接灌注积层胶，立即在积层胶溶液中插入干净的梳子。小心避免混入气泡，将凝胶垂直的放于室温下。7、积层胶发生聚合时，可以在样品中加入2SDS凝胶加样缓冲液，在100加热10分钟，使蛋白质变性。8、积层胶聚合完全后（30分钟），小心移出梳子，立即用去离子水洗涤加样槽以除去未聚合的丙稀酰胺。9、按顺序加样，每加完一个样品后在下槽缓冲液中洗涤加样注射器。最后在所有不用的样品孔中加入等体积的2SD

54、S凝胶加样缓冲液。10、将电泳装置与电源连接（正极应接下槽），凝胶上所加电压为8V/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15V/cm, 继续电泳直至溴酚蓝达到底部，然后关闭电源。11、从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺翘开玻璃板，将胶取下。12、经SDS-PAGE电泳后，将凝胶与6层滤纸、NC膜浸泡于转膜缓冲液中，15分钟。13、修剪膜与滤纸使其与凝胶大小相等，半干转印45分钟。14、转印后取膜置于5%脱脂奶粉中，4oC过夜。15、加入一抗：以封闭液1：2000稀释兔血清为一抗，将膜浸泡于其中盖上盒盖，37oC缓慢摇动，1小时。16、漂洗：以PBS（PH7.4）清洗NC膜15分钟 3次。17

55、、加入二抗：以封闭液1：5000稀释辣根过氧化物酶标记的二抗，将膜浸泡于其中盖上盒盖，37oC缓慢摇动，1小时。18、漂洗：以PBS（PH7.4）清洗NC膜15分钟 3次。19、显色：DAB显色，在4mlSolution B中，滴入4mlSolution A清清摇动，将NC膜浸入其中，观察2-10分钟，终止显色，照相。（二）抗体效价检测进行SDS-PAGE后，将兔血清一抗从1：1000开始按倍比稀释，直到检测不到特异性条带,进行免疫印迹试验，结果照相保存。六、特异性鉴定按上述方法以1：10 000倍稀释的兔蛋白血清为一抗与重组蛋白、BSA蛋白、3型腺病毒、柯萨奇病毒、E.coli M15菌株和

56、细胞进行Western-Blot检测，结果照相保存。七、体外保护试验：（一）腺病毒毒力测定TCID501、细胞培养（1）选生长良好的HeLa细胞，轻轻摇动培养瓶数次，悬浮起浮着在细胞表面的碎片，然后连同生长液一起倒出。（2）从无细胞单层的瓶壁侧加入0.02%EDTA消化液45mL，翻转培养瓶，使消化液浸没细胞。（3）放入37oC二氧化碳孵箱510 分钟，为促进细胞的消化，可以加入37oC预热的消化液，在显微镜下观察，发现细胞回缩、细胞间隙增大后，应立即停止消化。（4）倒出消化液，沿细胞面加入适量的生长液，用吸管反复吹打瓶壁细胞，使细胞分散开，按1传2或1传3进行传代培养。（5） 37oC二氧化

57、碳孵箱培养，接种后30分钟左右可贴壁，48小时更换生长液，一般34天可形成单层，形成单层后再换维持液供实验用。2、病毒接种倒掉细胞培养液，将腺病毒悬液以倍比例进行倍比稀释至10-9,每孔200ul，37oC吸附1.5小时，弃上清，各瓶中换3mL含2%胎牛血清的细胞维持液，在37oC二氧化碳孵箱中常规培养。3、观察细胞病变每隔12小时用普通光学显微镜观察细胞病变（CPE）情况。当50%细胞出现病变时，视为CPE阳性细胞，收集细胞，对72小时未出现细胞病变的接种细胞，视为CPE阴性细胞。同时，设定正常HeLa细胞为阴性对照，以接种相应病毒标准株的HeLa细胞为阳性对照。按照Reed-Muench方

58、法计算TCID5045。(二) 中和试验（固定病毒-稀释血清法） 本试验用于鉴定兔血清中是否含有抗腺病毒的中和抗体。 试验准备 1、Hela细胞培养于96孔微量细胞培养板上。 2、病毒腺病毒悬液，使用前用2%RPMI1640细胞维持液液稀释至200TCID50/0.1mL。3、 血清 待检血清和正常血清（阴性血清）用等量的2%RPMI 1640液（每毫升含青霉素200IU、链霉素200mg）稀释后，于45灭活30min，待冷却后使用。 操作步骤 1、将已灭活处理的待检血清，用2%RPMI 1640细胞维持液作系列倍比稀释，使其血清稀释度由150到112800. 2、分别在上述各管中加入等量的100TCID50的腺病毒悬液，充分摇匀混合。 3、于37温育60min。 4、取出后分别接种于长满Hela细胞单层的96孔微量细胞培养板，每个稀释度4孔，每孔0.