出血与血检性疾病的实验室诊断

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1、出血与血检性疾病的实验室诊断Laboratory Diagnosis of Hemorrhagic and Thrombotic Disease血栓与止血（thrombosis and homostasis）是体内止凝血系统与抗凝血系统动态平衡失调的一种病理生理过程。由于止血活性增强或抗凝血活性减弱，便会导致高凝状态（hypercoagulable state）和血栓形成（thrombus）；相反，则会引起低凝状态（hypocoagulable state）和发生出血症状（hemorrphage）。血栓形成的条件目前公认是由Virchow提出的三个条件：（一） 血管内皮细胞损伤（二） 血流状态

2、的改变（三） 血液凝固性增加：1；遗传性高凝状态，2：获得性高凝状态：手术、创伤、壬辰和分娩前后、DIC、抗磷脂抗体综合征常见疾病：心肌梗死(MI);缺血性脑梗塞（CI）；外周血管病（PAD)；静脉血栓栓塞（VTE）序言正常血管内存在微量血液凝固，但此种凝固仅仅是纤维蛋白原转化为纤维蛋白，并未结合红细胞。这些微量的纤维蛋白贴附在血管内壁，使之更光滑，反而不易发生凝血。一、影响凝血因素血液成分、血管、血液状态二、名词1、血栓性疾病（Thrombotic Disease）：机体内某些因素自发形成血管内血栓，导致局部组织器官缺血的疾病。2、血栓前状态（Prethrombotic States/PTS

3、）：患者体内血液凝固性增高，极易形成血栓的一种状态。其凝血因子、抗凝因子、纤溶系统、血管可能均有异常，血栓前状态是多种因素异常的综合表现。3、高凝状态（Hypercoagulable State/HCS）：特指凝血酶的活性升高或含量升高而引起的血液极易凝固的一种状态。高凝状态是血栓前状态中的一种。4、出血性疾病（Hemorrphagic Disease）：以自发性出血或轻微损伤后即出血不止为主要表现的一种疾病。发病机制：血管壁异常，血小板数量功能异常，凝血功能异常，纤溶功能异常 血管壁和纤溶系统有抗凝作用 血小板和凝血系统有促凝作用 正常人促凝和抗凝系统处于动态生理平衡正常止血机制一、初期止血

4、血管内皮与血小板在初期止血过程中共同作用。1、内皮细胞在血栓与止血中的机制。血管受到损伤后，内皮细胞暴露出带有负电荷的胶原分子，可黏附血小板。血管受到损伤后，血管收缩，也可导致血小板的聚集。1.1.促凝血作用一、血管壁的止血作用1.1.1. 血管反射性收缩，使损伤血管口径缩小。1.1.2. 激活血小板，使黏附的血小板聚集起来。1.1.3. 启动凝血因子，激活内源性凝血途径，促进血液凝固。1.1.4. 局部血粘度增高1.2. 抗凝血作用1.2.1. 合成前列环素，抑制血小板聚集。1.2.2. 合成组织纤溶酶原激活物（t-PA）促进纤溶系统活性。1.2.3. 血管内皮合成肝素。1.2.4. 合成血

5、栓调节素 （Thrombomodulin/TM）。1.2.5. 合成蛋白S2. 血小板在血栓与止血中的机制2.1 血小板的超微结构2.3血小板的正常生理功能：1. 维护血管内皮的完整性：血小板参与血管内皮的再生和修复过程，增强血管壁的抵抗力，家底血管壁的通透性和脆性。2. .止血功能：粘附、聚集在血管破损处，形成白色血栓，2释放活性物资，促进PLT聚集，增强血管收缩3.促进凝血过程，4.血块收缩，形成稳固血栓。5.维持血管壁的完整性，毛细血管的通透性血小板聚集的条件：a. Thromboxane A2/TXA2：作用机制：. 促进血小板膜表现的GPIIb/IIIa 受体构相改变，使血小板聚集

6、. 作用于血小板，使内源性ADP释放。b. ADP： .外源性ADP由红细胞破坏后释放，可促进血小板聚集（I相聚集）。 . 内源性ADP，源于血小板内部致密颗粒。此ADP可促进血小板进一步聚集，形成白色血栓，称为II相聚集。c. Ca2+：Ca2+是血小板聚集的依赖性条件2.2 血小板在血栓与止血中的作用。 2.2.1. 黏附作用：血小板粘附于内皮下暴露的胶原纤维上与血小板糖蛋白（GP）I有关， 而VWF因子是它们中间的桥梁2.2.2. 聚集功能（血小板之间的黏附）需Ca2-、纤维蛋白原、GPIIb-IIa/CD61共同作用。指血小板之间相互的粘附作用，血小板的聚集主要通过：ADP途径；前列腺

7、素环过氧化物及TXA2途径；PAF途径。血小板膜糖蛋白（GP）b/a对聚集起重要作用。GPb/a能形成钙离子复合物，在血小板膜上组成纤维蛋白受体。 2.2.3. 释放功能a-颗粒中PF4-TG为具有标志作用的蛋白，致密颗粒中可释放 ADP。2.2.4. 促凝血功能 提供PF3，血小板激活后磷脂膜发生翻转，将负电荷暴露在表面，使凝血因子易于附着。2.2.5. 血块收缩功能 血小板释放血栓收缩蛋白，使血块进一步收缩、稳定。二 血液凝固及其调节机理1. 凝血因子目前已知的凝血因子有12种，按照每个因子发现的先后，国际上统一用罗马数字命名。因子I：即纤维蛋白原，由肝脏合成的糖蛋白，分子量3.4万道尔顿

8、，正常血浆含量为200400mg/dl，在凝血酶的催化作用下，可转变成纤维蛋白，这是血液凝固的基础。因子：即凝血酶原，亦系肝脏合成的糖蛋白，维生素K是合成的必须原料，因子在凝血活酶的催化作用下，可转变为凝血酶。凝血酶原的正常含量为10-11mg/ml，如含量不足，则出血不易停止，具有自发性出血倾向。因子：又称组织凝血活酶，为含磷脂蛋白，可由各种组织细胞合成，其中脑，肺，胎盘和子宫内含量最多，是激活外源凝血系统的因子。因子：即Ca2+，由饮食而来，正常含量为9-11mg/ml，在凝血过程中的许多环节发挥作用。除去Ca2+，血液便不能凝固。因子：又名前加速素，易变因子，是由肝脏合成的糖蛋白，正常血

9、浆含量为5-10mg/ml，它是在凝血活酶形成的最后阶段起作用的因子。因子：也叫前转变素或稳定因子。是一种糖蛋白，主要在肝脏合成，血浆含量为0.3-0.4mg/ml。是外源性凝血系统所需之因子。因子：又名抗血友病球蛋白或抗血友病因子。由网状内皮细胞和肝脏组织合成，正常血浆含量为15-20mg/ml，若含量偏低或缺乏，则血液不易凝固，即是临床所见的血友病。因子：又名血浆活素成份，由肝脏合成的一种糖蛋白，也是依赖维生素K的因子，正常血浆含量为3-5mg/ml，属内源系统凝血因子。因子：又称司托-普鲁文氏因子，由肝脏合成的糖蛋白。合成时需维生素K作原料，正常含量为5-10mg/ml，是内源系统和外源

10、系统凝血活酶形成共同需要之蛋白酶。因子：别名血浆凝血活素前质。化学本质为糖蛋白，可能由网状内皮系统细胞产生，正常含量0.5-0.9mg/ml，是内源性凝血系统所需之蛋白酶。因子：又名海格曼氏因子，接触因子。可能由网状内皮细胞合成，化学本质为糖蛋白。正常含量0.1-0.5mg/ml，为内源系统凝血之启动因子。它与粗糙面或胶原纤维接触后便被激活，从而引起血浆内原来无活性的凝血因子系列相继被激活，促使血液凝固。因子：又名纤维蛋白稳定因子，或血浆转谷氨酰胺酶，可能来自血小板或肝脏，也是一种糖蛋白。正常血浆含量为2mg/ml，它的主要作用是促使纤维蛋白单体形成氨基桥键多聚体，而增加纤维蛋白的稳定性。以上

11、12个因子排成13个号，其中缺少。原因是后来发现命名的因子即活化因子V，不是独立因子，故取消此名。但其他因此名号不变。十分重要的血小板磷脂（血小板因子PF3）以及后来发现的激肽释放酶原PK（一种单链糖蛋白，参与内源性凝血途径的激活）和高分子量激肽原HMWK（也是一种单链糖蛋白，参与内源性凝血途径激，XIIa对XI的激活有促进作用）也是凝血因子，但都没有编号。2. 凝血过程 三个阶段：第一阶段：凝血酶活酶的形成 第二阶段：凝血酶形成 第三阶段：纤维蛋白形成 a-2-antiplasmin/a-2-Apl/a2-抗纤溶酶Protein C/PC/蛋白CTissue Factor/TF/组织因子An

12、tithrombin /AT/抗凝血酶Protein S/PS/蛋白SThrombomodulin/TM/血栓调节蛋白Dermatan Sulfate/Ds/硫酸皮肤素Platelet factor3/PF3/血小板因子3Heparin Cofactor II/HC II/肝素辅因子IIStreptokinase/SK/链激酶Plasminogen/PLG/纤溶酶原Activated Protein C/APC/活化蛋白CHigh molecular weight kininogern/HMWKUrokinase/UK/尿激酶Plasmin/PL/纤溶酶Heparin/HEP/肝素Tissue

13、 Plasminogen Activator/TPA/组织凝血酶原激活物Plasminogen activator inhibitors/PAI/纤溶酶原激活物抑制物Fibrinogen Degradation Products/FDP纤维蛋白原降解产物Thrombin Sensitive Protein/TSP:凝血酶敏感蛋白Fragment 1+2/F1+2/凝血酶碎片1+2三、抗凝机制1.细胞抗凝机制2.体液抗凝机制a. 肝素（Heparin）肝素可促进AT-构型发生变化，暴露出与活化因子结合的地点，灭活Xa、IIa。b. 低分子量肝素（Low Molecular Weight Hepa

14、rin/LMWH）整体抗凝效果不如肝素，但抗Xa要强于肝素。c. 抗凝血酶（Antithrombin,AT-）AT-又称肝素辅因子Heparin Cofactor I/HCI 占体内抗凝作用60-70%，先天性AT-缺乏的患者可以形成大量深静脉血栓及反复形成血栓。d. 肝素辅因子与DS（硫酸皮肤素）作用后形成复合物主要灭活IIa。e. 蛋白C系统蛋白C激活后可形成APC（活化的蛋白C）f. 纤维蛋白一旦形成将IIa吸附于表面，即使有的也很快被AT-和HC灭活，局部AT-浓度很低，有利于凝血过程。四、纤溶系统及其作用机制纤溶系统是纤维蛋白溶解系统（fibrinolytic system）的简称，

15、本系统主要的生理作用是溶解纤维蛋白，从而防止和清除血管内由于纤维蛋白沉着而引起的阻塞现象。正常血管内不断有少量纤维蛋白形成，同时有正常的纤维蛋白溶解。纤溶活性亢进特征：1. 皮肤大片状瘀斑或伴有内脏出血2. 创口以渗血为特征，难于止血，尤其是损伤部位3. 血凝块易溶解，对抗纤溶药物有效4. 多为获得性（组织创伤或手术、挤压等）常用筛查实验：1.优球蛋白溶解时间（ELT) 2.纤维蛋白原降解产物测定（FDPs） 3.D-二聚体测定（D-D)1. 参加纤溶作用的成分（1）纤溶酶原（Plasminogen PLG）：可能是由肝脏和粒细胞合成的一种多肽链糖蛋白。正常血浆浓度为15-20%，分子量92,

16、000，被激活物激活后转化为纤溶酶，使纤维蛋白（原）降解。（2）纤溶酶（Plasmin PL）：是纤溶酶原分子中精氨酸颉氨酸肽链被切断后形成的双多肽链分子。是一种活性极强的丝氨酸蛋白水解酶，可直接水解纤维蛋白原，交联和非交纤维蛋白。（3）组织纤溶酶原激活物（Tissue Plasminogen Activator tPA）能够直接催化纤溶酶原转变为纤溶酶的一种糖蛋白，在纤维蛋白存在下能迅速激活纤溶酶原。（4）纤溶酶原激活物抑制物（Plasminogen Activator Inhibitor PAI）：PAI主要有两种，即PAI-1和PAI-2，以PAI-1最为重要，PAI与tPA形成复合物而

17、使其灭活。（5）2-抗纤溶酶（2-Antiplasmin,2-AP），由肝细胞合成的单链糖蛋白，是纤溶酶的主要抑制物。（6）尿激酶（UK）：是由肾髓质产生的一种球蛋白，性质稳定，可从尿中提取。UK是特异性很强的蛋白水解酶，能使纤溶酶原迅速水解成纤溶酶。所以临床上常用它作为溶栓剂。2. 纤溶系统作用机制纤维蛋白溶解也是经过一系列酶促作用降解为低分子量产物的过程，纤溶激活途径又分为内激活途径与外激活途径。2.1. 内激活途径这一途径主要是通过激活内源性凝血因子发挥作用，a使激肽释放酶原（PK）转变为激肽释放酶（K），K能激活纤溶酶原为纤溶酶。2.2外激活途径在这条途径中，主要是组织型纤溶酶原激活物

18、（t-PA）原激酶型纤溶酶原激活剂（uPA），使纤溶酶原激活为纤溶酶，t-PA和u-PA又受纤溶酶原激活物抑制物（PAI）-1及-2的抑制，他们之间的作用、激活和抑制、调节着纤溶活性，具有重要的生理病理意义。3. 纤溶作用的产物3.1. 纤维2蛋白降解产物(FDP)：纤维蛋白（原）经过纤溶酶原作用分解为A，B，C，D，x，y，E等肽段，这些物质统称为纤维蛋白降解产物。FDP增多，标志纤维蛋白或纤维蛋白原降解活性增强。3.2. D-二聚体/D-Dimer：是纤维蛋白单体经活化因子交联后再经纤溶酶水解所产生的一种特异降解产物。只有在外源性血栓形成后才会在血浆中增高，是诊断血栓形成的重要分子标志物。

19、止血与血栓实验室检查的标本采集一、采集标本采血时，首先应确认患者的姓名，并且将姓名和编号写在存血容器上。1、病人处于休息状态，早餐前采血。2、21G1.5/20G1.5型号针头采血，速度慢且均匀，避免产生泡沫。3、采用塑料试管存放全血、血浆，避免玻璃试管激活凝血过程。4、测定APTT和特殊因子的血浆室温放置不能超过2小时，其他血浆不超过4小时。5、血浆置于室温下，应加盖，防止因CO2散失导致PH值的改变。6、避免将血浆置于370C超过10分钟。7、3.2%（0.109mol/L）枸橼酸三钠与血浆1:9抗凝。1500转离心10分钟，取上层草黄色液体即为血浆，立即试验。如不能在4小时内完成所有试验

20、，可将血浆置于-200C条件下，试验前370C快速融化。二、抗凝剂109mmol/L（3.2%）枸橼酸钠做为抗凝剂，与待检测血液1:9体积混匀，避免用力震荡。原理：枸橼酸钠能与血液中的钙离子形成可溶性络合物，从而阻止血液凝固，主要用于血沉，凝血因子和血小板功能试验。止血血栓检测方法分类一、根据检测原理分为：1、凝固法：凝固法的原理是应用缺乏某种血液因子的基质血浆，加受检者血浆或正常血浆后，测定其血浆凝固或纤维蛋白溶解时间，判断受检者血浆中待测因子是否异常。反应结果常以时间（分或秒）或相对活动度（%）表示。如PT、APTT以及各种凝血因子检测均使用凝固法。但是这种方法有一定局限性，不能测定其含量

21、，更不能测定其抗原性。2、产色底物法：人工合成与天然凝血因子相似排列顺序的一段氨基酸，与能水解产色的化学基团相连。测定时由于凝血酶作用于人工合成的肽段底物，从而释放出产色基团。然后用分光光度计进行测定。产生的颜色深浅与凝血酶活性成一定比例关系，故可进行定量。目前最常用的是对硝基苯胺，黄色，波长405nm。a. 直接测定被检血浆中某种蛋白水解酶的活性，如凝血酶，Xa，尿激酶测定等。b. 先将被检血浆中的某种酶原加以激活，然后此活化的凝血酶对人工合成的底物进行水解而产色，如纤溶酶原，蛋白C测定等。c. 向被检血浆中加入过量的有关凝血酶试剂，以中和相应的抗凝物质，然后测定其残余的酶活性，如AT-活性

22、测定，a2-抗纤溶酶测定，肝素测定。 3、免疫学检测法a. 免疫扩散法b. 火箭电泳法c. 双相免疫电泳d.ELISAe. 胶乳凝集法将抗体包被于乳胶颗粒上，然后与被检物结合，形成抗原抗体复合物的胶乳颗粒凝集，用仪器或肉眼进行定量或半定量分析。f. 免疫比浊法将被检物与其相应抗体混合形成免疫复合物，通过免疫透射比浊或散射比浊法进行测定。此法操作简便，准确性好，便于自动化。二、根据检测手段分为：1、手工法1.1. 表面皿挑丝法1.2. 试管倾斜法2、半自动仪器法2.1 电流法2.2. 黏度法（磁珠法）磁珠法目前分为水平磁珠法和摆磁珠法两类，具备精确度高，防止黄疸血、高脂血的影响等优点，但磁珠法易

23、受血浆黏度、反应杯材料等影响。而且在正常凝血过程中，相继形成的软硬血栓会影响水平法磁珠转动的半径，因而其产生的电脉冲不能真实反映生理血凝过程。2.3 光学法：光学法灵敏度高，重复性好，而且易于自动化，目前市场上销售的大部分凝血仪均采用此原理。2.3.1. 透射比浊法：利用样本吸光度的变化判断凝固终点，具体方法有两种。 吸光度增加为终点：样本凝固时，纤维蛋白原转化为纤维蛋白，溶液光密度由小变大。这一光密度的改变被视为凝固终点。此方法灵敏度高，但对于低纤维蛋白原血浆及低凝状态血浆，由于凝固时间延长或不凝，所以不易检出。 吸光度降低为终点：反应中加入具有一定浊度的白陶土试剂和一粒磁珠。标本凝固后，纤

24、维蛋白丝缠绕于磁珠上反而使液体变清，光密度下降，以此作为凝固终点。具备以上优点，而且对于低纤维蛋白原血浆及低凝状态血浆，虽然血浆无法凝固，但产生的微量纤维蛋白丝一样可以缠绕于磁珠上使液体变清，光密度下降。 2.3.2 散射比浊法：其检测原理与透射法基本相同，只是利用样本散射改变判断凝固终点，因此其信号接收系统设计与透射法不同，散射比浊法检测器的位置必须与光路成一定角度。3、全自动凝血仪：加样、加试剂、计算结果、并显示和打印报告。全部实现自动化，具有一定Work Away功能。目前市场上以德国BE公司的Rackrotor、Combi、Compact-X系列、美国强生Electral 400C凝血

25、仪、东亚CA6000等为代表。以德国BE公司为代表综合光学法与黏度法之长处，以光学动态速率比浊法做为检测原理基础，同时结合磁珠法优点，建立了光电磁这一新方法。因为在浊度变化的线性范围内进行检测，所以线性好。对于低纤维蛋白原及其他低凝血浆，虽然肉眼与凝固法均无法检测，但通过浊度的轻微变化，光电磁依然可以检测。同时因为使用动态速率光学法检测，所以不受黄疸等异常血影响。BE全自动凝血仪各项目检测原理表测定项目缩写凝固法产色底物法免疫法凝固酶原时间PT*活化部分凝血活酶时间APTT*凝血酶时间TT*纤维蛋白原FIB*外源性凝血因子，*内源性凝血因子，*活化蛋白C抵抗性APC-R*肝素HEP*低分子量肝

26、素LMWH*抗凝血酶IIIAT-III*蛋白SPS*蛋白CPC*血栓调节蛋白ThromborobulinTM*纤溶酶原PLG*a2-抗纤溶酶原a2-AP*补体1脂酶抑制物CI*组织纤溶酶原激活物tPA*组织纤溶酶原激活物抑制物PAI*纤维蛋白单体FM*纤维蛋白降解产物FDP*D-二聚体D-Dimer*纤维蛋白肽AFPA*凝血酶肽端1+2F1+2*假性血友病因子VWF*止血与血栓的实验室检查一、初期止血异常1. 出血时间（Bleeding Time/BT）【定义】：将皮肤毛细血管刺破后，血液自然流出至自然凝固所需时间称为出血时间。【临床意义】：出血时间与血管、血小板均有关。出血时间的长短主要受血

27、小板数量和功能的影响，其实是血管壁的完整性和收缩功能，而血浆凝固因子的影响较小。BT:a. 血小板明显减少，50*109/L如原发性或继发性血小板减少性紫癜；b. 血小板功能异常，如血小板无力症或药物影响（阿司匹林、潘生丁）；C. 严重缺乏血浆有关因子，如血管性假性血友病（VWD），DIC；d. 血管壁异常，如遗传性出血性毛细血管扩张症；e. 药物影响，如服用乙酰水杨酸等。BT意义不大，某些严重高凝状态或血栓性疾病。【局限性】：受皮肤厚度、温度、性别等影响较大。2. 血小板分析（PLT、MPV）及血小板形态观察血小板平均容积（MPV）和血小板分布宽度（PDW)测定MPV:7-11fL PDW:

28、15-17%MPV增加：1. PLT破坏增加而骨髓代偿功能良好2. MPV增加是造血功能的首要表现MPV减低：1. 骨髓造血功能不良，血小板生成减少mpv随血小板数持续下降，是骨髓造血功能衰竭的指标之一。2. 有半数白血病患者MPV减低PDW增加： 1.表明PLT大小悬殊，见于AML、巨幼贫、CML.、脾切除、巨大PLT综合证、血栓性疾病PDW减低：PLT均一性高，一般无临床意义二、血液凝固异常的检查（凝血因子异常的检查）（一）筛选试验1. 凝血时间（Clotting Time/CT）【原理】静脉血放在玻璃试管中，观察自采血开始至凝血所需时间称为凝血时间。本试验是反映自因子XII被激活后，至纤

29、维蛋白形成，主要反映内源性凝血系统的综合性检查试验【临床意义】CT：1）因子VIII，IX，XI，减少，如甲，乙国，丙型血友病。2）凝血酶原高度减少，如严重肝损害，阻塞性黄疸，新生儿出血等。3）纤维蛋白原生成严重减少，如先天性纤维蛋白原减少症，严重肝损伤等。4）应用肝素，双香豆素等抗凝药物时。5）纤溶亢进使纤维蛋白原降至11.5g/L以下或生成大量FDP时。6）循环抗凝物质增加，SLE。2.血浆凝血酶原时间（Prothrombin Time/PT）【原理】在被检血浆中加Ca2+和组织因子测定其凝固所需要的时间即血浆凝血酶原时间。外源性凝血系统中因子I，II，V，VII，X质或量异常时此试验可延

30、长。PT是外源性凝血试验的综合性试验。【参考值】1）凝血酶原时间11/13s。应有正常对照，病人结果超过正常对照3s以上有临床意义。2）凝血酶原时间比值（prothrombin time ratio,PTR）即被检血浆的PT（s）/正常血浆PT（S）的数值。正常为10.05。3）国际标准化比率（INR）即PTR ISI，参考值为10.05。ISI为国际敏感度指数，指数越小，表示组织凝血活酶的敏感度越佳。INR=（PPT/CPT）ISIWHO规定不同情况下抗凝治疗时合适的INR范围1. 术前2周或口服抗凝药物INR1.5-3（2.25）2. 原发性、继发性静脉血栓的预防INR2.3-3.0(2.

31、5)3. 活动性静脉血栓、反复静脉血栓、肺栓塞预防INR2.0-4.0（3.0）4. 动脉血栓预防INR3.0-4.5(3.5)5. INR缩短：表示高凝状态INR不适用的三种情况： 不适用于测定口服抗凝药初期的病人血浆；不适用于肝病凝血因子缺陷病人的血浆；不 适用于非抗凝治疗而PT延长的病人血浆【临床意义】PT延长见于：1）先天性凝血因子异常，如因子I，II，VI，VII，X之一或两种以上的凝血因子有缺陷时。2）后天性凝血因子缺乏，如严重肝病，维生素K缺乏（慢性肠道病，阻塞性黄疸，新生儿黑粪症），纤溶亢进，DIC，使用口服抗凝药物（双香豆素类），异常凝血酶原增加等。PT缩短见于：血液高凝状态

32、（DIC早期，急性心肌梗塞，脑血栓形成，急性血栓性静脉炎），多发性骨髓瘤，洋地黄中毒，乙醚麻醉后。3. 活化部分凝血活酶时间（Activated Partial Thromboplastine Time/APTT）【原理】本试验时在血浆中加入APTT试剂（接触因子激活物+磷脂）和Ca+后，观察其凝固所需的时间。APTT是内源性凝血系统的综合性检查试验。【正常值】23-50秒【临床意义】APTT：1）先天性凝血因子异常，以甲型和乙型血友病为最常见，其实是接触因子（因子XII，XI）缺乏，VWD等；2）多种凝血因子缺乏如严重肝病，维生素K缺乏，DIC，纤溶亢进等；3）循环抗凝物质。APTT缩短见于

33、DIC高凝期和妊娠高血压在，综合症等高凝状态。4.血栓纤维蛋白原定量测定【原理】常用检测方法有两种：一种是通过PT衍生的纤维蛋白原半定量法。一种是Clauss法，把过量的凝血活酶加入待测血浆，凝固过程中光散射强度与纤维蛋白原含量成正比，不受其他凝血因子干扰。【正常值】2-4g/I【临床意义】纤维蛋白原含量增多见于：1. 高凝状态：如糖尿病伴血管病变，急性心肌梗塞，口服避孕药，手术创伤，恶性肿瘤，深静脉血检形成，动脉粥样硬化，高血脂症等，亦为一种急性时相反应蛋白。2. 生理性：部分正常老人，妊娠晚期血浆纤维蛋白原含量减少见于：1.DIC消耗性低凝血期及纤溶期，2. 原发性纤维蛋白溶解症，低（无）

34、纤维蛋白原血症等。3. 重症肝炎，肝硬化5.凝血酶原肽段1+2测定（F1+2）凝血酶原肽段1+2是凝血酶原转变成凝血酶的过程中水解出来的2个肽段。它的增高，是凝血酶活性亢进的表现，临床上用此实验判断凝血第二阶段的状况。（二）确诊试验1.纠正试验例：如某待测血浆PT延长，加入已知的凝血因子，如PT恢复正常，说明待检血浆缺乏此因子。2.凝血因子活性检测将某凝血因子质控血浆作不同浓度稀释，检测其APTT，画出APTT-活性百分比曲线。将患者血浆与乏该因子血浆混合，测其APTT，在曲线上找出对应的活性百分比。3.因子含量测定通过免疫法测其抗原性，因此几种方法的检测结果可能不同。4.假性血友病因子测定三

35、抗凝异常的检查（一）筛选试验1.凝血酶时间（Thrombin Time/TT）原理在被检血浆中加入：“标准凝血酶”溶液，测凝固所需要的时间即TT。但纤维蛋白原明显减少或有结构异常，或血循环中有抗凝血酶物质（肝素，类肝素，口服抗凝药）和溶栓药（SK,UK,t-PA）时，本试验时间延长。参考值16-18秒，大于3秒以上有意义临床意义TT延长见于：1. 患者血循环中AT-活性明显增高； 2.肝素样物质增多，见于严重肝脏病，胰腺病及过敏性休克等； 3 .FDP增多，如DIC； 4.纤维蛋白原少于0.7g/L，或有异常纤维蛋白时； 5.异常球蛋白增多，如多发性骨髓瘤患者。2.爬虫酶时间（Batroxob

36、in）本实验不受肝素影响，常用于鉴别是否由于肝素增加而造成的TT延长。如果与TT实验结合使用，可以迅速检出低纤维蛋白原血症或高肝素血症。（二）确诊试验1.鱼精蛋白（甲笨胺兰）中和试验原理将1%鱼精蛋白与肝素1：1等体积混合再测TT，因鱼精蛋白与肝素结合后可使之失活，于是凝血酶活性升高，TT降低。可见体内抗凝物质增加。2.血浆抗凝血酶测定（AT-）原理1） AT-抗原量测定（AT-:Ag）用AT-抗体进行单相免疫扩散乳胶凝集，火箭电泳等方法加以测定。2） AT-活性测定（AT-:A）常用发色底物法。在标本中加入一定量的肝素，形成AT-肝素复合物，此复合物即迅速地和凝血酶结合成为AT-肝素-凝血酶

37、复合物，被结合的凝血酶即失去活性，再加入对凝血酶特异性很高的产色肽合成基质（如S-2160），以测定剩余凝血酶的活性，由此AT-的抗凝血酶活性（AT-:A）。临床意义AT-活性减低可导致血栓的形成，见于：1） 生理性减低：妊娠，新生儿；2） 先天性AT-缺乏和功能异常：多并发深部静脉血栓和肺梗塞等血栓性疾病；3） 后天性减低：DIC，慢性肝脏病（肝硬化等），肾脏病，肺栓塞，脑栓塞，心肌梗塞，药物（避孕药，肝素，天门冬酰胺酶等）。AT-活性增高可导致出血，见于： 先于性凝血因子缺乏：如甲型和乙型血友病，因子或因子缺乏症、再障、急性肝炎。 后天性：肾移植，使用抗凝药，蛋白同化类固醇等药物时。3.蛋

38、白C(PC)测定-肝脏合成的VitK依赖因子原理发色底物法临床意义PC缺陷应考虑肝病。因为PC是肝合成，依赖于VitK(如应用VitK拮抗剂，不仅没有抗凝，而且出现血检，并伴有大量皮肤脱落坏死，此时应考虑先天性PC缺陷) PC的生理功能：部分水解V/VIII，降低X与V结合的受体，降低PLT的凝血酶原活性。PC含量或活性减低还可见于DIC、呼吸窘迫综合症、口服抗凝药物等。4.蛋白S(PS)测定-肝脏合成的VitK依赖因子原理发色底物法临床意义PS减低见于先天性PS缺陷。此类患者常并发严重的深静脉血栓。获得性PS减低见于肝脏疾病和口服抗凝药物。PS的生理功能是APC灭活V,VIII的辅助因子。5

39、.血栓调节蛋白（TM）测定原理发色底物法临床意义血栓调节蛋白先天性缺陷，易高凝状态。6.肝素（Heparin）原理发色底物法临床意义肝脏和胰腺疾病时血中肝素可增高。肝素定量常用于肝素抗凝治疗和体外肝素抗凝的监测，以指导临床用药。7.低分子量肝素（Low Molecular Weight Heparin/LMWH）LMWH抗凝功能不如肝素，但其抗Xa作用要远远强于肝素。8.其他抗凝物质：a2-macroglobulin/a2-M),al-抗胰蛋白酶（al-antitrypsin/al-AT）,C1抑制物（C1-inhibitor/C1-INH）等。这些抵制物对多种丝氨酸蛋白酶具有抵制或灭活作用。

40、9.病理性抗凝物质类肝素抗凝物：多种疾病可产生此类物质，具有抵制因子、和凝血活酶的作用。狼疮样物质（LA)：是易栓症高危因子，系统性红斑狼疮和某些自身免疫性疾病可产生狼疮样物质，此种物质属于lgG或lgM,可抵制因子a和xa。干扰基于磷脂的凝血实验，包括PT和APTT，在这些实验中，狼疮样物质起到抑制作用。凝血因子抵制物：常见于血友病甲患者，长期接受因子制剂治疗后，机体产生因子抗体，可抵制因子活性。四.纤溶系统常用检验1.纤溶酶(PL)测定纤溶酶（PL）测定纤溶酶活性增高，见于原发性与继发性纤溶症及应用溶检药物。如链激酶，尿激酶和溶栓蛇毒之后等。纤溶酶活性减低见于血栓前状态与血栓性疾病。纤溶酶

41、不太好测，所以往往测纤溶酶原及其激活物或激活物抵制因子或抑制物复合因子或纤维蛋白原或纤维蛋白降解产物。2. 硫酸鱼精蛋白副凝血试验（3P Test）原理DIC或继发性纤溶亢进时，FDP升高，X、Y片段可与纤维蛋白单体接合从而无法聚合。而鱼精蛋白可使X、Y与纤维蛋白单体解散。因为不是Iia作用，所以称为副凝血。方法0.5ml血浆温育375分钟，加50ul鱼精蛋白，如15分钟内出现沉淀，证明FDP升高。参考值正常人（-） 50mg/L时判为阳性。原发性纤溶和继发性纤溶，3P Test升高。溶栓治疗监测。局限性DIC晚期，X、Y碎片转化为D、E，不会再与纤维蛋白单体结合，所以尽管FDP很高，而3P

42、Test阴性不能排除DIC。3. 纤溶酶原（PLG）测定 纤溶酶原含量增高，表明纤溶活性低下，见于血栓前状态或血栓性疾病。 纤溶酶原含量减低，表明纤溶活性增强，见于原发性与继发性纤溶亢进（DIC），先天性纤溶酶原缺乏症等。4. 组织纤溶酶原激活物（t-PA）测定 t-PA含量或活性增高，见于原发性与继发性纤溶亢进（如DIC）和先天性增高。 减低见于血栓性疾病和血栓前状态，如高脂血症，冠心病，动静脉血栓形成等。先天性t-PA缺乏，患者常表现为多发性静脉血栓形成。5. 纤溶酶原激活物抑制物（PAI）测定 PAI增高，见于血栓性疾病与血栓前状态，减低见于原发性与继发性纤溶症。6. 2抗纤溶酶（2-A

43、P）测定2-AP活性增高见动静脉血栓形成和恶性肿瘤等疾病。减低见于肝脏疾病，DIC，在手术后和先天性2-A缺乏症，使得溶栓药物后2-AP可明显降低。在手术和先天性2-A缺乏症，使用溶栓药物后2-AP可明显降低。7. FDP测定原理FDP是纤维蛋白原（Fg）中纤维蛋白（Fb）被纤溶酶降解产物的总称。在原发性纤溶时，Fg受纤溶酶的水解，在经过中间分解产生X片段和Y片段，最后生成两个D片段和E片段。方法临床上手工多用乳胶凝集法和ELISA法检测FDP。目前全自动凝血仪采用的免疫速率比浊法来检测参考值正常人（-） 50mg/L时判为阳性。总FDP增高是体内纤溶亢进的标志，但不能鉴别原发性纤溶和继发性纤

44、溶。FDP增高主要见于容易引起DIC的基础疾患。原发性纤溶亢进，FDP升高。注意取血不能用枸橼酸钠抗凝，因为含有纤维蛋白原，应采用FDP专用采血管。8. D - 二聚体（D-Dimer）测定 最大临床价值是用于排除DVT和PE.原理在继发性纤溶时，Fb被纤溶酶水解，其水解的Fb是经a交联作用后的Fb。先生成YD/DY，YY/DXD等的中间产物和DD/E的复合物；再进一步被纤溶酶分解为DD(D-二聚体)和E片段，即D-二聚体是继发性纤溶的标志物。方法临床上手工多用乳胶凝集法和ELISA法检测D-二聚体。目前BE公司已推出免疫速率比浊的全自动方法。参考值正常人（一）0.5mg/L临床意义当D-Di

45、mer0.5mg/L时判为阳性。FDP增高时，应当对原发性纤溶和DIC作出鉴别。a. DIC时D-二聚体明显增高。b. 原发性纤溶亢进，D-Dimer正常；但继发性纤溶亢进，D-Dimer升高。a. 深部静脉血栓，肺栓塞，动脉瘤，卵巢癌，急性早幼粒细胞白血病时，D-二聚体也增高。当D-Dimer2.5mg/L时，可诊断深静脉血栓。陈旧性血栓时不增高b. 溶栓治疗监测： ：提示溶栓治疗可能会发生出血的指标： 纤维蛋白原在溶栓后数小时内即降到1.0g/L以下 治疗3日时的血小板计数低于100*109/L APTT延长2.5倍 ：提示溶栓治疗有效的指标： 当纤维蛋白原为1.2-1.5g/L、凝血酶时

46、间在正常的1.5-2.5倍，FDP在300-400mg/L可视为溶栓剂有效，并在较为安全的范围 有人提出凝血酶-抗凝血酶复合物（TAT）大于6ug/L，提示血管持续性闭塞，其敏感度及特异性分别为96.2%和93.1% DD在溶栓药物治疗1h即可迅速增高，4h后更高，24h仍可高于用药前水平。 D-二聚体检测的临床应用 1.深静脉血栓（DVT）肺栓塞（PE)早期排除诊断:当目前临床结合验前概率（PTP)评估为低、中度风险同时患者DD浓度检测cutoff值为阴性（0.5mg/L FEU）即可排除DVT、PE。 2.DIC的早期诊断和动态检测：作为继发性纤溶亢进的标志性物质，DD在DIC的诊断和病程

47、检测上具有良好的应用价值，在DIC形成早期既有DD升高，随病情发展可持续升高达10倍以上，因此DD可作为DIC早期诊断和病程检测的主要指标，与FDP同时测定可大大提高其诊断效率。 3.外科手术后的血栓检测 4.妊高症、先兆子痫的检测 5.恶性肿瘤、白血病早期识别、血栓检测 6.肝脏疾病（重症肝炎、肝硬化） 7.肾脏疾病（深病综合征、肾移植术后） 8.溶栓治疗评估及血栓复发的检测 9.心血管疾病病情评估（心衰、房颤、旁路手术） 10.脑梗死鉴别和治疗检测溶栓治疗的检测：在溶栓治疗中DD含量的变化有以下特点1. 溶栓后DD含量在短期内明显升高，而后逐渐下降，提示治疗有效2. 溶栓后DD含量持续升高

48、或下降缓慢，提示溶栓药物用量不足3. 溶栓治疗应持续到DD含量下降到正常范围，恢复正常的DD是停止溶栓的指证。临床应用一 出血性疾病中的应用 1.一期止血缺陷特征：指血管壁和血小板的缺陷 皮肤、黏膜出血为主，內脏出血少见 创伤后即可出血，持续时间较长 压迫止血有效，止血后不易复发 输血或输血制品效果差（一） 筛检试验的应用 1.毛细血管抵抗力实验（CRP) 2.出血时间(BT) 3.PLT计数（PLT) 4.血块收缩实验(CRT) 一期止血缺陷筛检试验的应用（1） 出血时间（BT）血小板计数（PLT）都正常：除正常人外，多数是由于单纯血管壁通透性和脆性增加所致的血管性紫癜，如过敏性紫癜，遗传性

49、出血性毛细血管扩张症和单纯性紫癜等。（2） BT延长和PLT减少；多数是由于血小板数量减少所引起的血小板减少性紫癜，如原发性和继发性血小板减少性紫癜等。（3） BT延长和PLT正常：多数是由于血小板功能异常或某些凝血因子缺乏所引起的出血性疾病，如遗传性或获得性血小板功能异常症和血管性血友病（VWD），低（无）纤维蛋白原血症（4） BT延长和PLT增多：常见于原发性和继发性（反应性）血小板增多症。 二期止血缺陷筛检试验的作用1. 二期止血缺陷特征：凝血机制和抗凝机制缺陷 深部组织和关节、肌肉或内脏出血难止为主 创口延迟性出血难止，持续时间较长 压迫止血效果欠佳 输血制品有效，易复发 常用筛查实验

50、：1.活化部分凝血活酶时间（APTT) 2.凝血酶原时间（PT) 3.纤维蛋白原含量测定（FIB) 4.凝血酶时间（TT)（1） 活化部分凝血酶时间（APTT）和凝血酶原时间（PT）都正常：除正常人外，见于遗传性和获得性因子缺乏症。（2） APTT延长PT正常：多数是由于内源性凝血途径缺陷所引起的出血性疾病，如血友病，因子，缺乏症。（3） APTT时间正常和PT延长：多数是由于外源性凝血途径缺陷所致出血疾病，如遗传性和获得性因子缺乏症。（4） APTT和PT都延长：多数是由于共同途径的凝血缺陷所致的出血疾病，如遗传性和获得因子，凝血酶原和纤维蛋白原缺陷症等。（二） 血友病的实验室检验1. 血友

51、病的实验室检验（1） 筛检试验APTT延长，PT正常。（2） 纠正试验 曾用STGT或TGT及其纠正试验（3） 凝血因子促凝活性检测：因子，活性（：C, :C）减低是常用的确诊试验，依次可将各因子缺乏症分为重型（2%），中型（2%-5%），轻型（5%-25%）和亚临床型（25%-45%）。（4） 凝血因子抗原含量检测因子抗原含量（：Cag，:Ag）减低或正常。若结合因子促凝活性检测的结果，可配对确定各因子的交叉反应物质（cross reacting material，CRM）属于阳性或阴性。（5） 排除试验做BT和vWF：Ag检测以排除vWD，做覆盖交叉试验以排除各因子的抵制物（尤其因子抵制物

52、）。（6） 携带者和产前诊断：根据临床需要尚可用分子生物学技术作携带者诊断及产前诊断。（7） 基因分析：深入研究尚需作遗传基因分析，以确定基因缺陷的类型，为研究病因和基因治疗奠定了理论基础。2. 血管性血友病（vWD）根据遗传方式，临床表现和实验室检验的结果，大体上可将遗传性vWD分为三型：（1） I型主要是由于vWF量的合成减少所致。而vWF多聚体的结构基本正常。本型患者常为染色体显性遗传。（2）型 主要是由于vWF的结构与功能缺陷所致。又分为A亚型：缺乏中分子量和高分子量的多聚体，故与血小板GPIb结合力减低；B亚型：缺乏大多聚体，但与血小板GPIb结合增高；C型：缺乏大多聚体，致血小板三

53、联体结构异常。型患者除少数外，多数为常染色体显性遗传，临床有轻度到中度的皮肤和黏膜出血倾向。（3）型 主要是由于vWF的抗原和活性均极度减低或缺乏所致。型患者为常染色体隐性遗传，临床出血严重。（三）肝脏疾病出血的应用 肝脏出血的原因非常复杂，涉及一期出血，二期止血，纤溶亢进和血小板异常等各个方面。但主要与以下几个方面有关：1.凝血因子和抗凝因子的合成减少：当肝细胞受损或坏死是，肝细胞合成凝血因子（除Ca2+和组织因子外的其他凝血因子）和抗凝因子（抗凝血酶，肝素辅因子，蛋白C,蛋白S等）的能力减低，这些因子的血浆水平降低，导致凝血和抗凝机制紊乱。2.凝血因子和抗凝因子的消耗增多：肝病常并发原发性

54、纤溶或DIC,此时血浆中纤溶酶水平增高，纤溶酶不仅可能水解纤维蛋白（原），而且可以水解多个凝血因子（因子V，,）,同时也消耗了大量抗凝蛋白。因此，这些因子或蛋白的血浆水平进一步降低。3.循环抗凝物质和血FDP增多：肝病时，肝细胞合成肝素酶的能力减低，使类肝素抗凝物质不能及时被灭活而在循环血液中积累。此外，高纤溶酶血症致使纤维蛋白（原）降解，产生的FDP水平增高。FDP具有抗凝血作用。4.血小板减少及其功能障碍：在肝炎病毒损伤骨髓造血干（祖）细胞，脾功能亢进和免疫复合物等因素的作用下，抑制了血小板的生成和血小板黏附，聚集和释放等功能，致使患者血小板数减少，寿命缩短及其功能低下。据报道，肝病时对观

55、察病程和判断预后有价值的指标之一：因子：C和：C见得，先于肝功能异常，可作为肝病早期诊断的指标之一；Fg和因子V：C减低，反应肝病严重，或进入肝硬化阶段；异常凝血酶原增高是诊断原发性肝癌的有价值指标之一；因子：C和vWF：Ag水平愈增高，反应肝病愈严重，因子：Ag,AT的水平35%或PLG的水平20%均提示预后不佳；肝病时常呈多因子联合变化，故需综合分析。二血栓前状态和血栓性疾病中的应用（一）血栓前状态（Prethrombotic state） 也称血检前（prethrombotic phase）,是指血液有形成份和无形成份的生化学和流变学发生某些变化，这些变化可以反映：血管内皮细胞受损和受刺

56、激；血小板和白细胞被激活或功能亢进；凝血因子含量增高或被活化；抗凝因子含量减少或结构异常；纤溶成份含量减低或活性减弱；血液黏度增高和血流减慢等这一系列的病理状态。在这一病理状态下，血液既有利于发生血栓或血栓塞性疾病，但又不一定会发生。从过去的研究结果和临床实践来看，一般性的血栓与止血检验，如BT,BPC,APTT,PT,TT和ELT等，对研究和诊断血栓前状态缺乏敏感性异性，不能满足临床和研究的需要。因此，目前国内外都开始利用敏感和特异的分子标志物对血栓前状态和血栓性疾病进行检验（表）。 （二）弥散性血管内凝血（DIC）应用1994年，全国血栓与止血学术研讨会提出以下实验指标对DIC的早期诊断有

57、帮助：3. 主要指标，同时有以下三项以上异常：PLT低于100*109/L,或进行性下降（肝病，白血病低于50*109/L），或有两项以上血浆血小板活化产物升高，如-TG,PF4,TXB2和GMP-140；血浆Fg含量低于1.5g/L或进行性降低，或超过4.0g/L（白血病，恶性肿瘤低于1.8g/L，肝病低于1.0g/L）；3P试验阳性，或FDP超过20g/L（肝病超过60g/L），或D-二聚体升高或阳性；血浆PT时间缩短或较正常对照延长3秒以上，或呈动态变化（肝病超过5秒以上）；PLG含量和活性降低；AT含量的活性降低低于60%（肝病不适用）；血浆因子：C低于50%（肝病必备）。4. 疑难病

58、例应用以下一项以上异常：因子：C降低：vWF:Ag升高。：C/vWF：Ag比值降低（低于1：1）；F1+2升高；PAP升高：血或尿FPA升高。三抗凝和溶栓治疗的实验室监测的应用（一）肝素，并发出血率平均为7-10%1APTT：首选指标。应用小剂量肝素（500-10000/24h）时，可以不作监测。但是在应用中等剂量（10000-20000/24h）和大剂量（20000-30000/24h）时，必需作监测试验，使APTT较正常对照值延长1.5-2.5倍，这既可取得最佳抗凝疗效，又无严重的出血风险。2.血浆肝素浓度检测：在APTT为正常对照值得1.5-2.5倍，血浆肝素浓度为0.2-0.5u/ml

59、，这是肝素治疗的最佳选择。（二）口服抗凝剂监测PT：是监测口报抗凝剂的首先指标。据报道，在应用口服抗凝剂的过程中，使PT维持在正常对照值（12.01.0秒）的1.5-2.0倍，使凝血酶原时间比率（prothrombin time ratio,PTR）维持在1.5-2.0为佳。若PTR2.0时，其出血发生率为22%；在PTR2.0时，其出血率仅为4%。然而，目前推广应用国际标准化比率（international normalized Ratio,INR）作为监测口服抗凝剂治疗的可靠指标。最近，美国胸科医师学会推广：DVT，肺梗塞，心肌梗死，组织型心瓣膜置换术，瓣膜型心脏病和心房纤维性颤动的患者，

60、口服抗凝剂治疗的最佳抗凝度是INR为2.0-3.0，PTR在1.3-1.5，然而，在心源性血管栓塞和机械性心瓣膜置换术患者，要求INR在2.5-3.5,PTR在1.5-2.0为最佳选择，此时用药的剂量是安全和合理的。（三）溶栓治疗的监测Fg，TT和FDP监测，持续应用溶栓药物，如链激酶（SK），尿激酶（UK）和组织纤维酶原激活剂（t-PA）等，可致机体处于高纤溶状态。当Fg低于1.5g/L，TT超过正常对照3倍，FDP超过400mg/L时，其临床出血并发症增加3倍，因此，目前多数作者认为，维持Fg在1.2-1.5g/L，TT在正常对照的1.5-2.5倍，FDP在300-400mg/L是最为合适。用以溶栓治疗的实验室检测指标： 试验 参考值 允许范围 用途 优球蛋白溶解时间 120分钟 3060分钟 纤溶酶活性筛选