生物化学检验实验室基本知识

《生物化学检验实验室基本知识》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物化学检验实验室基本知识（52页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、第二章 生物化学检验实验室基本知识学习目标掌握诊断试剂盒的选择与性能指标评价，实验方法与参考物质的分级，五种方法学评价试验的目的、原理、操作、计算及注意事项。熟悉化学试剂的选择、保存与配制，常用临床实验室器材的使用及玻璃仪器的清洗，参考范围和医学决定水平，实验方法与参考物质的相关基本概念，实验方法的正确选择，诊断试验的性能评价。了解实验用纯水。掌握好临床实验室的基本知识，包括实验用纯水，实验室常用器材、试剂、试剂盒，参考范围和医学决定水平，实验方法与参考物质，方法学评价试验，临床诊断性能评价等，才可能保证检测结果的准确度与精密度，能够促进实验室与临床的沟通，因此其对于从事生物化学检验的实验室工

2、作者非常重要。第一节 实验用纯水实验用纯水指天然水和自来水经过蒸馏、离子交换、活性炭吸附、超滤等处理后除去了杂质的水。其质量的高低直接影响到检测结果的准确度和精密度。一、实验室用水等级1985年美国国家临床实验室标准委员会（national committee for clinical laboratory standards，NCCLS）将实验用水分为级、级、级（表2-1）。中国国家技术监督局先后于1992年、2000年批准实施的中国国家验室用水标准（GB6682-92、GB6682-2000），也将分析实验用水分为三个等级（表2-2），两次的区别主要是电导率的计量单位不同。表2-1 美国N

3、CCLS等级纯水的规定及用途(1985)级 别级级级pH未定未定5.08.0电阻率(Mcm, 25,最大量)102.01.0硅(mg SiO2/L,最大量)0.050.11.0微生物含量（每毫升最大菌落数）10103未定硅（mgSiO2/L，最大量）0.050.11.0微粒0.2m微孔膜过滤未定未定有机物质活性碳过滤未定未定用途原子吸收，火焰光度，荧光，电解质，酶，高效层析，电泳，参比液，缓冲液。一般实验室检验，器皿冲洗。器皿洗涤，要求不高的定性试验。 表2-2 中国国家验室用水GB6682-2002标准名称一级二级三级pH范围(25)（未定）5.07.5电导率（25）ms/m 0.010.1

4、00.50比电阻（25，Mcm）1010.2可氧化物质（以O计）mg/L0.080.40吸光度（254nm，1cm光程） 0.0010.01蒸发残渣（10525）mg/L 1.02.0可溶性硅（以SiO2计）mg/L0.010.02可见，级（一级）水最好。临床实验室一般选用级（二级）水即可。水越纯，所含离子就越少，则电阻越大，导电性越差，即电阻率（比电阻）越大，电导率越小。同时，水越纯，所含的SiO2、细菌数、有机物等越少。二、纯水的制备方法（一）蒸馏法自来水(或天然水)在蒸馏器中进行加热气化，水蒸气经冷凝后得到蒸馏水（distiled water，DW）。蒸馏水的电阻率约为0.1Mcm（25

5、）。(二) 离子交换法将自来水通过离子交换树脂以除去水中杂质离子，称为离子交换法。离子交换法制备去离子水（deionized water，DW）的原理是水中的杂质离子先通过扩散进入树脂颗粒的内部，然后水中的Na+、Ca2+等与阳离子交换树脂中的活性基团H+发生交换，水中的Cl-、SO42-等则与阴离子交换树脂中的活性基团OH-发生交换。由于树脂为多孔网状结构，具有非常强的吸附能力，可以同时除去颗粒杂质。去离子水的电阻率约为5.0Mcm（25）以上。蒸馏水与去离子水的英文缩写均为DW。因蒸馏水里面有挥发性物质、有离子干扰，故临床实验室多用去离子水，或先蒸馏、后去离子的纯水。(三)其他方法在制备纯

6、水时，还可采用超滤膜法（除细菌等），活性炭吸附法（除有机物）等，以及采用活性炭吸附法、去离子树脂、超滤膜法等步骤的混合纯化系统。与自动生化分析仪配套的纯水机一般采用混合纯化系统，要求其纯水电阻率大于2.0Mcm（25）。 三、水的纯度检查水的纯度检查首先测定电阻率或电导率，然后检测残留物含量。1.电阻率 利用电导仪或兆欧表测定。电导仪测得的电导率可与电阻率换算：电导的单位是西门子(S)，电导(S)与电阻()互为倒数。电导率为每cm长的电导(S/cm)，电导仪的表头读数单位为S/cm，因此电导仪读数为1时，电阻率为1106cm = 1Mcm。GB6682-2000规定的一级水电导率的最小值为0.

7、01mS/m，即为0.01S/mm = 0.1S/cm，正好与GB6682-92规定的一级水电导率的最小值0.1S/cm 相吻合。2.可溶性硅限量试验 取纯水10ml，加入15滴1%的钼酸铵溶液，8滴草酸、硫酸混合液(按4%草酸1份加4mol/L硫酸3份的体积比)，混匀置室温10min，加5滴1%硫酸亚铁溶液，摇匀以不呈蓝色为合格(0.05mg/L)（以上百分比均为W/V）。3.细菌菌落计数 按细菌常规菌落计数法进行检测。实际工作中，除了要保证实验用纯水的制备质量外，还应重视纯水的贮存、运输以及使用过程的规范化，避免一切可能的污染，防止纯水等级的下降。第二节 常用临床实验室器材常用临床实验室器

8、材包括普通的玻璃器材以及非玻璃器材。普通的玻璃器材又分为量器类和容器类。量器用于计量溶液体积，如量筒、容量瓶、刻度吸管等，不能作为反应容器，更不能加热。容器则是物质反应或贮存的器皿如试管、烧杯等。非玻璃器材包括微量加样器，一次性注射器、采血器、塑料试管，塑料吸管、试剂瓶、洗瓶等，以塑料类为主。一、微量加样器的使用 微量加样器又称微量移液器、微量进样器。其下端为可装卸、可更换的尖管形移液嘴（吸头），上方是控制采样的推进按钮。常用的有固定式和可调式两种类型，规格有l级、ml级。其准确度和精密度均高于有被替代趋势的刻度吸管。 （一）工作原理微量加样器利用排代原理由活塞的定程运动形成负压吸入定量的液体

9、，其吸液量由活塞在活塞套内移动的距离来确定，再按下按钮使活塞向下移动，排出活塞腔内的气体而将吸头内的液体排出。 （二）操作方法1.选择在移液范围内的加样器，若为可调式则先将容量调节到所需的容量上。2.将吸头套在加样器的下端，轻轻转动后牢固地套上，确保密封。3.正式使用前需连续按动数次（不吸液体），以保持腔内外气压一致。4.用手垂直握住加样器，拇指将按钮压至第一停点（第一档位），并将吸头浸入到液面下13mm，再缓慢地放松按钮使之复位，等待12s后从液体中取出时拖靠掉吸头外部残液于被取出的容器内壁中。注意避免吸头与其他任何东西碰撞。5.将吸头移到加样容器内壁上，轻轻地将按钮压至第一停点将液体排出，

10、等待12s，再把按钮压至第二停点（第二档位），排尽全部液体后，吸头应沿容器壁向上滑动取出，此时拖靠吸头内部残液于加样容器内壁中。再放松按钮使之复位，卸下吸头，完成一次操作过程。（三）注意事项 1.微量加样器属于精密量器，不能直接接触液体、异物，不用时应套上吸头保持管内的清洁，以免液体或杂质吸入导致阻塞。2.吸头与微量加样器下端的连接必须密封。3.对于可调式按钮上的标线应对准所需容量的刻度线。4.当加样器中有溶液时必须垂直放置，不允许倒放，否则久后失准。5.使用前应检查其准确度和精密度。二、常用玻璃器材的使用与清洗(一) 常用玻璃器材的使用1. 刻度吸管 带有许多分刻度，用于准确量取刻度量以下的

11、任意量溶液，又称为吸量管，简称吸管。在使用时应保证其干燥清洁，并可采用欲量取的液体润洗23次以保证所量取的液体浓度不变。量取溶液时用大拇指与中指握住吸管的上方，下端垂直插入溶液中12cm，另一只手用洗耳球头对准、贴紧吸管上端后将液体缓慢吸入管内。当液面上升到所需刻度以上时，立即用食指按住管口，并将吸管的下端提出液面靠在盛装溶液的器皿内壁上，略为放松食指使液体流出，当管内液体的弯月面（凹月面）平稳下降到与刻度标线相切时，立即用食指压紧管口不让液体流出。在即将取出吸管时将其末端外部的液体拖靠在盛装溶液的器皿内壁上，然后将其垂直靠在承接溶液器皿的内壁上，使承接的器皿倾斜，松开食指让管内的溶液自然地沿

12、器壁流下，到达所需量体积时等待1015s，取出吸管。注意若管口上未标示“吹”字（一般1ml及其以上的吸量管不吹），残留在吸管末端内的溶液，不可采用外力使其流出；若管口上刻有“吹”字，则必须将末端的溶液吹出。使用吸管时应注意尽量避免采用管头自然流下后的残留量（欠准确）。比如用2.0ml吸管吸取1.5ml液体，应取满刻度2.0ml放至0.5ml间的液体（弯月面弯月面），而不能先放走0.5ml、再取剩余量的1.5ml（弯月面管头残留）。移液管在管的中间有一膨大部，在顶端细部标有容量刻度线，用于一次性移取较大量的的溶液。使用方法同上。2.容量瓶为一平底圆球状长颈瓶，具有磨口瓶塞，在使用中与磨口瓶塞配套

13、使用。瓶颈上刻有一环形标线，表示在所指温度(一般为20)时的容积标线。主要用于将准确称量的物质配成准确浓度的溶液，或将准确容积及浓度的溶液稀释为准确容积及浓度的稀溶液。3.量筒 用于量取体积不甚准确的液体。化学清洁的量筒应倒挂存放。相关链接20时，玻璃量器的刻度才与实际容量相吻合。温度改变时应进行校正，参见全国临床检验操作规程。常用容器类玻璃器材如试管、烧杯、烧瓶、漏斗、干燥器等的使用参见基础化学教材。(二) 玻璃器材的清洗1.新购玻璃器材的清洗 新购的玻璃器材都含有游离碱，可先用肥皂水或去污粉洗刷，自来水冲洗，然后浸泡在1%2%的盐酸溶液中4h以上，再用流水冲洗，最后经蒸馏水冲洗23次，在1

14、00130烘箱中烘干或晾干备用。2.使用过的玻璃器材的清洗 对于容器类玻璃器材，先用自来水洗刷后，用肥皂水或去污粉刷洗，再用自来水反复冲洗干净，最后用蒸馏水淋洗23次，倒置干燥备用。量器类玻璃器材，使用后应立即浸泡于凉水中, 以防止物质的干涸。然后用流水冲洗, 待沥干后, 用铬酸溶液浸泡数小时，再用流水反复冲洗，最后用蒸馏水淋洗24次，晾干备用。对于盛装过具有传染性样本的容器，应浸泡在杀菌剂如5%（V/V）煤酚皂溶液等中过夜消毒，再按上法清洗备用。3.清洁液的配制和使用 当玻璃器皿不能用肥皂水或去污粉洗净时，可用清洁液浸泡。清洁液的配方有多种（表2-3），可根据需要选用。 表2-3 清洁液的配

15、方配方重铬酸钾（g）806050200100粗浓硫酸（ml）10090900500800水（ml）1000750100500200配制时，先将重铬酸钾溶于水中，可加热助溶，待冷。然后将粗浓硫酸缓缓加入上液中，边加边搅拌不可过快，以免产生的高热造成容器的破裂。切忌将重铬酸钾溶液向浓硫酸中倾倒。根据配制量的多少选择烧杯或陶瓷缸作为容器。由于清洁液的腐蚀性较强，用时切勿溅到皮肤和衣服上，同时由于它的吸水性较强，因而应加盖贮存。使用过程中若清洁液颜色变为绿色，提示效力降低，可加入适量的重铬酸钾和浓硫酸继续使用；若变为黑色则不能再用。另外还应注意清洁液适用于已经过清洗但未能洗净的玻璃器皿，对于未清洗、未

16、消毒的器皿不要直接浸泡于清洁液中。第三节 生物化学检验试剂概述 生化检验实际工作中涉及到很多的检验试剂，包括常用化学试剂、试剂盒，其正确选择、保存与配制是实验室工作的基本要求。 一、化学试剂的种类与保存 （一）化学试剂的种类 化学试剂有不同的等级规格，各自的纯度和用途也不尽相同，参照进口化学试剂的质量标准，我国将化学试剂（通用试剂）分为四个常用等级。 1.一级 优级纯（G.R）又称保证试剂，绿色标签，该级别纯度最高、杂质含量最低，适用于科研和配制校准溶液。 2.二级 分析纯（A.R）又称分析试剂，红色标签，该级别纯度较高、杂质含量较低，适用于定性和定量分析。 3.三级 化学纯（C.P），蓝色标

17、签，该级别质量略低于二级品，适用于一般定量分析和定性试验。 4.四级 实验试剂（L.R），黄色标签，该级别试剂质量较低、但比工业用高，适用于一般定性实验。生化检验一般选择三级或三级以上的试剂，若需要准确的定量分析或配制校准溶液则必须选用二级以上的化学试剂。另外，还有光谱纯试剂（S.P）、层析纯试剂（ch.p）等，指用光谱法、层析法等测不出杂质含量，主要作为相应分析的基准物质。 （二）化学试剂的保存目前生化检验使用的化学试剂种类繁多，包括剧毒、麻醉、易燃易爆及强腐蚀品等。为了保证试剂的质量、延长使用期限，使用者和管理者必须了解各种化学试剂的性质，科学存放，以保证安全防止质变。化学试剂的保存原则如

18、下：按液体、固体性状分类，同时按序排列并作好登记，贮于干燥阴冷处。对于易燃、易挥发的药品应用蜡封瓶塞，贮于干燥阴冷处或冰箱内。强酸、强碱试剂应分别存放。剧毒药品则应由专人管理，每次使用应记录用量并做好登记。 二、化学试剂的配制多数化学试剂只有配制成实验试剂后才能用于临床实验室。化学试剂的配制常根据需要分为两大类，直接配制法和间接配制法。直接配制法适用于校准液和一般试剂的配制。间接配制适用于不易恒重的固体试剂和含量不准的液体试剂，即先配制大概浓度，然后再用校准液标定出准确浓度。配制中应注意：固体试剂恒重后准确称量。称量是决定所配试剂浓度准确与否的关键，应采用称量瓶或玻璃纸盛装。液体试剂取量时选择

19、合适的量器准确吸取要求的体积。试剂配制的溶剂一般为蒸馏水或去离子水，应注意对蒸馏水的要求，若需其他溶剂则需注明清楚。各类试剂分别溶解后按要求顺序混合，最后稀释至刻度。配制好的试剂应在其容器上注明名称、浓度以及配制时间。配制过程中常用的计算方式包括：百分浓度，如质量-质量百分浓度（W/W），体积-体积百分浓度（V/V）。质量-体积浓度（W/V）。物质的量浓度（摩尔浓度）。百分浓度与物质的量浓度之间的换算。稀释公式的应用等。详细计算参见分析化学教材。 实验2-1 磷酸盐缓冲液的配制【原理】 酸碱缓冲液是一种能够抵抗外来少量酸、碱（或内部化学反应产生的少量酸、碱）或稀释而自身pH不会发生明显改变即具

20、有缓冲作用的溶液。缓冲液一般由共轭酸及共轭碱所组成，其中酸性缓冲液一般为弱酸及其共轭碱，碱性缓冲液一般为弱碱及其共轭酸。它们对外来的OH-和H+具有双向调节作用，从而阻止pH发生剧烈的变化。磷酸盐缓冲液（PBS）由Na2HPO4与NaH2PO4（其金属离子还可以是K+等）组成，其中Na2HPO4可缓冲H+，而NaH2PO4可缓冲OH-。 【试剂】 1.分析纯Na2HPO4或 Na2HPO4 7H2O 2.分析纯NaH2PO4 H2O或 NaH2PO4 2H2O 【操作步骤】 1. 0.2mol/L Na2HPO4 贮存液（A液） 称取Na2HPO4 28.39g或Na2HPO4 7H2O 53

21、.62g置烧杯中，加入600 ml 蒸馏水，溶解后转入1 000ml 容量瓶，用少许蒸馏水清洗烧杯并转入容量瓶中，最后加蒸馏水至刻度。 2. 0.2mol/L NaH2PO4 贮存液（B液） 称取NaH2PO4 H2O 27.60g或NaH2PO4 2H2O 31.21g置烧杯中，加入600 ml 蒸馏水，溶解后转入1 000 ml 容量瓶，用少许蒸馏水清洗烧杯并转入容量瓶，最后加蒸馏水至刻度。 3. 配制pH 5.78.0的磷酸盐缓冲液，按表2-4操作：表2-4 pH5.78.0的磷酸盐缓冲液A液、B液配方（ml）pH值A液B液pH值A液B液pH值A液B液5.76.593.56.531.56

22、8.57.377.023.05.88.092.06.637.562.57.481.019.05.910.090.06.743.556.57.584.016.06.012.387.76.849.051.07.687.013.06.115.085.06.955.045.07.789.510.56.218.581.57.061.039.07.891.58.56.322.577.57.167.033.07.993.07.06.426.573.57.272.028.08.094.75.3 【注意事项】 1.所用试剂最好选择A.R或G.R，且需经过恒重后才能进行称量配制。（恒重：除了溶解性固体外系指连续两

23、次灼烧或烘烤后的质量差异在0.2mg以下。） 2.所用器皿必须清洁干燥，容量仪器则应经过校正，以保证配制的准确。 3. A液、B液分别为碱性母液、酸性母液。所配缓冲液的pH值用酸度计测量后不达标时，一般采用适量的A液或B液进行调整，有时也用1mol/L的NaOH或盐酸调整。 4.缓冲液的浓度越大缓冲容量越大，一般缓冲液总浓度为0.050.2 mol/L之间。前面所配的各pH值可在配制后再各加蒸馏水至200 ml，使其浓度为0.1 mol/L（对倍稀释）。相关链接pH值、缓冲范围与缓冲容量pH值的计算公式：式中pKa：共轭酸解离常数Ka的负对数。缓冲有效的pH值范围（pKa1）称为缓冲范围。在1

24、L缓冲液中使pH值增（减）1个单位所加的强碱（强酸）的摩尔数称为缓冲容量，或称为缓冲指数。缓冲容量是衡量缓冲液缓冲能力大小的尺度，故又称缓冲能力。缓冲容量的大小与共轭酸碱组分的总浓度、比值有关，总浓度越大，缓冲容量越大。过度的稀释将使其缓冲能力显著降低。5.温度影响pH值，温度升高pH值下降。应在测定温度下根据标准缓冲液的的pH值对酸度计两点校准后，再准确测定所配缓冲液的pH值。 三、试剂盒的选择及评价用于检验项目测定的含有使用说明书的所有配套试剂的组合，称为试剂盒（reagent kit，或kit）。生化检验试剂盒应用最广，商品化的试剂盒品种多样，应选择可靠、实用的试剂盒使用。 （一）试剂盒

25、的选择目前生化检验商品试剂盒常见的有液体、干粉（片）、冻干等包装类型。液体型试剂盒均一性好、瓶间差异较小、重复性好、不需复溶而可避免外源性水质的影响、测定结果较为准确等，其不足之处在于保存时间较短（特别是酶试剂）、不便于运输。在液体试剂中又分为单一试剂和液体双试剂两种，单一试剂简单但抗干扰能力差，液体双试剂则在保持了单一试剂优点的基础上增强了抗干扰的能力和试剂的稳定性，使酶与辅酶能够在水溶液中较长期的保存。冻干型为试剂溶解后先分装成液体，再经冻干处理而成，其中各组份的混合相当均匀，但试剂中残留的含水量不易准确控制，易造成瓶间差。干粉（片）型为各种干燥的化学试剂经粉碎混合（压片）而成，分装过程中

26、的称量以及加工过程中的混合均易造成瓶间差。冻干型与干粉（片）型均存在复溶的问题，而复溶对水的质与量要求较高，同时复溶后的保存期较短、稳定性较差，易造成浪费。故选择商品试剂盒时应结合本实验室的具体条件。 （二）试剂盒的评价 1.初步检查 作为商品试剂盒首先必须具有完整牢固的内外包装、详尽明确的说明书和优良的试剂外观。（1）内外包装应完整牢固，印有清晰的产品名称、生产批号、生产单位、保存条件及失效日期。（2）说明书印刷应清楚、详尽，内容包括：名称、用途、测定原理和技术要求、适用的仪器、试剂内容（包括各组份浓度或比例、所附校准物、有无稳定剂、防腐剂、填充剂等）以及试剂使用方法、试剂应用液的具体配制方

27、法与保存、样本要求、测定条件、校准物的选择及使用方法、标准曲线（校准曲线）的绘制、对干扰物样本的处理、结果的计算及解释、注意事项、参考范围、性能指标、失效指标、生产单位和地址等。（3）试剂外观检查包括对试剂颜色、性状及溶解度的肉眼观察，可获得初步的评价结果。若色泽改变、出现凝块或异物、溶解时出现浑浊均说明试剂已变质或受到污染。2.性能指标评价 根据国家卫生部颁发的试剂盒质量检定标准对主要技术指标包括准确度、精密度、干扰、线性范围、稳定性及反应时间曲线等进行逐项检测评价。但应注意评价前要对所用的仪器、量器进行校正，同时严格控制实验条件，由熟练的技术人员操作。稳定性试验是指试剂盒的不同状态在不同条

28、件下贮存后所能保持测定准确性的性能。状态：原包装及配制的工作液，条件：室温、冰箱温度，最终指标：有效期（一般指标为试剂空白和高值样本吸光度的变化范围等）。需要注意的是工作液的稳定性与使用过程中是否受到污染密切相关，因此要严防污染。反应时间曲线（终点法、连续监测法）参见第五章、第六章相关内容。其他性能指标的评价参见本章第六节中的方法学评价试验。第四节 参考范围和医学决定水平 临床生化检验项目对于受试者有何临床意义，是正常还是异常，是否及如何给予医疗措施，疗效如何，等等，这便涉及到项目参考范围及医学决定水平。一、 参考范围（一）参考范围的建立参考范围的建立应包括参考个体、参考总体、参考抽样组（参考

29、样本）、参考值、参考分布、参考值范围和参考值区间等。它们各自的意义及相互关系如下：参考个体按预定标准选择的个体。即界定了地区、民族、性别、年龄段等条件的个体，包括排除标准，如不能有器质性疾病、乙肝阳性，近期的急性感染、输血或手术、服药、妊娠或哺乳等组成参考总体所有参考个体的集合，其人数是估测的选定参考抽样组从参考总体中抽样选择的一定数量的参考个体，其足以代表参考人群，又称参考样本测定参考值每一个参考个体检测后的项目值为该个体的参考值集合参考值范围所有参考抽样组剔除离群值并补充数据后的各个参考值的集合范围，其分布可呈正态或偏态计算（包含95的参考总体的参考值范围）参考值区间（双侧时）正态：1.9

30、6s，即（1.96s）（1.96s）；偏态（百分位数法）：2.5位数（P2.5）的参考限97.5位数（P2.5）的参考限比较将受试者检验结果与参考值区间进行比较在建立参考范围时应该注意：参考抽样组人数一般为100例以上，若为偏态分布（非正态分布）则应在120例以上，特殊情况时也至少在30例以上。离群值的判断与处理：将疑似离群值和其邻近值相减后的绝对值除以极差（最大值最小值），若1/3则为离群值。离群值必须剔除，再补足数据。项目偏高、偏低均属异常的为双侧参考值区间，已如上述。项目只偏低或只偏高属异常的则取单侧参考值区间，正态： 1.65s或1.65s；偏态：P5或P95的参考限。参考值范围的含义

31、指所有参考值剔除离群值并补充数据后的整个集合范围，参考值区间指所有参考值剔除离群值并补充数据后在95的分布范围。显然参考值区间只是参考值范围的一大部分（95），二者并不相等。现很多地方都将参考值区间简称为参考范围（reference interval，参考区间），可见其所简称的参考范围并非参考值范围去掉“值”后的简称。本书亦将参考值区间引用为参考范围。除受人群的影响以外（一般不特别指出时为成人），参考范围还随测定方法种类（测定原理）、试剂厂家与批号、仪器、测量程序等的不同而不同，并非一成不变，故不能机械地进行比较。相关链接中位数与百分位数将一组观察值从小到大按顺序排列，位次居中的观察值就是中位

32、数。百分位数是一种位置指标，百分位数值即百分位数的参考限，可以由公式计算，具体参见马斌荣主编的医学统计学。百分位数法既适用于偏态分布的计算，也适用于正态分布。（二）参考范围概念的正确使用参考范围曾被称为“正常值”、“正常值范围”、“正常范围”等，在20世纪80年代以前其概念的使用一度十分混乱。“正常范围”等使用不合理的原因在于：“正常”是相对的。“正常”给人的感觉是健康，若检测值不在其范围内，照此理解即为“不正常”。实际上，绝对的健康是不存在的，在每个人身上都可能存在着某种程度的亚健康状态、病理状态。是正常的人被判为 “不正常”。参考抽样组即健康人群95的分布范围以外另5的正常人在此“正常范围

33、”范围之外，被定为患病，显然是错误的。若在规定的“参考范围”之外就好理解了。不正常的人被纳入“正常”。从疾病的发生发展过程来看，从早期的阴性到后期的阳性，都有一个或长或短的过程，参考抽样组中可能存在患有某疾病早期的受试者，或者患有与所检测项目无关或暂时无关的另一种疾病，所有这些情况都不属于“正常”。由于在使用过程中，“正常范围”的概念容易使人产生误解，在1969年由Grasbeck等提出了用参考范围代替正常范围。1978年国际临床化学和实验室医学联合会（International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，

34、IFCC，国际临床化学协会，国际临床化学联合会）作了正式推荐。现在医学界普遍主张使用参考范围这一概念。二、医学决定水平图2-1 健康与疾病的理论分布根据参考范围对某一诊断试验的结果进行解释时，有结果正常与异常之分，但它不能说明或排除受检者是否有病，同时受检者处于疾病的不同时期其检测结果也不相同。因此临床上需要一个确定病情、判断疗效和预后的一个临界值。1968年Beknett首先提出了医学决定水平（medical decision level，MDL，DL）的概念：是指临床上按照不同病情给予不同处理的指标阈值。DL（或用XC表示）可以用来除外或确定某一临床情况或预告将会出现的某一生理变化现象。

35、从健康与疾病两组人群的理论分布可以说明医学决定水平与参考范围之间的关系（图2-1）。A组为健康状态良好的人群，两箭头之间表示其所得出的参考范围，B组则为某种疾病的患者。DL1、DL2分别为低值、高值医学决定水平，DL1左侧的数值可除外B组疾病；DL2右侧的数值可确定患者存在B组疾病；DL1与DL2之间则表明健康与疾病存在交叉。不同指标的医学决定水平的数量、数值不同（表2-5）。如血清清蛋白（Alb）有三个DL，分别是20g/L、35g/L、52g/L。其中20g/L表示肝病患者的预后严重；35g/L为检查低清蛋白血症的界值；52g/L则稍高于参考范围上限，可除外许多假阳性。血清钙有三个DL，分

36、别是1.75mmol/L、2.75mmol/L、3.38mmol/L。1.75mmol/L作为低血钙抽搐的第一个决定性水平值，等于或低于1.75mmol/L时，应加做其他检查以明确病人发生抽搐的可能性，并采取预防措施；2.75mmol/L作为观察副甲状腺功能是否亢进的血清钙低限值，等于或高于该值时，应加做其他检查以确诊或排除原发性副甲亢的诊断；若大于3.38mmol/L则考虑为高血钙昏迷，应及时做出诊断，不得延误。血清指标（单位）参考范围*XCXCXCK+ mmol/L3.75.33.05.87.5Na+ mmol/L138146115135150Cl-mmol/L9810990112总Ca

37、mmol/L2.252.651.752.753.38Urea mmol/L2.99.321018Cr mol/L6213350140530UA mmol/L0.150.410.120.470.63TC mmol/L3.906.502.46.5010.4TG mmol/L0.221.980.222.04.4Glu mmol/L3.305.232.486.610.0Bill mol/L1.720.52540350Alb g/L3550203552TP g/L6080456080ALP U/L成人2590 儿童5035050135400ALT U /L5302060300AST U /L830206

38、0300CK U /L10120602001500LDH U /L100320200450800AMY U /L11033090225370GGT U /L5301545150表2-5 临床生化检验指标的医学决定水平*参考范围：已如前述，不同实验室的范围略有不同，XC也是如此。第五节 实验方法与参考物质概述实验方法（测量方法）产生测量程序，部分测量程序可溯源至国际单位制(SI)单位，测量程序为下一级参考物质定值，参考物质又校准下一级测量程序，直至常规样品（图2-2）。一、实验方法的分级（一）相关基本概念（ISO定义）计量学溯源 SI单位一级参考测量程序二级参考测量程序厂家选定测量程序厂家常务测

39、量程序用户常规测量程序一级校准物厂家工作校准物厂家产品校准物常规样品结果二级校准物1测量方法(method of measurement)进行测量时所用的、按类别叙述的逻辑操作次序。 校准 物质 定值 测量程序 实施者CIPM BIPM，NMI，ARML BIPM，NMI 不确定度增加NMI，ARML NMI，ARML，ML MLMLMLML厂家和/或终用户终用户终用户CIPM：国际计量大会，BIPM：国际计量局，NMI：国家计量机构，ARML：经认可的参考测量实验室(可以是独立的或厂家的实验室)，ML：厂家实验室 图2-2 SI单位、测量程序、校准物、常规样本的一般关系 2测量程序(meas

40、urement procedure)用于特定测量的、根据给定的测量方法具体叙述的一组操作。测量方法即为实验方法、分析方法，相当于操作原理，一个测量方法可以产生出多个测量程序，测量程序相当于具体操作步骤。通过测量程序可直接得到测量结果，而测量方法则不能。测量程序有时也称为标准操作程序(standard operating procedure，SOP) 或分析方案(analytical protocol)，相当于临床检验操作规程。3真值与给定的特定量的定义一致的值称为真值(true value)。其特点：真值只有通过完美的测量才能获得（实际上除理论值外很难获得），真值按其本性是不确定的、可以有多个

41、。在实际工作中经常使用的是约定真值。4约定真值对于给定的目的具有适当的不确定度，赋予特定量的值，有时它是通过约定而被采用的值，称为约定真值(conventional true value)，有时也称为定值、最佳估计值或参考值。常用某量多次测量的平均值来确定约定真值。 5不确定度(uncertainty)与测量结果的分散性相联系的参数。过去一直用一组重复测量的结果的标准差或变异系数来描述测量结果的分散性，但这只是结果的不确定性的一部分，只反映所使用的测量程序在规定条件下的随机不确定性，还有另外一些因素如仪器、方法、样本、试剂等非重复测量因素造成的结果不确定性。不确定度可通过实验进行评定，称不确定

42、度的A类评定；亦可根据实验以外的经验性信息或数据进行评定，称不确定度的B类评定。将所有不确定度合并得合成不确定度，将合成不确定度乘以一定系数得出一定置信水平下的扩展不确定度。（二）实验方法的分级根据分析方法的准确度与精密度的不同，IFCC将分析方法分为三级，ISO15189文件又将其具体细化为相应的一个或多个测量程序。1决定性方法（definitive method）其准确度最高，系统误差最小。经详细研究还未发现产生误差的原因，用该法测得的结果与“真值”最为接近。由于该法技术要求太高，费用昂贵，因此不直接用于鉴定常规方法的准确性，只用于产生一级参考测量程序和评价参考方法。国际上研究该类方法的实

43、验室较少，主要在美国、法国、德国、丹麦等。其主要方法包括同位素稀释质谱分析法（ID-MS）、中子活化法、重量法等（表2-6）。决定性方法的测量原理等同于ISO的一级测量原理，由其产生的测量程序称为一级参考测量程序(primary reference measurement procedure)，是具有最高计量学特性的参考测量程序，主要由国家计量机构建立，其操作可被完全描述和理解，所有的不确定度可用SI单位表示，结果不用参考被测量的测量标准而被接受。一级参考测量程序为一级参考物质定值。2参考方法（reference method）指准确度与精密度已被充分证实，并且经公认的权威机构（包括国家主管部

44、门、相关学术团体和国际性组织等）所颁布的方法。它的干扰因素少，系统误差小，且有适当的灵敏度、特异性以及较宽的分析范围和良好的线性。参考方法在条件优越的实验室可作常规分析。参考方法可再分为两类：公认的参考方法，已用决定性方法和一级参考物证实，作为参考方法已在学术界得到公认。推荐的参考方法，分析原理合理，但还有待证实，或者待测物本身性质复杂或化学组成不清楚，没有决定性方法可以证实，因此仅被部分学术组织认可与推荐。表2-6 生化检验项目的决定性方法、参考方法、常规方法项目决定性方法参考方法常规方法钾ID-MS、中子活化法火焰光度法火焰光度法、离子选择电极法钠中子活化法、重量法火焰光度法火焰光度法、离

45、子选择电极法氯ID-MS、中子活化法库仑滴定法硫氰酸汞法、离子选择电极法钙ID-MS原子吸收分光光度法邻甲酚酞络合酮法、 MTB法*镁ID-MS原子吸收分光光度法MTB法磷ID-MS米吐尔直接法、孔雀绿试剂法清蛋白免疫化学法溴甲酚绿法总蛋白凯氏定氮法双缩脲法肌酐ID-MS 离子交换层析法苦味酸比色法尿素ID-MS尿素酶法二乙酰一肟法、脲酶波氏法尿酸ID-MS尿酸酶法（紫外）磷钨酸比色法胆红素重氮反应法J-G法葡萄糖ID-MS已糖激酶法葡萄糖氧化酶法胆固醇ID-MSAbell法L-B反应直接法、酶法TGID-MSVan Handel法酶法ASTMDH-NADH法赖氏法ALTLDH-NADH法赖氏

46、法GGT连续监测法r-L-谷氨酰-萘酚比色法CKNAD+偶联法比色法*MTB：甲基麝香草酚蓝参考方法的主要用途：鉴定常规方法，评价其偏差及干扰因素，并决定其是否可以被接受。鉴定二级参考物质和为质控物定值。评价商品试剂盒的质量。产生二级参考测量程序。按照参考方法的测量原理建立的测量程序称为二级参考测量程序(secondary reference measurement procedure)，在临床检验领域中发挥主要作用。它们被称作“二级”，只是计量学上的分级，因需一级参考物质校准。它们是高度特异、精密，适合于分析复杂生物样品的方法，而一级参考测量程序在不少情况下只适合于一级参考物质（纯物质）的鉴

47、定，不适合生物基质样品的分析。如上所述的一个测量方法可以产生出多个测量程序，参考方法可以产生出厂家选定测量程序、厂家常务测量程序、用户常规测量程序，前两个程序为厂家工作校准物、厂家产品校准物定值。还有一类比二级参考测量程序等级低的国际约定参考测量程序(international conventional reference measurement procedure)，它们得出的结果不能溯源至SI单位，但被广泛承认。其可以为厂家工作校准物定值。一级、二级、国际约定参考测量程序可统称为参考测量程序。3常规方法（routine method）是指具有足够的精密度、准确度和特异性，且有适当的分析范围

48、、经济实用以及性能指标符合临床检测的方法。根据准确度的确定与否又可分为偏差已知的常规方法、偏离未知的常规方法两种。常规方法在做出评价后，经相关学术组织认可即可作为推荐方法。与常规方法的测量原理相对应的测量程序是部分的用户常规测量程序，但部分用户即参考实验室可采用参考测量程序测定样品。二、参考物质的分级（一）相关基本概念（ISO定义）1参考物质具有一种或几种理化性质已经充分确定的特性，用以校准仪器、评价测量方法或给材料赋值的一种材料或物质，称为参考物质（reference material，RM）。国内多称为标准物质、标准物、标准品。参考物质包括校准物质(calibration materia1

49、，校准物)和正确性质控物质(trueness control material)。参考物质可以是纯的或混合的液体、固体（如镨钕滤光片）或气体（如标准的CO2气体）。2测量系统(measuring system)完成一个项目所涉及的仪器、试剂、校准物、测量程序、质量控制、保养计划等的组合。又称为检测系统（test system）。3溯源性(traceability)通过一条具有规定不确定度的不间断的比较链，使测量结果或测量标准的值能够与规定的参考标准，通常是与国家或国际测量标准相联系起来的特性，称为溯源性。其不间断的比较链称为溯源链。溯源性是测量结果（包括测量标准即校准物的测量结果）的属性，不宜

50、用于测量方法或测量程序。连续的比较链是指计量学级别由低到高的、交替出现的测量程序和校准物，如图2-2由下至上的链。“测量标准”在检验医学领域可简单理解为参考物质或参考测量程序，与参考标准的联系可以是直接的，也可以通过中间测量程序和校准物间接进行，即溯源链可长可短，但理论上应使溯源链尽可能短，如图2-2中的二级参考测量程序可直接定值厂家工作校准物。溯源链的理想终点是SI单位的定义，但目前只有少部分检验项目可以溯源至SI单位，而多数项目只能溯源至国际约定校准物质或国际约定参考测量程序，甚至是厂家校准物和或测量程序。4参考实验室参考测量实验室的简称，是运行参考测量程序、提供有给定不确定度的测量结果的

51、实验室。参考实验室有很高的技术和管理要求，往往需要通过特定的程序才能成为参考实验室。对于同一检验指标，参考实验室最好形成国际网络，并定期进行测量比对，以保证参考测量的有效性。目前国际上有参考实验室网络的检验指标有胆固醇、酶催化活性、糖化血红蛋白等。（二）参考物质的分类与分级如上所述，参考物质分为校准物质和正确性质控物质。校准物质又称校准物(calibrator)，是在校准函数中其值被用作自变量的参考物质(对测量系统校准或对材料赋值)。正确性质控物质（国内多称为质控物、质控品、控制物）是用于评价一种测量系统的测量偏差的参考物质。可见参考物质有校准和评价测量系统两个主要功能。一种参考物质在一个测量

52、程序或测量系统中或用作校准物质，或用作正确性质控物质，但不可以同时用作校准物质和正确性质控物质。换言之，质控物不能当作校准物使用，校准物也不能当作质控物使用。质控物用于控制病人样本检测的误差，即常规质量控制。根据有无测定值可分为定值和非定值定值血清两种，其值用适当的校准物以参考方法确定；根据物理性状又可分为冻干质控物（血清）、液体质控物（血清）和混合血清。 根据参考物质的校准性质一般可分为三级。1一级参考物质（primary reference material，一级校准物、原级参考物、一级标准品）是一种高度稳定而均一的物质，所含的杂质已经定量。具有最高计量学特性的参考物质，是测量单位的具体体

53、现。其值由决定性方法产生的一级参考测量程序确定。其用途是校准二级参考测量程序以及为二级参考物质定值。一级标准品均有证书，属于有证参考物质(certified reference material，CRM)，在美国由国家标准和技术研究院（NIST）颁发，并且指明了它的性质和相关数据。美国由于发现标准物质最早，又一直处于世界领先地位，至今仍将一级参考物质称为标准参考物质（standard reference material，SRM）。2二级参考物质（secondary reference material，二级校准物、次级参考物、二级标准品）由二级参考测量程序定值，可以是与实际临床样品基质相似的

54、物质。其用途是为校准试剂盒厂家选定测量程序。在发达国家的二级参考物质通常是有证参考物质。有学者将二级参考物质称为主校准物（master calibrator）。需要强调的是，只有对于可溯源至SI单位的小分子检验项目，才可分为一级参考物质和二级参考物质。3工作校准物(working calibrator) 工作校准物可以分为厂家工作校准物、厂家产品校准物，分别由厂家选定测量程序、厂家常务测量程序定值。一般的临床实验室对样本的常规测量程序使用的校准物为厂家产品校准物。按定义，参考物质是一个较宽的概念，一级、二级校准物是参考物质（国内多称呼为标准物、标准液），试剂盒中的校准物也是参考物质，但一般情况下参考物质是指较高级别的参考物质，它们多数是有证参考物质。因此，试剂盒及临床实验室配制的校准液一般不能称为标准液。有证参考物质和一般参考物质的区别是前者有明确的溯源性和不确定度要求。另外，还有一类重要参考物质是国际约定校准物质(international conventional calibration material)，它们的量值不能溯源至SI单位，但属于国际约定的，因而也被广