分子生物学实验常用试剂配制

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1、分子生物学实验常用试剂配制0.01MPBS缓冲液：一袋粉制PBS缓冲液(中杉有售)加1000ml蒸储水。0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)配制方法称取8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4,溶于800ml蒸储水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4,最后加蒸储水定容至1L即可。(2)0.01M枸檬酸盐缓冲液：一袋粉制枸檬酸盐缓冲液(中杉有售)加1000ml蒸储水。0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液(CB,pH6.0,1000m1):柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。(3)1mo1/L的TBS缓冲液(pH8.0):在800ml水中溶解121gTris碱,用1N的H

2、Cl调至pH8.0,加水至1000mlo(4) 1%DEPC水：1mlDEPC加入1000ml新鲜三蒸水中，剧烈震荡20分钟使充分混匀，37oC至少放置2h或过夜，HIRAYAMAHV-50高压灭菌器高温高压30分钟降解DEPC,4c保存。(5) 1%琼脂糖凝胶：取琼脂糖0.2g置烧杯中，力口入20ml的1TAE缓冲液，封闭锥形瓶口，放入微波炉内加热，不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液，待琼脂糖全部熔化后取出摇匀，冷却至60c左右，加入10mg/ml澳化乙锭(EB)1pl,EB的终浓度为0.5pgml,充分混匀。将温热的凝胶倒入已经放好梳子的凝胶槽中，厚度约为3-5mm,注意不要有气泡

3、，将凝胶放置室温待其自然凝固。凝固后从胶槽中轻轻取出梳子。(6)0.5mol/LEDTA缓冲液(pH8.0):700ml水中溶解186.1gEDTA2H2O,用10mmol/LNaOH调至pH8.0,力口水至1000ml。50TAE缓冲液：Tris碱242g,17.4mol/L冰乙酸57.1ml,0.5mol/LEDTA(PH8.0)100ml加蒸储水至1000ml。(8) 30%储备胶溶液：溶解29g丙烯酰胺和1gN,N-亚甲基甲叉双丙烯酰胺于双蒸水中，搅拌至充分溶解后，定容至100ml。过滤后于4c避光保存。(9) 1.5mol/L(PH8.8)Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2

4、g,加入50ml水,用1mol/L盐酸调PH至8.8,最后用双蒸水定容至100ml。(10) 1.0mol/L(PH6.8)Tris-HCl缓冲液：称取Tris12.1g,加入50ml水,用1mol/L盐酸调PH至6.8,最后用双蒸水定容至100ml。(11) 10%SDS:电泳级SDS10g加双蒸水，68c助溶，浓盐酸调PH至7.2,定容至100ml。(12) 10%过硫酸钱(AP):0.1gAP,加入双蒸水1ml,4c保存一周。最好现用现配。(13) 5聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液(PH8.3):在900ml双蒸水，加入Tris碱15.2g,待溶解后，加甘氨酸94g,最后加SDS5g,盐酸调P

5、H值到8.3,定容至1000ml。(14) 2SDS加样缓冲液:1mol/LTris-HCL(PH=6.8)1ml,DTT0.308g,10%SDS4ml,澳芬兰0.02g,甘油2ml,定容至10ml。置4c避光保存或-20C保存。(15)转膜缓冲液：双蒸水将甘氨酸2.9g,Tris5.8g和SDS0.37g溶解后，加甲醇200ml,最后定容至1000mlo(16)0.01MTBS缓冲液：一袋粉制TBS缓冲液加1000ml双蒸水。(17)漂洗液(TBST缓冲液)：20%Tween1.65ml,加1%TBS缓冲液700ml。(18)考马斯亮蓝G250染液：90ml甲醇：水(1:1,V/V)和10

6、ml冰乙酸的混合液中溶解G250马斯亮蓝0.25g,用Whatman1号滤纸过滤染液以去除颗粒状物质。(19)考马斯亮蓝洗脱液：90ml甲醇：水(1:1,V/V)和10ml冰乙酸的混合液。(20)10X春红S染液：丽春红0.2g,三氯乙酸3g,磺基水杨酸3g,加双蒸水至100ml。临用前稀释10倍。(21)丽春红S染液脱色液：0.01MTBS缓冲液.(22)封闭液：脱脂奶粉(完达山牌)5g,力口TBST100ml。RT-PCR实验注意事项：1 .由于本实验是检测细胞内mRNA,要防止RNA酶的污染，一旦污染会导致所检测的结果不准确，需要对实验所用材料、器皿等进行灭RNA酶处理。2 .实验中所用

7、Eppendorf管、移液头的处理：1%DEPC水浸泡过夜，120c高压蒸汽灭菌20分钟。70c烤箱内烤干备用；3 .实验中所用玻璃器皿的处理：硫酸-重铭酸钾混合液中浸泡24小时，自来水充分冲洗，蒸储水冲洗，1%DEPC水浸泡过夜，120c高压蒸汽灭菌20分钟；4 .实验中所用金属器皿清洗后，使用前一天经170c干烤过夜；橡胶塞经清洗后，120c高压蒸汽灭菌20分钟。细胞总RNA的提取(TRIquikReagent法)取对数生长期的培养细胞，用0.25%的胰蛋白酶消化后离心，沉淀加入1.0ml的TRIquik,用枪头抽吸混匀后转移到无菌1.5mlEppendof管中；(2)将样品在室温放置5m

8、in,使得核酸蛋白复合物完全分离；(3)向样品中加入0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15s,室温放置3-5min,使其自然分相；(4)台式离心机上，12,000rpm,4c离心10-15min。样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相，把水相转移到新管中；在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，混匀室温放置10-20min；(6)台式离心机上，12,000rpm,4c离心10min。去上清。离心前RNA沉淀经常是看不见的，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀；(7)加入1ml75%乙醇(用RNase-free的水配置)洗涤沉淀。每使用1mlTRIquick至少加1ml75%乙醇；

9、(8)4C7,000rpm离心5min,弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清；(9)室温放置晾干(不要凉的过干，RNA完全干燥后会很难?解，大约晾干1-2分钟左右即可)，加入适量RNase-free水(根据实验需要加入30-100小水)，充分溶解RNA;(10)RNA样品-70C保存或继续下续实验。总RNA的提取I .上海生工生物技术有限公司UNIQ-10柱式Trizol法(1)取组织100mg,迅速置于已用DEPC处理过的研钵中，在液氮中将组织研成细粉末，趁液氮尚未挥发光时，将粉末转移到1.5ml离心管中，加入1.0ml的Trizol,用枪头抽吸混匀；(2)用1ml针筒，26-G号(小

10、4.5)头抽吸匀浆液15-20次，以剪切基因组DNA,然后直接从针筒中将样品转移到无菌1.5mlEppendorf管中；加入100口氯仿/异戊醇(24:1),剧烈振荡混匀30秒；(4)台式离心机上，12,000rpm,室温离心5分钟；将上清液(约450以小心转移到无菌1.5mlRNase-free离心管里，加入150口无水乙醇，混匀；(6)将上述溶液全部转移到套放于2ml收集管内的GenClean柱中，室温放置2分钟，8,000rpm离心1分钟；(7)小心取出柱子，弃去收集管中的废液，将柱子放回收集管中，加入450NRPESolution,10,000rpm,室温离心30秒；(8)重复步骤7一

11、次；(9)小心取出柱子，弃去收集管中的废液，将柱子放回收集管中，10,000rpm,室温离心30秒；(10)小心取出柱子，放入无菌RNase-free的1.5ml离心管里，在柱内膜的中央小心加入40仙lDEPCHO,5580c放置2分钟(室温放置产率约低20%左右)；II 1)8,000rpm,室温离心1分钟。收集管内的溶液即为RNA样品，可立即使用或者-70C保存。2.Trizol法(1)取组织100mg,迅速置于已用DEPC处理过的研钵中，在液氮中将组织研成细粉末，趁液氮尚未挥发光时，将粉末转移到1.5ml离心管中，加入1.0ml的Trizol,用枪头抽吸混匀；(2)用1ml针筒，26-G

12、号(小4.5)头抽吸匀浆液15-20次，以剪切基因组DNA,然后直接从针筒中将样品转移到无菌1.5mlEppendorf管中；加入200小氯仿，居烈震荡混匀30秒；(4)台式离心机上，12000rpm,室温离心5分钟；将上清液(约450小出、心转移到无菌1.5mlRNase-free离心管里，加入等体积的异丙醇，混匀后室温放置5分钟；(6)台式离心机上，12000rpm,室温离心5分钟；(7)小心移去上清液，防止RNA沉淀丢失；(8)用70%酉精洗涤两次，每次700口12000rpm,室温离心2分钟；尽可能的吸走上清液，防止RNA丢失；(10)室温下干燥3-5分钟，使酒精完全挥发；(11)沉淀

13、用30nDEPC-H2O溶解，68c放置10分钟；离心管中的溶液即为RNA羊品，可立即使用或者-70C保存。RT-PCR一、逆转录(RT)获得第一链cDNA(1)每次RT反应中，按下表加入各组分：总RNA21Primer(0.5必d)1口RNase-freeH2O8仙1(2)轻轻混匀，离心35秒，70c反应5分钟，然后迅速置于冰上5分钟;(3)顺次加入如下组分：5ReactionBuffer4仙1RNaseInhibitor(20U/口)1口dNTPMix(10mmol/L)(4)轻轻混匀，离心3-5秒，25c反应5分钟；加入：M-MLV逆转录酶(20U/l11(6)轻轻混匀，离心3-5秒，2

14、5c反应10分钟，37c反应60分钟，70c10分钟终止反应，保存于-20C备用或直接用于后续实验。二、PCR反应50lP曲应体系：10PCRBuffer5口MgCl2(25mmol/L)31dNTPMix(10mmol/L)51cDNA4业1SterilizedddH2O30.51FP1口RP1口TaqDNApolymerase(1U/al)0.5a1总体积(2)PCR反应条件：(根据实验所需设定，不同的目的基因反应条件不同)94c4分钟1个循环94c15秒58c30秒40个循环72c90秒72c10分钟1个循环4c10分钟1个循环PCR琼脂糖凝胶电泳：PCR反应结束后，取5仙反应产物与6X

15、Loadingbufferl卜混匀后，微量移液器加入1%的琼脂糖凝胶样品孔中，接通电极，使DNA在100V恒压下向阳极泳动15分钟；(4)电泳结束后取出凝胶，于BiospectrumAC凝胶成像分析系统下照相并扫描分Western印迹i蛋白样品制备1.1 组织蛋白的提取将100mg组织块置于1-2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎；（2）加1000小钿胞裂解液于冰上匀浆器中进行匀浆15次。尽量匀浆要碎；取0.5ml的组织均浆液至一个1.5ml的EP管中；（4）加1ml抽提试剂液混匀,4c静置10分钟,4c10000rpm离心5分钟；（5）弃掉上下层的液体，管内留蛋白膜，开管口，

16、室温10分钟，空气干燥；（6）加2%的SDS500N1溶解后，100c3分钟变性。4c12000rpm离心5分钟；（7）取上清分装于200仙离心管中并置于-20C保存。1.2 考马斯亮兰法检测蛋白浓度（1）组织匀浆的制备：将新鲜组织用冷生理盐水冲洗血迹，然后用滤纸吸干。准确称取100mg,加100ml生理盐水，用玻璃匀浆器研磨组织，制备成10%的组织匀浆，3000转/分，离心10分钟，然后取组织匀浆上清再用生理盐水按1:9稀释成1%的组织匀浆，或用生理盐水按1:4稀释成2%的匀浆，待测；（2）测定蛋白：测定管0.053.0空白管标准管蒸储水（ml）0.050.615g/L标准液（ml）0.05

17、样品（ml）考马斯亮兰显色剂（ml）3.03.0混匀各管，静止10分钟，于595nm处，1cm光径，空白管调零，测各管OD值;（3）计算蛋白浓度：蛋白含量（g/L）=（测定管吸光度/标准管吸光度）标准管浓度（g/L）。1.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）将电泳用的玻片清洗干净后，固定在制胶槽上，用水检测制胶槽是否漏水。若不漏即可制胶。（2）制胶1）凝胶的制备分离胶(12%,5ml)积层胶(5%,2ml)ddH2O1.6ml0.4ml30%Acr2.0ml0.33mlBuffer1.5mol/LpH=8.81.0mol/LpH=6.8Tris-HCl1.3mlTris-HCl0

18、.25ml10%SDS50p120口10%AP50p120口TEMED2口2口2）按上述方法配制12%分离胶，用5ml注射器吸取5ml迅速将分离胶溶液灌注到电泳仪两层玻璃板之间，留出积层胶空间，加水隔绝空气；3）当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝。再等3分钟使胶充分凝固，倒去上层水并用滤纸将水吸干；4）按上述方法配制5%的积层胶。将剩余空间灌满积层胶然后将梳子插入积层胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。待到积层胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出；5）用水冲洗一下积层胶，将其放入电泳槽中；电泳1）样品100+2*buffer10l或

19、20此4c12000g离心10分钟。取上清上样；2）电泳：积层胶时用80V恒压电泳，待澳酚兰前沿进入分离胶后，电压改为120V继续电泳，总时间2小时左右。电泳至澳酚兰达分离胶底部，关电源。1.4 转膜（半干转法）（1）浸泡PVDF膜：约剪一块与胶大小差不多的PVDF膜浸于无水甲醇溶液中15秒；浸于去离子水中3分钟；浸于转移缓冲液中3分钟。将Whatman滤纸剪的比PVDF膜略小一些，也浸入转移液中。（2）切胶：将胶卸下，蛋白MarkeU4-72KD所在凝胶部分行考马斯亮蓝染色，左上切角，在转移液中稍稍浸泡一下，置于洁净玻璃板上，按三次滤纸-胶-膜-三次滤纸的顺序制成三明治。注意用玻棒逐出气泡，

20、剪去滤纸与膜的过多部分。(3)转膜：将上述制好的三明治转移至半干转转膜仪上，负载电压25mv,时间45分钟。1.5 封闭将膜从电转槽中取出，先用丽春红染色观察蛋白条带，再用去离子水和TBST将丽春红洗脱后，浸没于5%奶粉封闭液中缓慢摇荡一小时。1.6 杂交(1)将膜置于1:300的多克隆兔抗人Cx43抗体2ml或1：1000稀释的抗Sactin单克隆抗体中4c孵育过夜；(2)用1%TBST在摇床上摇动漂洗膜三次，每次15分钟；。(3)将膜置于HRP标记的山羊抗兔IgG(1:1000)2ml中室温轻摇孵育2小时；1%oTBSTS动漂洗膜三次，每次15分钟；ECL发光试剂盒显影、X片感光后显影定影

21、。清水冲净晾干。1.7 结果判定：应用BiospectrumAC凝胶成像分析系统扫描、用凝胶定量软件QuantityOne测定各组目的蛋白和.actin的积分灰度值。数据处理时用各组积分灰度值除以内参照bactin条带的积分灰度值获得相对积分灰度值的比值。细胞基因组DNA的提取动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒法使用前先在漂洗液中加入无水乙醇，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。细胞先用胰酶消化处理，再用预冷的PBS吹打成细胞悬液，取1X107个悬浮培养的细胞，然后12000rpm离心1min收集细胞。尽量去除上清，力口200仙溶7取A,振荡至彻底悬浮；(2)向悬浮液中加入20p10

22、mg/ml的RNaseA,55c放置15min；(3)加入2010mg/ml的蛋白酶K,充分混匀，55c水浴消化。消化期间可颠倒离心管混匀数次，直至样品消化完全为止。消化完全的标志是：液体清亮及粘稠；加入200卜溶7取B,充分混匀；(5)加入200仙比水乙醇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀，不影响DNA的提取，可将溶液和絮状沉淀都加入吸附柱中；(6)12000rpm离心1min,弃废液，将吸附柱放入收集管中；向吸附柱中加入700卜漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min,弃废液，将吸附柱放入收集管中；(8)向吸附柱中加入500仙漂洗液，12000rpm离心1min,弃废液，将吸附柱放入收集管中；12000rpm离心2min,将吸附柱置于室温或50c温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续的实验；(10)将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50200经75c水浴预热的洗脱液，室温放置5min,12000rpm离心1min；(11)离心所得洗脱液再加入吸附柱中，室温放置2min,12000rpm离心2min,即可得到高质量的基因组DNA。