DNA体外合成与序列测定

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1、1会计学DNA体外合成与序列测定体外合成与序列测定2022-3-1422022-3-14南京农业大学 生命科学学院3每延伸一个核苷酸需四步化学反应：(1) 脱三苯甲基：末端核苷酸的DMTr用三氯乙酸/二氯甲烷溶液脱去，游离出5-OH 。(2) 缩合：新生成的5-OH 在四唑催化下与下一个核苷3-磷酰亚胺单体缩合使链增长。(3) 盖帽：有少量(小于0.5%)未缩合的5-OH 要在甲基咪唑或二甲氨基吡啶催化下用乙酸苷乙酰化封闭，以防进一步缩合造成错误延伸。(4) 氧化：新增核苷酸链中的磷为三价亚磷，需用碘氧化成五价磷。上述步骤循环一次，核苷酸链向5方向延伸一个核苷酸。2022-3-1442022-

2、3-145南京农业大学 生命科学学院2022-3-1462022-3-14南京农业大学 生命科学学院72022-3-14南京农业大学 生命科学学院860年代末就已掌握了充分的理论知识，只是当时在某些技术能力上和研年代末就已掌握了充分的理论知识，只是当时在某些技术能力上和研究思路上，存在着弱点，阻碍了从理论转变为现实。第一，究思路上，存在着弱点，阻碍了从理论转变为现实。第一，如何分离寡如何分离寡核苷酸片段核苷酸片段；另一方面，在；另一方面，在研究思路研究思路上都没有摆脱蛋白质序列分析的束上都没有摆脱蛋白质序列分析的束缚。缚。1965，Cornall大学以大学以SWHolle，为首的科学家小组，首

3、次完为首的科学家小组，首次完成成75个核苷酸的酵母丙氨酸个核苷酸的酵母丙氨酸tRNA的全序列测定。即利用各种的全序列测定。即利用各种RNA酶把酶把tRNA降解成寡核苷酸，经分离纯化后，再分别测定短片段顺序。降解成寡核苷酸，经分离纯化后，再分别测定短片段顺序。返回返回DNA核酸序列分析历程核酸序列分析历程利用DNA聚合酶的两种酶催反应特性：1、利用单链DNA模板，合成DNA互补链；2、利用2，3双脱氧核苷三磷酸作底物，参入到寡核酸链的末端，从而终止DNA链的生长。有时也称引物合成法，或酶催引物合成法。2022-3-14南京农业大学 生命科学学院11q反应：反应：同时加入引物和引物和模板、模板、D

4、NA聚合酶聚合酶1、一、一种种ddNTP、以及以及 四种四种dNTP（有一种带放射性标记）。q变性胶电泳变性胶电泳分离反应混合物。q放射自显影术放射自显影术，检测单链DNA片段的放射性带。q结果判读结果判读，从放射性X光 底 片 上 ， 直 接 读 出DNA的核酸顺序。反应混合物中，标记什么最方便？反应混合物中，标记什么最方便？2022-3-14南京农业大学 生命科学学院13v 在自动测序中将荧光在自动测序中将荧光素连在素连在4种种ddNTP上上2022-3-14南京农业大学 生命科学学院142022-3-1415南京农业大学 生命科学学院2022-3-1416南京农业大学 生命科学学院毛细管

5、电泳毛细管电泳荧光检测荧光检测2022-3-14南京农业大学 生命科学学院172022-3-14南京农业大学 生命科学学院18引物合成引物合成DNA序列测定法的特点及缺陷序列测定法的特点及缺陷分析分析：这样处理后，能：这样处理后，能策得高分子量策得高分子量DNA吗？吗？为了将这些降解的为了将这些降解的DNA片段，按其原来的顺序片段，按其原来的顺序“拼排拼排”起来，至少还需要用一种或数种其它内切限制酶，对起来，至少还需要用一种或数种其它内切限制酶，对同种同种DNA作酶切消化，并进行电泳纯化和序列分析。作酶切消化，并进行电泳纯化和序列分析。实际上可行吗？实际上可行吗？高分子量高分子量DNA分子消化

6、降解成一组具一定长度的限制分子消化降解成一组具一定长度的限制片段，然后再用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶作电泳片段，然后再用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶作电泳分离纯化，从胶中抽取分离纯化，从胶中抽取DNA片段，供进一步分析。片段，供进一步分析。这些供作序列测定的这些供作序列测定的DNA片段绝大多数都仅片段绝大多数都仅为数百个核酸为数百个核酸。因此需要用物理方法分离大量的因此需要用物理方法分离大量的DNA片段。片段。费时费钱费时费钱，因，因为商品提供的核酸内切限制酶的价格是十分昂贵。为了保为商品提供的核酸内切限制酶的价格是十分昂贵。为了保证能够获得所有的限制片段，就需要制备足多数量的证能够获得所有的限

7、制片段，就需要制备足多数量的DNA，而其中有许多步骤都要用不同浓度的凝胶进行电泳再纯化。而其中有许多步骤都要用不同浓度的凝胶进行电泳再纯化。在这种纯化过程中，会加剧在这种纯化过程中，会加剧DNA的损伤和丢失。的损伤和丢失。将不同限制酶消化切割的将不同限制酶消化切割的DNA限制片段，随机地克隆到载限制片段，随机地克隆到载体分子上。选用天然的单链体分子上。选用天然的单链 DNA噬菌体，例如噬菌体，例如 M13作为作为载体，重组体噬菌体的载体，重组体噬菌体的DNA分子，可直接用作模板。分子，可直接用作模板。引物引物：合成的特定的寡核苷酸，或者是从亲本单链噬菌体合成的特定的寡核苷酸，或者是从亲本单链噬

8、菌体DNA中分离出来的一种限制片段。其中分离出来的一种限制片段。其特点是能够特异性地同载体分特点是能够特异性地同载体分子上与克隆位点相连的单链子上与克隆位点相连的单链DNA区段杂交区段杂交。称做。称做“通用引物通用引物” 。将将DNA片段克隆在片段克隆在M13mp载体特定位点上，即位于载体特定位点上，即位于 Lac区段中含有多克隆位点的多聚衔接物（区段中含有多克隆位点的多聚衔接物（polylinker）内。内。重组体噬菌体，在含有重组体噬菌体，在含有IPTG和和Xgal的培养基平板上形成的培养基平板上形成白色白色的噬菌斑，而非重组体的噬菌体则形成的噬菌斑，而非重组体的噬菌体则形成蓝色蓝色的噬菌

9、斑。的噬菌斑。从白色的噬菌班中分离重组体噬菌体，并制备出单链从白色的噬菌班中分离重组体噬菌体，并制备出单链DNA，就可以直接按双脱氧链终止法进行序列分析。就可以直接按双脱氧链终止法进行序列分析。当然这种随机的方法，也需要通过顺序的测定将派生的序列拼连起来，恢复成原来结构形式的总DNA序列。ddGTPddATPddTTPddCTPOH 3P 55PHODNA聚合酶，聚合酶，dATP，dTTP，dGTP，dCTPddGTPddATPddTTPddCTP5PddATPddGTP5PddTTP5PddCTP5P正极正极负极负极2022-3-14南京农业大学 生命科学学院27化学试剂处理化学试剂处理末端

10、标记末端标记DNA片段片段，碱基的特异性切割碱基的特异性切割产生的产生的DNA片段混合物片段混合物,电泳分离显影后显现谱带，直接读出待测电泳分离显影后显现谱带，直接读出待测DNA片段的核苷酸顺序。片段的核苷酸顺序。出发材料出发材料：局部消化的DNA分子群体中纯化出特定的末端末端带有放射性标记的DNA片段 (双链或单链）关键：关键：4种核苷酸碱基中，有12种发生特异性的化学切割仅应，包括碱基的修饰、修饰的碱基从其糖环上转移出去以及在失去碱基的部位发生DNA链的断裂三个主要的内容。由于化学切割反应特异性是由碱基的修饰作用决定的，显然，随后的切割反应必定是定量的，而且同副反应无关。2022-3-14

11、南京农业大学 生命科学学院30不需要体外酶催合成反应不需要体外酶催合成反应单双链都可以单双链都可以需要末端标记需要末端标记两端采用不同的标记，测序可从两端进行两端采用不同的标记，测序可从两端进行Maxam-Gilbert测序法的特异断裂32P32PATCGATCG32PATCGATATCGATSpecific Reaction to G 化學法無放射線片段不能顯像断裂处断裂处ATCGATCGAT换。5PP 53HOOH 35HOOH 53HOOH 3532PP32 53HOOH 3532POH 3硫酸二甲酯甲酸肼肼NaClGG+AT+CC碱性磷酸碱性磷酸单酯酶单酯酶除去除去 5磷酸基磷酸基 多

12、核苷酸多核苷酸磷酸激酶磷酸激酶-32P-ATP分离单链分离单链DNA分别在分别在4个个试管中进行试管中进行特异断裂特异断裂GG+AT+CC5 32P -GTCATGTGCTAG5 32P GTCATGTGCTA5 32P GTCATGTGCT5 32P GTCATGTGC5 32P GTCATGTG5 32P GTCATGT5 32P GTCATG5 32P GTCAT5 32P GTCA5 32P GTC5 32P GT5 32P G断裂产物断裂产物分别在分别在4个个泳道电泳泳道电泳从下到上依次读出从下到上依次读出DNA片段的核苷酸序列片段的核苷酸序列2022-3-14南京农业大学 生命科学

13、学院36补原则，另一条链的序列也就得到了。2022-3-14南京农业大学 生命科学学院372022-3-14南京农业大学 生命科学学院38v 鸟枪测序法：大分子DNA被随机地“敲碎”成许多小片段，收集这些随机小片段并将它们全部连接到合适的测序载体；小片段测序完成后，根据重叠区计算机将小片段整合出大分子DNA序列。这就是所谓的鸟枪测序法。2022-3-14南京农业大学 生命科学学院39原理原理q检测单碱基的变化检测单碱基的变化q序列比较分析序列比较分析q基因的表达状况基因的表达状况q验证其他测序验证其他测序1 ATACGTTA2 GTTAGATC3 ACGTTAGA4 CGTTAGAT5 GTT

14、AGATCDNA 样品 TATGCAATCTAG与基因芯片上 65,000 种可能的八聚体进行杂交从而形成特定的结合图形计算机分析杂交图象并由探针的重叠情况推导样品的核酸序列1 ATACGTTA3 TACGTTAG4 ACGTTAGA2 CGTTAGAT5 GTTAGATC3 TACGTTAG4 ACGTTAGA2 CGTTAGAT互补序列为：ATACGTTAGATC样品序列为：TATGCAATCTAG利用基因芯片进行杂交测序的原理ABCABCABCABC小片段测序小片段测序计算机拼装计算机拼装1、Sanger双脱氧链终止法原理是什么双脱氧链终止法原理是什么2、使用、使用M13mp载体系列的优

15、点有哪些载体系列的优点有哪些3、Maxam Gilbert化学修饰法的原理是什么化学修饰法的原理是什么4、DNA杂交测序原理是什么杂交测序原理是什么5、什么是寡核苷酸矩阵芯片、什么是寡核苷酸矩阵芯片6、杂交测序有什么应用、杂交测序有什么应用返回第二章Your Company Slogan2022-3-1451南京农业大学 生命科学学院2022-3-14南京农业大学 生命科学学院52当然这种随机的方法，也需要通过顺序的测定将派生的序列拼连起来，恢复成原来结构形式的总DNA序列。不需要体外酶催合成反应不需要体外酶催合成反应单双链都可以单双链都可以需要末端标记需要末端标记两端采用不同的标记，测序可从两端进行两端采用不同的标记，测序可从两端进行2022-3-14南京农业大学 生命科学学院55v 鸟枪测序法：大分子DNA被随机地“敲碎”成许多小片段，收集这些随机小片段并将它们全部连接到合适的测序载体；小片段测序完成后，根据重叠区计算机将小片段整合出大分子DNA序列。这就是所谓的鸟枪测序法。原理原理