人源葡萄糖转运蛋白GLUT的晶体结构解读

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1、葡萄糖转运蛋白 GLUT1的晶体结构宏观评述一、背景介绍：葡萄糖（ D-glucose ）是地球上包括从细菌到人类各种生物已知最重要、最基本的能量来源，也是人脑和神经系统最主要的供能物质；大脑平均每天消耗约120 克葡萄糖，占人体葡萄糖总消耗量的一半以上。葡萄糖代谢的第一步就是进入细胞：亲水的葡萄糖作为一种有机大分子不能自由穿透疏水的脂质双层结构细胞膜进入细胞， 其进出细胞需要通过镶嵌于细胞膜上的葡萄糖转运蛋白 （glucose transporters ）简称葡萄糖转运体（ GLUT）转运功能才能得以实现。其中一类属于主要协同转运蛋白超家族 （Major Facilitator Superf

2、amily ，简称 MFS）的转运蛋白是大脑、神经系统、肌肉、红细胞等组织器官中最重要的葡萄糖转运蛋白（ glucose transporters ，简称 GLUTs）。在人体的 14个GLUTs中， GLUT1、2、3、4这四种蛋白生理功能最重要，研究最广泛， GLUT1几乎存在于人体每一个细胞中，是红细胞和血脑屏障等上皮细胞的主要葡萄糖转运蛋白， 对于维持血糖浓度的稳定和大脑供能起关键作用。在已知的人类遗传疾病中， G L U T 1 功能完全缺失将致死，功能部分缺失会使细胞对葡萄糖吸收不足而导致大脑萎缩、 智力低下、发育迟缓、癫痫等一系列疾病 （GLUT1Deficiency syndr

3、ome, 又称 De Vivo syndrome）同时也会因葡萄糖不能及时为人体利用消耗而导致血糖浓度的异常升高。另一方面，当发生癌变时，葡萄糖是肿瘤细胞最主要的能量来源， 但是肿瘤细胞由于缺乏氧气供应而只能对葡萄糖进行无氧代谢，同质量葡萄糖所提供的能量不到正常细胞的10%，因而对葡萄糖的需求剧增（这是被称为 Warburg Effect 的肿瘤细胞代谢现象），在很多种类的肿瘤细胞中都观察到 GLUT1的超量表达，以大量摄入葡萄糖维持肿瘤细胞的生长扩增，这使得 GLUT1的表达量可能作为检测癌变的一个指标。 GLUT14是一种类胰岛素敏感型葡萄糖运输载体，它与 2型糖尿病密切相关，细胞中 GL

4、UT14表达的减少以及其转位的障碍都是引发糖尿病的重要因素。二、研究介绍：他们首先获得了 GLUT1-4在大肠杆菌中的同源蛋白， XylE 的结构。 XylE 在肠杆菌中负责将 D-木糖以质子依赖的方式同向转运进入细胞。它与人的 GLUT1-4蛋白有着高达 50%的序列相似性，进化上高度保守。细菌 GLUT14 同源物 XylE 分别与 D-木糖、D-葡萄糖和 6- 溴-6- 脱氧 -d- 葡萄糖构成的三种复合物的晶体结构， 分辨率分别为 2.8 、2.9 和 2.6 埃。其三维晶体结构中包含一个典型的由 12 个跨膜片段和一个独特的四螺旋结构域构成的主要协同转运蛋白超家族(MajorFaci

5、litatorSuperfamily ，MFS)折叠。 XylE 被捕获在一个面向外（ outward-facing）、部分闭合的构象中。XylE 蛋白的三维晶体结构呈现出典型的MFS家族折叠方式由12个跨膜螺旋组成N 端和 C端两个以假两次轴对称的结构域。与已知结构的 MFS超家族其它成员不同， XylE 呈现出一种向细胞外侧开放、部分封闭的全新构象，并且具有一个独特的由4 个 螺旋组成的胞内结构域。颜宁研究组获得了XylE 与底物 D-木糖，抑制剂 D-葡萄糖，以及一种葡萄糖衍生物的3 个复合物的结构，找到了与底物结合的重要氨基酸残基， 并通过生化实验分析， 验证了这些残基在底物识别与转运

6、过程中起到的作用。尤为重要的是，序列比对显示这些残基在GLUT1-4中完全保守，从而第一次揭示出GLUT1-4识别底物的分子基础。在研究这些同家族糖转运蛋白的结构与机理过程中，她们对于 MFS家族的工作机理有了深入了解， 分析出 GLUT1结晶的瓶颈在于高度动态、结构不稳定。针对这一问题， 她们寻找可以将GLUT1锁定于某一构象的致病突变体， 同时利用低温结晶进一步稳定蛋白构象，终于克服了GLUT1重组表达、纯化结晶的一系列技术障碍，获得了GLUT1的晶体结构。三、价值意义：1、提供的结构和生物化学信息可为了解葡糖糖转运蛋白和糖转运蛋白的功能和机制提供重要的框架。2、这一结构模型由于是以具有高

7、度同源的XylE 蛋白的晶体结构为基础，比以往研究报道的结果更为准确。利用 GLUT1的晶体结构可以精确地定位与疾病相关的突变氨基酸，揭示其致病机理。分析显示，三十余个突变氨基酸基本集中于三个区域：底物结合区域、胞外门控区、胞内门控区，它们的突变或者影响了底物识别，或者影响转运蛋白的构象变化。晶体结构使得理解这些致病突变的机理一目了然。与之前获得的向胞外半开口的XylE 晶体结构比较揭示出ICH 在 GLUT1的构象变化中起关键作用。 鉴于 ICH 在糖转运蛋白亚家族的保守性， 这一发现可能适用于该亚家族所有成员。3、在人类攻克癌症、糖尿病等重大疾病的探索道路上迈出了极为重要的一步。如果我们能

8、研究清楚 GLUT1 的组成结构和工作机理，就有可能通过调控它实现葡萄糖转运的人工干预。 这样既可以增加正常细胞的葡萄糖供应， 达到治疗相关疾病的目的， 也可以通过阻断葡萄糖供应“饿死”癌细胞。重点分析一、结构特征MFS 超家族转运蛋白的结构特征 MFS超家族的成员蛋白大多由400600个氨基酸残基组成 , N 和C端都位于胞内 . 蛋白二级结构预测提示其大多具有 12- 螺旋跨膜结构域 ,其他一些具有 14或者 24次- 螺旋的则可能是进化过程中以12- 螺旋为基础产生的.这种独特的折叠方式也被命名为“MFS fold” .在“ MFS fold”中 ,122个结构域: N端结构域和C端结构

9、域.每个结构域都由 6- 螺旋组成,虽然 2个结构域中氨基酸序列只有很低的序列同源性,但从结构上观察2个结构域呈现二次赝对称(two-foldpsudosymmetry). 同时 MFS超家族蛋白的结构和序列分析提示可能存在3次跨膜重复构成的特性 ,结构和功能分析都支持MFS蛋白每个结构域都是以 3+3反转重复 (inverted 3+3 repeats)的组成 .更有意思的是 ,研究发现一类只有 3次跨膜结MFS 超家族蛋白结构特征.图中显示的是属于MFS 蛋白家族的 XylE 的结构 . XlyE具有经典的 12 跨膜螺旋的 MFS fold.其中跨膜螺旋TM1-3 和 TM4-6 形成“

10、 3+3”反转重复,构成了XylE的 N 端结构域 ;跨膜螺旋 TM7-9 和 TM10-12 也具有类似反转重复特性,它们构成了XylE 的 C 端结构域 ;部分 MFS 家族转运蛋白像XylE一样还存在胞内结构域构域的糖转运蛋白 SemiSWEET,它们在细胞膜上可能形成多聚体行使功能 . 可能从进化上来讲 , MFS超家族蛋白是由 3次跨膜蛋白融合形成. 除了跨膜结构域外 , 部分 MFS超家族蛋白还具有胞内结构域 . 以XylE和GLUT1为例 , 在胞内区域还存在几个由 - 螺旋组成的胞内结构域. 螺旋中的多个带电荷氨基酸残基会与跨膜结构域上的氨基酸残基产生相互作用 , 底物转运实验

11、也已经证实这些位置上的突变会影响转运 . 进行序列比对发现 , 这些氨基酸残基在所有的糖转运蛋白中都十分保守 , 说明这个结构域在该家族中保守 , 并发挥重要功能GLUT1的三维晶体结构呈现经典的MFS家族折叠方式 -12个跨膜螺旋组成 N端和 C端两个结构域。两个结构域之间的腔孔朝向胞内区，即该结构呈现向内开放构象。 而在结晶中用到的去污剂头部恰好是葡萄糖苷，其结合位点与此前 XylE 中观测到的葡萄糖结合位点基本重合，证实了 MFS家族具有单一结合位点。有趣的是， GLUT1在胞内可溶区还具有一个由 4 个 螺旋组成的结构域（简称 ICH），这一序列只在 MFS中的糖转运蛋白亚家族中 (S

12、ugar Porter subfamily) 观察到，因此 ICH 是属于该家族蛋白的特有结构特征。二、转运机制MFS超家族转运蛋白包含共转运蛋白(co-transporter)和协助转运蛋白(facilitator).共转运蛋白 (co-transporter)在转运底物过程中需要借助其他物质的参与,其中质子共转运蛋白的转运机制的研究较为透彻 .比如 LacY, FucP, XylE 都是共转运蛋白 ,它们在转运乳糖、岩藻糖和木糖的过程中都需要利用膜两侧的质子浓度梯度所提供的势能驱动 ,完成底物在胞内的积累 .因此 ,质子在转运过程中起到了非常重要的作用 . 在对 LacY进行的大量生物化学

13、研究中表明,质子的协同运输过程中 ,一些重要的氨基酸残基参与了质子传递的过程.LacY中第 269位的谷氨酸 (Glu269) 在LacY处在向胞外开放构象下被质子化 , 然后乳糖分子会结合到蛋白上的底物结合位点 , 诱导 Glu269上的质子发生传递 , 使其转移到第 325位谷氨酸 (Glu325) 上. 与此同时 ,这一过程驱动蛋白发生构像变化,使蛋白呈现向胞内开放状态,底物释放后 Glu325上的质子也随之释放 ,蛋白在这种状态下不稳定,随即恢复到面向胞外状态,完成一个转运循环 . 在对另一个质子同向转运蛋白 FucP的研究过程中发现 ,位于转运通道中两个酸性氨基酸Asp46以及 Gl

14、u135可能与 LacY中的 2个酸性氨基酸一样 ,在底物转运过程中可以被质子化和去质子化 , 引起蛋白的构象变化 , 完成底物转运 .XylE 蛋白需要质子进行共转运的机制则可能有所不同 . 研究发现, XylE 中第 27 位的天冬氨酸 (Asp27) 与质子协助转运有关 . 将Asp27突变成天冬酰胺 Asn或者丙氨酸 Ala 后, 并不会对底物的逆流转运实验 (counterflow assay) 产生影响 , 但在活细胞中突变体蛋白不能完成底物转运 . 有意思的是在 XylE的高分辨率晶体结构中 , Asp27与第 133位精氨酸 (Arg133) 形成静电相互作用 , 如果将 Ar

15、g133突变成组氨酸 His 、亮氨酸 Leu、色氨酸 Trp都会影响 XylE的转运活性 . 而Asp27侧链的质子化可能会造成其局部的构象变化 , 使其与 Arg133不适合形成氢键除了共转运蛋白, MFS超家族还存在一类协助转运蛋白.我们近期完成结构解析的人源葡萄糖转运蛋白GLUT1正是最重要的协助转运蛋白之一 .由于 GLUT1与XylE具有较高的序列同源性 , GLUT1的N端结构域和 C端结构域与来自 XylE的2个结构域都十分相似 . 2 个结构上相似的蛋白却以 2种不同的方式进行转运 , 这对我们研究和认识质子共转运的机制有很大帮助 . 在GLUT1的序列中与 XylE序列中第

16、27位的天冬氨酸 (Asp27) 对应的第 29位氨基酸被天冬酰胺取代 , 这个突变刚好可以模拟天冬氨酸 (Asp) 质子化的状态 .Asn29没有与 Arg126( 对应 XylE的Arg133) 形成氢键 . 这就释放了 Arg126, 其与来自C端结构域的 Try292 形成阳离子 -(cation-interaction).目前 ,我们认为 XylE的转运过程是 :当XylE处在向胞外开放时 , Asp27 很容易被质子化 ,质子化的天冬氨酸会引起与它相互作用的氨基酸残基侧链发生构象变化,与此同时 ,底物分子 ( 木糖 ) 可以进入底物结合位点 ;与蛋白结合的底物分子可以诱导蛋白发生较

17、大构象变化,使蛋白从向胞外开放变成向胞内开放; 随后底物从蛋白上结合位点脱离 , Asp27 也去质子化 , 此时构象变得不稳定 , 蛋白恢复向胞外开放状态 . 如果 Asp27不能去质子化 ,即使底物从蛋白脱离也不能使蛋白完成空转,将稳定在向胞内开放状态 . 而GLUT1是一个协助转运蛋白 (uniporter/facilitator),它就像一直处于质子化状态下的质子共转运蛋白.底物结合和释放已经可以起到诱导蛋白构象变化的作用,不需要质子参与 .这其中的原因可能是 GLUT1各种不同构象之间的能垒都较低,自由热运动就足以完成构象变化 ,即使没有底物存在 ,GLUT1也处在一个高度动态的状况

18、下 ,底物的出现便能够诱导整个过程.GLUT1的生理功能是维持细胞膜两侧的葡萄糖浓度平衡 . 当两侧葡萄糖浓度等同时 , GLUT1同样可能对葡萄糖分子进行转运 , 完成类似交换 . 而从进化上讲 , 对于哺乳动物这样的多细胞生物来说 , 更多的是需要整个生命体内部的稳态和平衡 , 像GLUT1这样的协助转运蛋白更有利于个体的生存 ; 而对于大肠杆菌这样的单细胞来说 ,它们的生存环境本身充满了严酷的竞争,像XylE这样的共转运蛋白可以帮助他们从贫乏的外界摄取更多的营养物质.读书的好处1、行万里路，读万卷书。2、书山有路勤为径，学海无涯苦作舟。3、读书破万卷，下笔如有神。4、我所学到的任何有价值

19、的知识都是由自学中得来的。 达尔文5、少壮不努力，老大徒悲伤。6、黑发不知勤学早，白首方悔读书迟。 颜真卿7、宝剑锋从磨砺出，梅花香自苦寒来。8、读书要三到：心到、眼到、口到9、玉不琢、不成器，人不学、不知义。10、一日无书，百事荒废。 陈寿11、书是人类进步的阶梯。12、一日不读口生，一日不写手生。13、我扑在书上，就像饥饿的人扑在面包上。 高尔基14、书到用时方恨少、事非经过不知难。 陆游15、读一本好书，就如同和一个高尚的人在交谈 歌德16、读一切好书，就是和许多高尚的人谈话。 笛卡儿17、学习永远不晚。 高尔基18、少而好学，如日出之阳；壮而好学，如日中之光；志而好学，如炳烛之光。 刘向19、学而不思则惘，思而不学则殆。 孔子20、读书给人以快乐、给人以光彩、给人以才干。 培根