核酸的提取纯化和电泳检测试验报告

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1、核酸的提取、纯化和电泳检测摘要质粒是独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA分子，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，但在细菌细胞中含量最多。提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化葩密度梯度离心法等等，其中碱变性法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，是基于染色体 DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而到达别离目的，本实验采用碱变性 法提取E.coli DH5 “中Puc19质粒DNA ,并通过RNase消化及酚-氯仿抽提除去质粒 DNA溶 液中的RNA以及RNase等一些可溶性蛋白，最后获得纯度较

2、高的质粒DNA。细菌基因组DNA呈环状裸露于拟核区，本实验中细菌染色体DNA的提取采用试剂盒的方式。本实验的目的在于掌握碱变性法提取质粒DNA及染色体DNA提取的原理、各种试剂的作用和方法，掌握DNA的纯化方法，即用 RNase消化RNA以及用酚、氯仿抽提法除去质粒中的蛋 白质，学习并掌握凝胶电泳进展 DNA的别离纯化及纯度检测的实验原理，凝胶的制备及电 泳方法及相应的方法操作。关键词质粒DNA 碱变性提取法琼脂糖凝胶电泳细菌染色体DNA引言1 .核酸别离纯化1.1 总原那么保证核酸一级构造的完整性化学损伤一一缩短化学试剂作用时间，以减少其对核酸的损失；物理损伤一一动作轻柔以减少机械剪切力；尽

3、量低温操作以减少高温损伤；生物降解一一参加相应酶抑制剂，防止生物降解排除其他分子的污染蛋白质苯酚/氯仿/蛋白酶KRNA污染 RNase其他DNA区别变性与复性有机溶剂一一萃取、乙醇沉淀与洗涤金属离子一一乙醇沉淀与洗涤1.2 核酸纯化应到达的要求核酸样品不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子其他生物大分子的污染应降到最低程度排除其他核酸分子的污染1.3 核酸提取的一般过程破碎细胞防止核酸酶的作用破碎抽提核酸（裂解细胞释放容物）生一关键步骤核酸的纯化除去杂质蛋白质、脂类、核酸 4。C最正确和最简单；-70。C是长期保存的 良好温度，为一次性保存；-20 C核酸样品的保存主要条件时温度

4、和介质-TE缓冲液最常用2 .质粒DNA的提取及纯化一一碱变性提取法碱裂解/变性法RNase消化及酚-氯仿抽提2.1 质粒DNA的制备方法质粒（Plasmid谑独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA分子，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，但在细菌细胞中含量最多。细菌质粒大小介于1200Kb之间，是应用最多的质粒类群，在细菌细胞它们利用宿主细胞的复制 机构合成质粒自身的 DNA 。提取和纯化质粒 DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石 柱层析法、EB-氯化葩密度梯度离心法和 Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用, 适于不

5、同量质粒 DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进展。提取质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。EB-氯化葩密度梯度离心法，主要适合于相对分子质量与染色体 DNA相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质粒DNA多为超螺旋构型等优点， 但提取本钱高，需要超速离心设备。 少量提取质粒 DNA还可用沸水浴法、 Wizard法等，沸水浴法提取的质粒DNA中常含有RNA，但不影响限制性核酸切酶的消化、亚克隆及连接反响等。 子大小、碱基组成和构造等特点以及质粒 质粒DNA 。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分DNA的用途进展选择。本实验选择碱裂解法提取提取原那

6、么：尽量保持核酸的完整性, 物损伤，也要防止化学因素酸、碱等或破坏。最大限度减少染色体DNA的污染，去除 RNA、可溶性蛋白质杂质。即保持天然状态，防止核酸酶对核酸的降解生 或物理因素高温、机械剪切等引起核酸变性2.2 碱裂解法碱裂解/碱变性法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，是基于染色体 DNA线性DNA与质粒 DNA超螺旋 DNA的变性与复性的条件差异而到达别离目的。质粒 DNA具特定的形态构造，在特殊的环境条件下，如加热、极端 pH值、有机溶剂、尿素、 酰胺试剂等会导致质粒 DNA变性，去除变性条件又可以使 DNA复性。碱裂解法根据共价 闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑

7、学上的差异来别离质粒DNA。在细菌细胞中，染色体 DNA以双螺旋构造存在，质粒 DNA以共价闭合环状形式存在。 SDS是一种阴离子外表活性剂，它既能裂解细菌细胞，又能使细菌蛋白质变性。SDS处理细菌细胞后会导致细菌细胞壁破裂，从而使质粒DNA及细菌基因组 DNA从细胞中同时释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH12.6的碱性条件下，染色体 DNA的氢键断裂，双螺旋构造解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大局部氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全别离。当以pH4.8的KAc（或NaAc）高盐缓冲液调节其pH值至中性时，因为共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保

8、持在一起，因此复性迅速而准确，变性的质粒DNA恢复原来的共价闭合环状超螺旋构型，而溶解于溶液中；而线性的染色体 DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，染色体 DNA不能复性而与不用I定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的网状构造呈白色絮状沉淀，这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA别离。溶于上清的质粒 DNA ,可用无水乙醇和盐溶液，减少 DNA分子之间的同性电荷相斥力，使之 凝聚而形成沉淀。由于 DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀 DNA的同时，也伴随着 RNA沉淀，可利用 RNase A将RNA降解。质粒 DNA溶液中的RNase A以及

9、一些可溶性蛋白，可 通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒 DNA ,之后可再用超离心、电泳、离子交 换柱层析等方法进一步纯化质粒。总结：坚韧细胞壁、细胞膜染色体DNARNA、可溶性蛋白质溶菌酶、SDS 变性复性条件不同蛋白酶、RNase有机溶剂碱变性法提取质粒 DNA 一般包括三个根本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解 细胞；别离和纯化质粒 DNA。3 .细菌染色体DNA的提取3.1 细菌基因组DNA特点细菌的染色体基因组通常仅由一条环状双链DNA分子组成细菌的染色体相对聚集在一起，形成一个较为致密的区域，称为类核 nucleoid。类核无核膜与胞浆分开，类核的中央局 部由RNA

10、和支架蛋白组成，外围是双链闭环的 DNA超螺旋。染色体DNA通常与细胞膜相 连，连接点的数量随细菌生长状况和不同的生活周期而异。在 DNA链上与DNA复制、转 录有关的信号区域与细胞膜优先结合，如大肠杆菌染色体DNA的复制起点OriC、复制终点TerC等。细胞膜在这里的作用可能是对染色体起固定作用，另外，在细胞分裂时将 复制后的染色体均匀地分配到两个子代细菌中去。有关类核构造的详细情况目前尚不清楚。 具有操纵子构造有关操纵子构造详见基因表达的调控一章其中的构造基因为多顺反子， 即数个功能相关的构造基因串联在一起，受同一个调节区的调节。数个操纵子还可以由一个共同的调节基因regulatoryge

11、nel即调节子regulon所调控。在大多数情况下，构造基因在细菌染色体基因组中都是单拷贝但是编码rRNA的基因rrn往往是多拷贝的，这样可能有利于核糖体的快速组装，便于在急需蛋白质合成时细胞可以在短 时间有大量核糖体生成。3.2 细菌染色体DNA提取的原理基因工程实验所需要的基因组 DNA通常要求分子量尽可能大，以此增加外源基因获得率， 但要获得大片段的 DNA非易事。细菌基因组是环状DNA ,在抽提过程中，不可防止的机械剪切力必将切断 DNA。因此要尽可能地温和操作，减少剪切力，减少切断DNA分子的可能性；分子热运动也会减少所抽提到的DNA分子量，所以提取过程也要尽可能在低温下进展。另外细

12、胞及抽提器皿中污染的核酸酶也会降解制备过程中的DNA ,所以制备过程要抑制其核酸酶的活性。在提取过程中EDTA的作用就是螯合二价金属离子，起到抑制核酸酶活性的作用。与质粒 DNA相比选择琼脂糖凝胶浓度应低。4琼脂糖凝胶电泳进展DNA的别离纯化4.1电泳电泳(electrophoresis)ll带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极方向移动的现象。各种 生物大分子在一定 pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。 含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因电离子的大小形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，

13、就可以区别各种大小不同的分子。因而，凝胶电泳可用于别离、鉴定和纯化 DNA片段，是 分子生物学的核心技术之一。凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨围广。此外，凝胶中 DNA的位置可以用 低浓度荧光插入染料如澳化乙锭（ethidium bromide , EB）或SYBR Gold染色直接观察到， 甚至含量少至20Pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。需要的话，这些别离的DNA条带可以从凝胶中回收，用于各种各样目的的实验。分子生物学中，常用的两种凝胶为琼脂糖（agarose和聚丙烯酰胺凝胶。这两种凝胶能灌制成各种形状、大小和孔径，也能以许多不同 的构型和方位进展电泳。聚丙烯酰胺凝胶分

14、辨率高，使用于较小分子核酸（5500bp）的别离和蛋白质电泳。它的分辨率非常高， 长度上相差1bp或质量上相差0.1%的DNA都可以彼此 别离，这也是采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进展DNA序列分析的分子根底。虽然它能很快地进展电泳，并能容纳较大的 DNA上样量，但是与琼脂糖凝胶相比，在制备和操作上繁琐。琼 脂糖是从海藻中提取的长链状多聚物，由伊D-口比喃半乳糖与3,6-脱水-L-口比喃半乳糖组成，相对分子质量为104-105。琼脂糖加热至90c左右，即可溶化形成清亮、透明的液体，浇在模 版上冷却后形成凝胶，其凝固点为40-45C。琼脂糖凝胶相对于聚丙烯酰胺凝胶分辨率低，但它的别离围更大（50至百万b

15、p）,小片段DNA（50-20000bp）最适合在恒定轻度和方向的电场 中水平方向的琼脂糖凝胶电泳别离。琼脂糖凝胶电泳易于操作，适用于核酸电泳，测定DNA的相对分子质量，别离经限制酶水解的DNA片段，进一步纯化 DNA等。4.2 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳，以琼脂糖凝胶为支持物，利用 DNA泳动时的电荷效应和分子筛效应， 使不同大小的 DNA分子根据分子量而别离，凝胶中 DNA的位置可以用低浓度荧光插入染 料如澳化乙锭（EB）或SYBR Gold染色直接观察到，甚至含量少至20 Pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。4.21 琼脂糖每一个琼脂糖链含有大约 800个分子，琼脂糖聚合链形成

16、螺旋状纤维聚集成直径20-30nm的超螺旋构造。纤维是半刚性的，琼脂糖浓度不同，形成的纤维长度不同。固化的时候，螺旋纤维形成三维的筛网，琼脂糖浓度不同，形成的通道直径50nm至”200nm,三维构造依赖于氢键维持，加热成液体状态就破坏了氢键。【琼脂糖的凝胶性是由存在的氢键所致，但凡能破坏氢键的因素都能导致凝胶性的破坏。】4.22 电泳迁移速率的影响因素糖凝胶电泳是一种常用的方法，溶液中，核酸在溶液中由于磷酸基而带负电荷，在电场中向正极移动。DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移速率主要取决于下面六个因素：样品DNA分子的大小：电泳时，线性双螺旋DNA分子是以头尾位向前迁移的，其迁移速度与分子量所含碱基

17、的对数值成反比，这是因为大分子有更大的摩擦阻力。DNA分子的构象：分子量一样而构象不同的DNA分子，其迁移速率不同。在抽提质粒DNA过程中，由于各种因素的影响，使超螺旋的共价闭合环状构造的质粒DNA （covalentlyclosed circular DNA, cccDNA的一条链断裂，变成开环 DNA（open circle DNA, ocDNA 分子， 如果两条链发生断裂，就转变为线状 DNA （Liner DNA分子。这三种构型的分子 图1-3-1有不同的迁移率。一般情况下，超螺旋型cccDNA ）迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的是开环状ocDNA分子。图1不同卞象DNA琼脂糖浓度

18、：琼脂糖浓度直接影响凝胶的孔径，一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的泳动速度不同。通常凝胶浓度愈低，那么凝胶孔径愈大，DNA电泳迁移速度越快，即分子量越大，选用的凝胶浓度应越小。别离不同大小 DNA片段的适宜琼脂糖凝胶浓度见图3表1别离不同大小 DNA段的适宜琼脂糖凝胶浓度琼脂翦含量1%八DNA片段的有效分离范围(曲卜0.3.5-60.0.5-1-30.D.6r-1-20.0.872。0.375iz0.4-6.1加0242.00.17，电泳所用电场：低电压条件下，线性DNA片段的迁移速率与所用电压成正比。电压愈高带电颗粒泳动愈快，但随着电场强度增加，高分子量DNA的泳动速率以不同幅度

19、增加，因此凝胶电泳别离 DNA的有效围随着电压上升而减小，为了获得 DNA片段的最正确别离效 果，电场强度应小于 5v/cm。电泳缓冲液：在进展分子电泳时所使用的缓冲溶液，用以稳定体系酸碱度。常见的核酸 电泳缓冲液有：TAE、TBE、TPE和MOPS等。缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率， 当电泳液为无离子水如不慎在凝胶中忘记加缓冲液，即误用蒸储水配置凝胶，溶液的导电性很少，带电颗粒泳动很慢，DNA几乎不移动；而在高离子强度下如错用10X电泳缓冲液，导电性极高，带电颗粒泳动很快，产生大量的热，有时甚至熔化凝胶或使DNA变性。 注意：1、维持适宜的 pH。电泳时，正极发生氧化反响4OH-+4e

20、- 2H2O+O 2),负极发生复原反响4H+4e- 2H2),长时间的电泳将使正极变酸，负极变碱。一个好的缓冲系统应有较强 的缓冲能力，使溶液两极的pH保持根本不变。2、使溶液具有一定的导电性，以利于 DNA分子的迁移，例如，一般电泳缓冲液中应含有0.01-0.04molZL的Na+离子，Na+离子的浓度太低时电泳速度变慢；太高时就会造成过大的电流使胶发热甚至熔化。|3、电泳缓冲液还有一个组分是EDTA ,参加浓度为1-2mmolZL ,目的是螯合 Mg2+等离子,防止电泳时激活 DNA酶，此外还可防止 Mg2+离子与核酸生成沉淀。温度：DNA在琼脂糖凝胶电泳中的行为受碱基组成和凝胶温度影响

21、不明显。不同大小 DNA片段的相对电泳迁移率在 430 c无变化，一般琼脂糖凝胶电泳多在室温下进展，而当琼脂糖含量少于0.5%时凝胶很脆弱，最好在 4c下电泳以增加凝胶强度。Ethidium bfomide4.23 EB染色DNA的呈现：琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的DNA可使用荧光染料澳化乙锭显现并检测。澳化乙锭见图 2是一种具扁平分子的核酸染料，可以插入到 DNA或 RNA分子的碱基之间见图 3，并在300 nm波长的紫外光照射下放射出荧光，所以可用来显现凝胶中的核酸分子。在适当的染色条件下，荧光的强度是同DNA片段的大小或数量成正比。将浓度的标准样品如入ZHindm作为对照，电泳并经EB染色

22、后，就可以根据DNA条带的宽度与亮度估计出待测样品的浓度。脂糖凝胶电泳时，使用 EB对DNA染色的方法有两种：在制胶中与电泳缓冲液中同时参加0.5用ZmL的澳化乙锭。在电泳完毕以后， 取出琼脂糖凝胶，放在含有0.5由ZmL的澳化乙锭的 水溶液中染色10 min。此染色法能准确测定 DNA的大小与浓度。4.24 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA浓度电泳后的琼脂糖凝胶直接在紫外灯下拍照，只需要510 ng DNA ,就可以从照片上比拟鉴别。如用肉眼观察，可检测 0.050.1闵的DNA。由于电泳时所用样品非常少，而且操作简便， 所以在基因工程中经常被用作检测DNA样品。但是琼脂糖凝胶电泳法进展定量是基于

23、目测，所以是估计水平，不如用紫外分光光度计法准确。4.25 琼脂糖凝胶电泳鉴定核酸纯度：在琼脂糖凝胶电泳上可以观察到染色体DNA、质粒DNA和RNA的电泳区带，跑在澳酚蓝前面的就是 RNA。由此可分析样品的纯度。4.26 琼脂糖凝胶电泳鉴定 DNA分子量：在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因此，该法还可 用于分子量的测定。将未知分子量的DNA样品与分子量大小的标准 DNA片段进展电泳对照，观察其迁移距离，就可以获得该样品的分子量大小。下列图是常用的DNA分子量标准物的迁移图谱和片段大小。正文1材料和方法1.1、 料1.11、 实验材料pUC19质粒DNA样品-菌株【

24、E. coli DH5 a (pUC19)】碱裂解法提取DNA标准分子量-超螺旋质粒 DNA Marker ;商品纯化的pUC19质粒DNA (20ng/；纯 化的入 DNA (10ng/ ；pUC19 / HindIII。细菌染色体 DNA-黄色黏球菌 DK1622特性：基因组全长 913Mb,代时：4小时，胞外基 质富含粘多糖1.12、 溶液和试剂质粒DNA的提取一一碱变性提取法溶液 I：50mM 葡萄糖，25mM Tris-HCl (pH 8.0，10mM EDTA (pH 8.0，高压灭菌 15min, 储存于4 C)溶液 II0.2N NaOH , 1% SDS,用 2M NaOH

25、及 10%SDS 现用现配溶液III5M醋酸钾 KAc-HAc , pH 4.8 ,贮存于4 CTE 溶液10mM Tris-HCl(pH 8.0) , 1mM EDTA (pH 8.0)RNase 母液：将 RNA 酶 A 溶于 10mmol/L Tris.ClpH=7.5，15mmol/LNaCl 中，配成 10mg/ml 的溶液，于100 C加热15min,使混有的DNA酶失活，冷却后用 1.5mleppendorf管分装成 小份保存于-20 Co氨芳青霉素Amp储存液：100闻/ml水溶液，过滤除菌，-20 C保存。预冷无水乙醇，70%乙醇质粒DNA的纯化一一RNase消化及酚-氯仿抽

26、提Tris饱和苯酚溶液苯酚：氯仿：异戊醇溶液25: 24:1氯仿：异戊醇溶液NaAc 溶液(pH=5.2)70%乙醇，无水乙醇DNA的检测一一琼脂糖凝胶电泳别离DNA琼脂糖agarose)。50 x TAE: 242 g Tris base、57.1 mL 冰乙酸、100 mL 0.5mol/L EDTA (pH 8.0),去离子水 定容至1L。使用浓度：1 X TAE澳化乙锭Ethidium Bromide , EB：储存液浓度 10mg/mL ,工作浓度 0.5闻/mL水溶液。 6/10 X 上样缓冲液：30/50% 甘油、0.25% 澳酚兰bromophenol blue, BPB、0.

27、25% 二甲 苯青FFo其它：LB琼脂平板，LB液体培养基，冰乙醇，70%乙醇细菌染色体DNA的提取试剂盒：Bacteria DNA isolation kit Omega1.1 a仪器恒温振荡培养箱，高速冷冻离心机，漩涡振荡仪，离心管，不同型号的吸头，微量移液器等，培养皿，三角瓶，烧杯，天平，微波炉，电泳仪，制胶槽，电泳槽，梳子，电子天平，手套，紫外灯，Eppendorf管等。1.2 实验方法1.21 质粒DNA的提取、纯化和电泳质粒DNA的提取一一碱变性提取法I细菌培养在含有氨茉青霉素100闵/ml的LB琼脂平板上挑取携带有质粒pUC19的E.coli单菌落，接种液壁交界面于含氨茉青霉素的

28、LB液体培养基中，37C 200rmp振荡培养过夜。将过夜培养菌液以1%接种量接种到含有氨茉青霉素的LB培养基中Amp终浓度 （100闻/ml），37C , 200rpm培养4 6h,即到达菌体生长的对数晚期。II准备工作一用桌上的烧杯或搪瓷杯取一杯冰；一将小烧杯放在天平上，调至平衡；一每组取出一支灭菌的100ml离心管，标记上“组号-1，称量并记录其重量 Wi1.22 E. coil菌株收获：4 C操作一取已称量过且重量标记为Wi的灭菌离心管，。一倒入菌液至距瓶口1/3处，两两配平；一 6000rpm,离心5min,弃上清二楼楼梯口右侧；一参加5ml溶液I ,涡旋， 6000rpm, 5mi

29、n,弃上清；一将离心管倒置，使上清液全部流尽，用吸水纸擦干，称重，记为 w2,并计算w2-w1 oIV细胞裂解提取质粒 DNA 4 C操作每100mg菌体量，参加按菌体量接近的重新分组，溶液 I补平一 1.0 mL溶液I ,充分涡旋振荡，使细菌完全分散；用溶液 I再次配平；一 2.0 mL溶液n,轻柔颠倒混匀，冰浴 3-5min；一 1.5 mL溶液出，轻柔颠倒混匀，冰浴 5min；一 12000rpm, 15min；小心转移上清到新的离心管，记录体积 V。一参加2V冰乙醇，颠倒混匀；-20C, 15min；一 12000rpm, 15min,弃上清；一参加5mL70%乙醇，12000rpm,

30、 3min,吸弃上清。一重复乙醇洗涤一次；37c风干5-10min。一分次参加1mL TE溶液并转移到Ep管中，得质粒 DNA粗提物；质粒DNA的纯化一一RNase消化及酚-氯仿抽提IRNase消化除去RNA一向质粒 DNA 粗提取物中参加 5 J RNase A10mg/ml）,终浓度为50闵/mL , 37 c孵育1-2 小时II酚-氯仿抽提1mL粗提取物均分于两个 Ep管中。一分别参加等体积的 Tris饱和苯酚溶液，涡旋，12000rpm,离心5min。一转移上清Vi至新管，参加等体积 Vi苯酚：氯仿：异戊酉I溶液，涡旋， 12000r/min离心5min一转移上清V2液至新管，参加等体

31、积V2氯仿：异戊醇溶液，涡旋， 12000r/min离心5min。一转移上清至新管V3，参加1/10 V3体积的3M NaAc溶液（pH=5.2）,再参加2 V4。 =1/10V 3+V 3）冰乙醇，混合均匀，于 -20C保存30min。一 12000r/min 离心 15min,弃上清。一参加70%乙醇500L洗涤，12000r/min离心2min,弃上清。一重复洗涤一次，吸弃上清，37c风干5min。一每管参加25uLTE溶解沉淀，合并，得到 50uL纯化质粒DNA 。质粒DNA纯度检测一一琼脂糖凝胶电泳别离DNA一用 50X TAE 配制 2L1XTAE;一正确组装制胶槽+制胶板+样品梳

32、；一取40mL1XTAE至250mL干净红盖瓶中，称0.4g琼脂糖，倒入三角瓶混匀， 轻旋瓶盖，微波炉加热沸腾 3-4次，至澄清无颗粒；一冷至60c左右，参加 20 J 1mg/ml的澳化乙锭EB溶液，使终浓度为 0.5mg/ml ,混 匀后倒入制胶槽中，冷却凝固待用；一取 2.0 J 纯化 DNA+2 口 ddH2O+1.0 d 上样缓冲液6x loading buffer，吹吸混匀；一将凝胶连同制胶板一同放入电泳槽中，添加1XTAE至高出胶面约1mm。一将上述混合好的 DNA样品，按照下表顺序，点样到凝胶中。泳道12345678样品超螺旋markerpUC19pUC19/ Hindlll1

33、2345样量6(U)5.0(M)5.0(M)5.0(U)同前5.0( M)泳道91011121314151617样品超螺旋marker6+6-78910pUC19/ H indlllpUC19样量6.0)同前5.0（由5.05.0( J)一电泳仪使用操作：1 .首先用导线将电泳槽的两个电极与电泳仪的直流输出端联接，注意极性不要接反。2 .电泳仪电源开关调至关的位置， 电压旋钮转到最小，根据工作需要选择稳压稳流方式及电压电流围。 100-120V3 .接通电源，缓缓旋转电压调节钮直到到达的所需电压一般是5V/cm，设定电泳终止时间，此时电泳即开场进展，DNA样品从负极向正极移动，待观察到负极有气

34、泡升起方可离开。4 .当前沿DNA接近胶的前端时，切断电源，停顿电泳大约1h, 100V，工作完毕后，应将各旋钮、开关旋至零位或关闭状态，并拨出电泳插头，未向凝胶中参加EB时，应取出凝胶用于染色用凝胶成像仪观察，记录结果。1.22染色体DNA的提取、纯化和电泳I细菌培养将黄色黏球菌菌液 32C 200rmp振荡培养过夜。将过夜培养菌液以1%接种量接种到液体培养基中，32C,200rpm震荡20h,即可收集菌体提取DNA 。II菌体收集一将培养液倒入 1.5mlEp管中，10.000rpm, 2min ,弃上清；一重复收集一次，3.0ml/组一菌体沉淀中参加 500MTE,充分涡旋重悬；同时收集

35、两管，TE重悬后合并一 10, 000rpm,离心2min,尽可能吸弃上清III细胞裂解一菌体沉淀中参加200日BTL buffer ,涡旋重悬；一参加25proteinase K溶液，涡旋混匀 55 C水浴45min；期间每15-20min震荡混匀一次IV DNA纯化一参加25RNase A,颠倒混匀； 37 C 水浴 30min；一 12,000rpm, 5min沉淀不溶性细胞碎片；一小心转移上清到一新的 Ep管中；-参力口 220JBDL buffer ,颠倒混匀； 65 C水浴10min,促进DNA溶解；一参加220 d无水乙醇，充分涡旋，确保没有任何沉淀；一将DNA纯化柱蓝色组装到

36、2ml收集管上；一将上述样品全部、小心转移到柱子中；一 12, 000rpm, 1min使DNA结合，弃流出液；一将柱子组装到第二个收集管上，参加500 J buffer HB ;一 12, 000rpm, 1min,弃流出液；一将柱子组装到同一个收集管中，参加700 M wash buffer一 12, 000rpm, 1min,弃流出液；一重复洗涤一次;一使用同一收集管，13000rpm, 2min ,以去除残留的乙醇；一将柱子组装到新的 EP管上，参加50 pl65 C预热的Hution Buffer ,室温静置5min ;一 12, 000rpm, 1min,收集 DNA ;一重复收集

37、一次；IV 0.8%琼脂糖凝胶制备一正确组装制胶槽+制胶板+样品梳；一取40mL1XTAE至250mL干净红盖瓶中，称0.3g琼脂糖，倒入三角瓶混匀， 轻旋瓶盖， 微波炉加热沸腾 3-4次，至澄清无颗粒；一冷至60c左右，参加 20 J 1mg/ml的澳化乙锭EB溶液，使终浓度为 0.5mg/ml ,混匀后倒入制胶槽中，冷却凝固待用不少于 30min；V电泳上样一取 1.0M 纯化 DNA+4.0。ddH2O+1.0 pl 上样缓冲液6X loading buffer,吹吸混匀;一将凝胶连同制胶板一同放入电泳槽中，添加 1XTAE至高出胶面约1mm。一将上述混合好的 DNA样品，按照下表顺序，

38、点样到凝胶中。泳道1234567样品DNAHindlll12345作用MarkerMarker样量5.0(M)5.0(M)6.0( U)泳道891011121314样品DL5000678910入/ HindllI作用MarkerMarker样量5.0(M)6.0( pl)5.0(U)2.实验结果及分析2.1 质粒DNA的提取、纯化和电泳2.11 实验现象记录及分析经过细菌培养与菌体收集后共得到0.170g菌体实验步骤碱变性提取法RNase消化及酚-氯仿抽提试剂溶液I溶液n溶液出冰乙醇Tris饱和苯 酚溶液苯酚：氯 仿：异戊 醇溶液氯仿：异 戊醇溶 液NaAc 溶 液、 冰乙醇现象浑浊粘稠状，

39、较透明白色絮状沉淀沉淀溶液分成两 层，下层为黄 色，上层为无 色，两层交界 处有白色沉淀 析出溶液分成两 层，下层为 黄色，上层 为无色，两 层交界处有 少量白色沉 淀析出分上下两 层，均为 无色透明 液体，但 有较为清 晰的分相 面有沉淀产生分涡旋振荡，使细SDS使细胞膜破絮状物成分：蛋白质、染色体无水乙醇是DNA的沉酚是强的蛋白氯仿可以使 蛋白质变性由于氯仿 密度大于NaAc溶液中Na+中和变性齐h可以析胞完全裂，容物DNA 、 局部淀剂，夺去蛋白质变性析同时可以抽水，下层DNA 分子分散，而 溶液I 为等渗溶液，又释放RNAo线性的染色体DNA的两条互补DNA周围 的水分，使DNA失水

40、而易于聚出，由于酚的提苯酚，异 丙醇消除气 泡有助于分 相。为氯仿，上层为溶 有质粒DNA 的外表的负电 荷，使其不 带电荷而聚 集，乙醇与密度大位于下层，呈黄色有机相，溶解有|使细胞不至于链彼此已完全分 开，不能复性而合，形成沉 淀质粒DNA的水溶液水亲和力强于DNA ,夺无色水相位于与不稳定的大分上层，中间析|走DNA结破裂子RNA、蛋白质 -SDS复合物等一 起形成缠连的、 可见的网状构造 呈白色絮状沉 淀，白色是蛋白 质的颜色，DNA 为无色。出的白色沉淀合的水分子 使DNA分 子聚集生成 沉淀为变性的蛋白质。2.12 实验结果图示凝胶成像仪拍照如下123456789 10 11 12

41、 13 14 15 16 17图1.碱裂解法提取质粒 pUC19 DNA的琼脂糖凝胶电泳蛋白质杂 质与染色体DNA合体染色体DNA 片段杂质RNA污染未参加 RNase对照1 :超螺旋 marker ; 2： pUC192686bp； 3: pUC19/HindIII; 4-8,10-15:提取质粒其中 11为提纯过程中未参加 RNase的对照组；9:超螺旋 marker; 16: pUC19/HindIII; 17： pUC19 本组为6组，所提取的质粒 DNA电泳结果对应10泳道2.13 电泳结果及分析电泳结果分泳道描述及分析泳道2：超螺旋构型的pUC19,分子量为2868bp,介于超螺旋

42、 marker最下方分子量最小 两条带之间，由于点样量为100ng,因而亮度为超螺旋 marker电泳条带中除5026分子量片段150ng外其他片段50ng亮度的2倍。泳道3: pUC19/HindIII ,被Hindlll切过的pUC19质粒应绝大多数因 DNA双链被切开而成 为线性构型。质粒的不同构型虽然分子量一样，但是构型不同会导致电泳迁移速率的差异， 运动最快的是未被切开的超螺旋构型，迁移量最大，条带位于最下方，其次是线型，最慢的是开环状分子，位于最上方，图中可见的只有最下方的超螺旋构型条带和位于最上方的开环 状分子条带，且超螺旋构型条带亮度更大，说明比例更高，而本应占绝大比例的线状构

43、型那么几乎没有，说明此次酶切效率较低，甚至可能此次实验所用的Hindlll已不具有活性。泳道10:为本组提取pUC19质粒电泳结果，自下而上分别为蛋白质-DNA复合物，染色体DNA杂带，超螺旋质粒 DNA带与泳道2超螺旋构型的pUC19电泳结果相比照，提取的质粒DNA与商品的pUC19质粒DNA不在同一条带上，而在商品 pUC19质粒DNA条带的下面，可见出现了最下方电泳迁 移速率快于超螺旋构型的pUC19的物质，不符合预期的结果，由于本实验中质粒片段化的可能性极低，而且此现象出现在所有的组中，因而排除个人操作问题，可能的解释是质粒 pUC19由于某种原因构型发生变化，螺旋程度更高，因而电泳迁

44、移速率更快，迁移量更大。pUC19质粒构型改变的原因可能是提取 pUC19质粒的E.coli DH5 ”菌种存在变异，培养过程 中丧失了局部序列，或者是试剂的原因，使质粒DNA链螺旋化程度增加。具体原因需要进一 步酶切鉴定。本次实验中只有10组有成带系的超螺旋构型的pUC19,本组即6组因为量较少，超螺旋构型pUC19虽然可辨但是不成带系。远离下方超螺旋构型 pUC19条带位于中间偏上的白色亮区是由于参加溶液II或溶液Ill后过度震荡使大肠杆菌基因组DNA断裂形成的可溶于水的较小片段。由于分子量较大进入胶后无法继续运动。留滞于孔和孔的附近的白色区域是提取质粒DNA过程中未除干净的蛋白质，其与

45、DNA缠绕因而也显色。本实验中未能将蛋白质除净的原因可能是在酚-氯仿抽提时未能充分涡旋使酚和氯仿充分与蛋白质接触，因而残留一局部未变性而滞留于水溶液中的蛋白质，或者在吸取上清液时吸入少量已经变性沉淀的蛋白质，在电泳时，与大分子染色体 DNA碎片结合，由于蛋白质带相反电荷，有向相反方向运动的趋势，因而无法进胶电泳而留滞于孔中。开环质粒 DNA和线性质粒 DNA的电泳条带不清晰，因此样品中含有少量线形和环状 DNA.泳道11：未参加RNase除RNA杂质的pUC19质粒电泳结果，最下方高亮白色区域为 RNA , 由于RNA分子量较小，性质与质粒 DNA相似，假设不用 RNase降解那么无法与质粒

46、RNA 别离，在电泳过程中电泳迁移速率最快，迁移距离最远，位于最下方，RNA片段大小不一，因而呈片状分布而不是清晰的带状。由此可知RNase降解RNA效率较高，假设不用 RNase处理那么RNA杂质对最终结果影响较大。结论及分析提取质粒的电泳结果并不符合预期， 提取的质粒DNA的迁移距离大于相应 pUC19质粒的 商品标准的迁移距离，原因可能有两个，提取的质粒DNA分子量小于pUC19质粒的商品 标准，问题可能出于菌株的变异。提取质粒的带型并不正常，不属于根本带型中超螺旋型、线型和开环型的任何一种， 而是在分子量不改变的前提下，螺旋程度高于超螺旋构型， 可能的原因一是菌株变异，二是试剂的影响。

47、提取质粒的质量纯度：别离纯化的质粒 DNA样品中含有残存染色体 DNA片段，图中可从位于中间偏上白色亮区观察得知，是由于参加溶液II或溶液III后过度震荡时 间较长或动作力度过大使细菌染色体DNA断裂形成可溶于水的较小片段但仍大于质粒DNA，为了防止染色体 DNA断裂残留杂质，应注意在参加溶液II或溶液III后颠倒混匀时应动作轻柔且要注意控制时间。别离纯化的质粒 DNA样品中并 不含有残存RNA,可以通过比照泳道11未参加RNase处理，没有位于下方的小分子条带，说明RNA杂质去除较为彻底。别离纯化的质粒 DNA样品中含 有蛋白质杂质，可从孔中和孔附近的白色亮区 观察得知，原因可能是在酚 -氯

48、仿抽提时未能充分涡旋使酚和氯仿充分与蛋白质接触，应注 意在用有机试剂抽提蛋白质时充分混匀使反响充分进展，另一方面在进展酚-氯仿抽提时，吸取上清液时可能吸入少量的蛋白质，应注意在取上清液时不可求快，剩余少量时换小量程减小抽力，控制好枪尖的位置，慢速进展操作。提取质粒的相对定量，估计样品的浓度=75ng /科l利用质量的商品 DNA为依据，如泳道1中的超螺旋质粒 DNA Marker或者泳道2的100ng pUC19 质粒 DNA。澳化乙锭是一种具扁平分子的核酸染料，可以插入到DNA或RNA分子的碱基之间，并在300 nm波长的紫外光照射下放射出荧光，所以可用来显现凝胶中的核酸分子。在适当的染 色

49、条件下，荧光的强度是同DNA片段的大小或数量成正比。将浓度的标准样品作为对照，电泳并经 EB染色后，就可以根据 DNA条带的宽度与亮度估 计出待测样品的浓度。浓度的标准样品： Supercoiled DNA Ladder Marker(浓度：500 ng/ 6 口 ):由8种超螺旋的质 粒DNA 构成，DNA Size大小如表，每次取 6 口电泳时，每条带的 DNA量约为50 ng,其 中5 kbp条带的DNA量约为其他条带的 3倍(150 ng),显示亮带。大小bp2,0873,0493,9975,0266,1228,02310,08511,849DNA 量ng505050150505050

50、50上样量直接上样：6d泳道10为本组提取的质粒 DNA ,与泳道1的超螺旋Marker相对照，本组提取质粒 DNA电 泳发光后的亮度与超螺旋 Marker中分子量为5,0261 150ng超螺旋条带的亮度相近， 估计值 为150ng,加样量中纯化 DNA的量为2人那么估计样品的浓度 =总质量估计值/加样量中纯化 DNA量=150ng/2 M=75ng /科l2.2 细菌染色体 DNA的提取、纯化和电泳:2.21实验现象记录及分析实验步骤细胞裂解试剂JBTL bufferproteinase K现象涡旋后溶液由黄色粘液状变成较清 的黄色溶液，产生较多气泡，有沉淀 产生。黄色变淡分析BTL bu

51、ffer中含有SDS产生较多气 泡，使细胞膜溶解，溶液变澄清，同 时也释放色素，溶液变为黄色。沉淀 为不溶性细胞碎片降解蛋白质，使细胞裂解，与 SDS一起 作用活性较高，色素被降解而黄色变淡2.22实验结果图示凝胶成像仪拍照如下完整染色体DNAbp20001000750500250100蛋白质杂质与染色体dnaM合体10 11 1213 1bp23130、9416 -6557 4361 一2322 120271:入 DNA Marke； 2：入/HindllJ 3-7,9-13:提取的染色体 DNA; 8: DL2000 Marker;14 ：入/Hindlll Marker本组为6组，所提取

52、的染色体DNA电泳结果对应9泳道泳道1: 2NA Marker , ?DNA是人噬菌体中的DNA ,呈线状。分子量为，与 Hindlll Marker分 子量为23130的条带处于同一水平线上，入DNA的分子量显然大于其片段，但是由于琼脂糖 凝胶浓度选择围限制，0.8%别离围仅为0.220kb,大于20kb的DNA片段不可被别离而相 互堆叠。泳道 2： /HindIIIADNA呈线状且有7个HindIII酶切位点，切割后应形成 8个分子量各不一样的 DNA片 段，但图中之可见6个片段，DNA片段的分子量从上到下迁移距离增加亮度依次减弱， 分子量最大的亮度最大，缺失了两条分子量最小的条带。分析原

53、因同样分子数条件下，分子量越大结合 EB越多，显像越亮，相反分子量越小结合EB少，EB在电场作用下向相反方向运动，分子量小的DNA片段运动快，与EB充分接触时机少，而且由于迁移距离大， 最终所到达的位置 EB含量较少，因此显色暗，甚至无法从图中区分。假设要使小分子片段 DNA显像，需要提高加样量。条带向上弯曲原因：上样量较多；电泳液、胶中离子浓度不同；孔不光滑，可能是 拔梳子时有纵向滑动。泳道8/14： DL2000 Marker,最上方为分子量 2000的DNA 片段，与1 HindIII分子量为2027 的条带位置相近。泳道9:为本组6组提取的细菌染色体 DNA ,2、4、5组点样孔中有明

54、显的荧光该荧光应为染色体 DNA提取物中残留白蛋白质与DNA交联所致。说明蛋白质降解不彻底，可能是 proteinase K或BDL buffer处理时间较短不充 分，或者使用buffer HB、wash buffer清洗杂质不够彻底。在点样孔下放距离很近的胶中可以观察到少量的荧光，据推测这局部应为较完整的染色体DNA。因为真正完整的染色体 DNA由于分子量大应与蛋白质缠绕留滞于孔中或者入胶但由 于分子量较大黄色黏球菌基因组全长达913Mb,在0.8%的琼脂糖凝胶中几乎无法迁移无法继续运动而位于孔的附近，但本组结果中孔及孔附近的亮度较低，说明完整的染色体 DNA较少，染色体DNA在提取时有丧失

55、或者破裂程度较高。图中所示的亮条带并非只是一种分子量的DNA片段，由于染色体 DNA随机断裂成分子量不一的片段，但是受到 0.8%的琼脂糖凝胶别离围的限制，只可别离0.220kb的DNA片段，大于20kb的DNA片段会超过分辨围而相互堆积。造成染色体DNA断裂程度较高的原因可能是DNA释放后，操作过程中混匀的动作较为剧烈，应注意一旦染色体已经释放，动 作要轻柔慎重。由于琼脂糖凝胶浓度选择围限制，0.8%别离围仅为0.220kb,低于0.6%会使凝胶易脆，又由于细菌染色体分子量较大以Mb计量，即使是染色体 DNA的片段也很大，因而不能用常规的琼脂糖凝胶电泳确定提取的染色体DNA片段大小。分子量较

56、小、迁移量较大的DNA片段在图中并未充分显像，但这并不代表染色体DNA断裂没有形成较小分子量的片段，在调整亮度的过程中隐约可见亮带以下局部有弥散分布的灰白色暗区，推测为有随机断裂形成的分子量较小的不均匀DNA片段，分子量较小、迁移量较大的DNA片段在图中并未充分显像是由于在同样分子数条件下，分子量越大结合 EB越多，显像越亮，相反分子量越小结合EB少，EB在电场作用下向相反方向运动，分子量小的DNA片段运动快，与 EB充分接触时机少，显色暗，甚至无法从图中区分。假设 要使分子量较小的片段显像，需要提高加样量。2.3 质粒DNA与细菌染色体DNA提取实验的比拟2.31 实验结果电泳显像后，要的目

57、的条带不同，质粒 DNA提取纯化中，杂质是孔附近的发光点染色 体DNA片段与蛋白质的复合物，以及相邻的染色体 DNA片段杂带，目的条带是分子量约 为2686bp的质粒DNA ;细菌染色体 DNA提取纯化中，目的条带反而是孔中及附近的发光 点染色体DNA与蛋白质的复合物或染色体DNA片段，因为提取染色体 DNA要尽量保证其完整，分子量较大的染色体 DNA与蛋白质结合留滞于孔中或入胶后由于分子量较大而 无法继续运动，显色区位于上方。从侧面验证了染色体DNA分子量远大于质粒 DNA。质粒DNA分子量较小，在常规的琼脂糖凝胶电泳的别离围，可以用常规的琼脂糖凝胶电 泳确定提取的分子量大小，但是染色体DN

58、A及其片段分子量较大， 超过20kb,由于琼脂糖凝胶浓度选择围限制，低于0.6%会使凝胶易脆，而 0.8%别离围仅为0.220kb,超过20kb,常规的琼脂糖凝胶电泳无法别离，大于20kb的DNA片段会相互堆叠，因而不能用常规的琼脂糖凝胶电泳确定提取的染色体DNA片段大小。2.32 实验操作质粒DNA提取纯化与染色体 DNA提取纯化实验步骤中，都要遵循核酸提取的一般原那么 和一般过程，都需要除去RNA及蛋白质杂质，同时也都要注意小心操作，以免使染色体DNA在机械剪切力的作用下断裂，但是目的不同，质粒DNA提取纯化为了减少染色体 DNA片段杂质，而染色体 DNA提取纯化中为了保持染色体DNA的完

59、整性。3.讨论实验结果的分析见上一模块，此模块为实验试剂作用的总结、试剂盒各试剂作用的推测， 以及操作考前须知的总结3.1 相关试剂的作用质粒DNA的提取一一碱变性提取法溶液I: 50mM葡萄糖增加溶液粘度，防止 DNA受机械切力作用而降解； 25mM Tris-HCl (pH 8.0缓冲液；10mM EDTA (pH 8.0 EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，主要作用是抑制DNase的活性金属离子是 DNase的辅因子，在溶液I中参加高达10mM的EDTA , 目的是把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。溶液 II0.2N NaOH , 1% SDS,用 2M NaO

60、H 及 10%SDS 现用现配4SDS:阴离子外表活性剂，可破坏细胞膜，使 DNA释放出来；可结合蛋白质使蛋 白质沉淀下来；可抑制 DNase活性。NaOH :使DNA变性，核酸在 pH59溶液中稳定，12pH或pH3时会引起氢 键断 裂。溶液III5M醋酸钾 KAc-HAc , pH 4.8 ,贮存于4 CKAc :溶液出3M醋酸钾/ 2M醋酸：这一步的K置换了 SDS十二烷基磺酸钠 中的Na,得到PDS十二烷基磺酸钾沉淀；SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个 SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大局部蛋 白质也沉淀了，同时与蛋白质 -SDS复合物等一起形成缠连网状构造的大肠杆菌 的基因组DNA也一起被共沉淀。HAc :中和NaOH ,因为长时间