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1、苜蓿中华根瘤菌一天蓝苜蓿共生固氮体系对铜胁迫的响应及抗 铜工程菌构建本研究利用苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）CCNWSX0020 具有重金属铜抗性这一特性，将S.melilotiCCNWSX0020e蓝苜蓿共生固氮这一重要的生理过程与铜污染土壤的修复治理相结合，从植物自身抗氧化酶系统响应的角度 研究接种S.meliloti CCNWSX0020提高植物铜耐受性的机理，并进一步探索该共生固氮体系在重金属污染土壤修复中的实际应用潜力。盆栽条件下 ，将S.melilotiCCNWSX0020其宿主植物天蓝苜蓿建立适宜的生长条件和有效的共生体系，并筛选确定200 mg
2、kg-1 Cu2+为合适的铜胁迫浓度。结果表明,200 mg kg-1 Cu2+胁迫处理对植物生长与结瘤均造成显著的抑制作用，而接种S.meliloti CCNWSX0020在不同程度上提高了植物的生物量、株高以及总氮含量。与不接菌的植物相比，接种S.meliloti CCNWSX0020的植物地上部分和根部对铜的总吸收量分别显著提高了34.0% 120.4%,表明接种S.meliloti CCNWSX0020的天蓝苜蓿根部能够耐受更高浓度的铜胁迫 ，这也显示 了该共生固氮体系在植物固定技术中的应用潜力。通过对植物抗氧酶系统的测定分析，结果显示，在共生体系发育的不同阶段， 过量铜普遍提高了植物
3、体内内二醛（MDA珀含量，并且这种提高作用在不接菌的 植物中表现地更为显著。与不接菌的植物相比，接种S.meliloti CCNWSX0020的 植物在接菌后8天,13天,18天地上部分和根部的MD给量均显著下降。接菌植物地上部分的超氧化物歧化酶（SOD）?抗坏血酸过氧化物酶（APX）的 活性,与不接菌植物相比，在不同时间段表现出显著提高；同样,接菌植物根部的SOD过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽还原酶（GR）的活性也表现出不同程度的提高。 另外，在铜胁迫条件下,接菌后植物根部的抗氧化酶基因 Cu Zn SODc CuZn SODp CAT APXffi GRtB表现出普遍上调,在接菌植物的地上
4、部分也有类似的结果,即Cu Zn SODc Cu Zn SODp CA俐 APX&表现出上调表达。不同处理下植物体内的各抗氧化酶活性及其基因表达均随着共生体系不同的发育阶段表现出较大的波动，而接种S.meliloti CCNWSX0020表现出对植物抗 氧化酶系统响应铜胁迫过程中的促进作用。 根瘤菌对豆科植物生长的促进除了通 过固氮作用之外，部分根瘤菌还表现出促植物生长特性，例如产生呷咪-3-乙酸 (Indole-3-acetic acid,IAA) 、铁载体、溶磷作用、 ACC(1-aminocycloproprane-1-carboxylate)脱氨酶活性等。其中,ACC脱氨酶已在许多微生
5、物中得到分离和鉴定，具有ACC兑氨酶活性的 促植物生长细菌(Plant growth-promoting bacteria,PGPB)能够通过降低因环境 胁迫造成的植物体内乙烯含量的增加，从而缓解植物受到的不良反应，提高植物 的抗逆性。然而，ACC脱氨酶在根瘤菌中表达的活性远远低于其他自生的植物促 生菌，尽管已证实根瘤菌中的ACC兑氨酶对豆科植物的结瘤固氮起到一定的促进 作用，但低水平的酶活性可能不足以应对因外界不良环境造成的植物体内的乙烯 胁迫。因此，为进一步加强S.melilotiCCNWSX0020e蓝苜蓿这一共生体系在重金属污染土壤生物修复中的应用价值,通过三亲本杂交的方法将能够表达高
6、水平 ACC兑氨酶活性的植物促生菌 Pseudomonasputida UW4勺ACC兑氨酶基因acd S 转入到S.meliloti CCNWSX0020中，构建可以过量表达ACC兑氨酶活性的工程菌 S.meliloti CCNWSX0020(p RKACC)。酶活性测定结果显示，S.melilotiCCNWSX0020(p RKACC)ACC兑氨酶活性是里J生型菌株的12.6倍与接种野生型菌株相比,接种S.meliloti CCNWSX0020(p RKACC),或同时接种野生菌S.meliloti CCNWSX0020和P.putida UW4均显著提高了植物的生物量 及根长。为进一步研
7、究高度铜胁迫对共生条件下的acd S表达量的影响，利用qRT-PCFM 400 mgkg-1 Cu2+胁迫条件下，接种 S.meliloti CCNWSX0020(RKACC) 的植物地上部分和根部的acd S表达情况进行分析。结果显示,400 mg kg-1 Cu2+胁迫下的根部acd S的表达量较对照条件下的 根部acd S表达量提高了 4彳t(4.02 0.27,n=3),而在地上部分没有检测到acd S 的表达。这一结果与在过量铜胁迫条件下，接种S.meliloti CCNWSX0020RKACC) 的植物根部所产生的乙烯含量显著下降相一致。通过对天蓝苜蓿结瘤固氮的测定分析发现，尽管在
8、200 mg kg-1 Cu2+的中度 胁迫条件下，接种S.meliloti CCNWSX0020(p RKACC)表现出对植物根瘤鲜重的提 高作用，但对其根瘤数目及固氮酶活性并没有明显的影响，相应地，植物地上部分 和根部的总N含量也没有明显变化，这也表明过量表达ACC兑氨酶的根瘤菌对植 物生长的促进并不是通过固氮作用提高植物氮素营养而实现的。另外，与接种野生型菌株的植物相比，接种S.meliloti CCNWSX0020(p RKACC)显著提高了植物地 上部分和根部对铜的总吸收量，但同时又降低了植物根部向地上部分对铜的转运 系数。这显示出S.meliloti CCNWSX0020(p RK
9、ACC)-天蓝苜蓿共生体系在植物固定 技术中的实际应用潜力，降低因水土流失、土壤侵蚀而导致有毒重金属向食物链 转移的风险。基于 q RT-PCRM植物抗氧化酶基因(Cu Zn SODg Cu Zn SODp Fe SOD Mn SOD CAT APXffi GR)W表达情况分析显示，在400 mg kg-1 Cu2+胁迫 下,接种 S.melilotiCCNWSX0020RKACC)J植物地上部分 CuZn SODc Fe SODCA用口 APX勺表达量表现出略微的上调，在根部也均表现为上调表达，并且在铜胁迫条件下表现地更为显著,即在400 mg kg-1 Cu2+胁迫下,这7个抗氧化酶基因 的表达量普遍上调了 2.8-3.7倍。由此表明，过量表达ACC兑氨酶的工程菌 S.meliloti CCNWSX0020(p RKACC) 能够进一步促进植物生长和铜耐受性，同时还可能直接或间接地增强植物抗氧化 酶系统对铜胁迫的响应。
苜蓿中华根瘤菌—天蓝苜蓿共生固氮体系对铜胁迫的响应及抗铜工程菌构建
