重组克隆的筛选方法

《重组克隆的筛选方法》由会员分享，可在线阅读，更多相关《重组克隆的筛选方法（2页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、重组克隆的筛选方法重组克隆的筛选方法：1、抗性筛选；2、蓝白斑筛选；3、酶切电泳筛选；4、PCR筛选；5、测序验证； 6、表达筛选；7、生物活性筛选1抗性筛选一质粒载体携带的筛选标记（Amp R氨苄青霉素抗性；TetR四环素抗性；KanR 卡那霉素抗性）特点：一般用抗性培养基做初级筛选，只能保证有载体转入，不能保证外源基因插入2、蓝白斑筛选-3-半乳糖苷酶（lacZ）的显色反应a-互补：lacZ由4个亚基构成；细菌表达一部分（无活性） ，载体表达一部分（无活性）， 合在一起构成有活性的 lacZ可分解培养基平板中的底物 X-Gal，生成蓝色物质。 （需要 IPTG的诱导表达）外源基因插入载体后

2、，使载体部分lacZ失活，无法进行 a-互补一白斑。特点：未载入载体的细菌也会形成白斑，需同时用抗性筛选；无法确定基因插入 的方向；特殊 一基因过小，且读框正确，可能无法使载体部分lacZ失活，将产生 a-互补，产生蓝斑蓝白斑筛选的原理分类：生物科学蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法：是根据载体的遗传特征筛选重组子，如a-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有3半乳糖苷酶 基因（lacZ ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点 （MCS ）,它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到3半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，

3、这种载体适用于可编码3半乳糖苷酶 C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样， lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间 实现了互补，称为a-互补。由a-互补而产生的 LacZ+细菌在诱导剂 IPTG的作用下，在生色底物 X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无a-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛 选则经连接产物转化的钙化菌平板37 C温箱倒置培

4、养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。3、酶切电泳筛选选用不同的酶切组合，通过电泳检测DNA片段的大小特点：可鉴定外源基因的重组和插入方向；结果可靠但操作比较麻烦；无法检测基因内部的突变4、PCR筛选通过特异引物扩增，电泳检测，筛选重组质粒特点：可用2山菌液做模板，快速，方便，可批量检测；不能检测基因插入方向；不能检 测基因内部突变5、测序验证选取阳性克隆，送公司测序特点：最可靠的检测方法，可确定基因的重组， 插入的方向，基因内部的突变等； 价格贵， 适于12个克隆的验证一次测序反应一般准确测定500bp左右（也有测准 800bp，价格贵）测定的序列靠PCR近引物（起点）20-30

5、bp不准，500bp的序列也不准质粒测序：测序引物公司提供；产物直接测序：测序引物自己提供，理论上比质粒测序更可靠（注意：a、测序引物必须与模板完全配对；含有 mix碱基的引物一般不能测序；b、测序引物长度一般为 29个碱基左右， GC 含量必须在 59%60%左右6、表达筛选一、SDS-PAGE 筛选：小量诱导表达； 全菌液裂解后进行 SDS-PAGE 电泳； 重组的表达克隆将在特定的位置出现较浓的蛋白条带。 （需加不诱导的对照） 特点：1、可检测外源基因的表达。 （一般基因的插入，方向，读框都正确）2、无法筛选不能有效表达的重组质粒二、亲和筛选： 50 ml 菌液诱导表达；超声破菌；用少量亲和beads 吸附上清；SDS-PAGE 检测；在特点位点将出现一条蛋白带。特点：适用于有亲和 Taq 的融合蛋白的检测；比 SDS-PAGE 筛选更灵敏（富集） ，可靠； 比较麻烦。三、免疫筛选：用抗体检测目标蛋白；Western blot （最准确）；ELISA （可能会受到交叉反应的干扰）7、生物活性筛选? 酶：测定酶活；? 亲和蛋白：与亲和底物作用。? 其它的生物活性。