检验方法学验证标准操作规程

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1、1.0 目的 1.1 确立海南国瑞制药有限公司方法学验证标准操作规程，使方法学验证规范化。2.0 范围 2.1 本标准适用于新的检验方法、检验方法变更的相应检测要求。2.2 本标准适用于采用中国药典及其他法定标准未收载的检验方法、法规规定的其他需要验证的检验方法的相应检测要求。2.3 清洁验证方法的验证。3.0 职责3.1 QC负责对适用范围内的分析方法进行验证；3.2 质量管理部负责监督本规程的实施；4.0 定义 4.1 用户需求（URS）：使用方根据使用目的、环境、用途等，对制药机械的性能、技术、使用、服务等提出的要求。4.2 准确度：准确度系指该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度。

2、一般以回收率（%）表 示。4.3 精密度：精密度系指在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。一般以偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。4.4 专属性：专属性系在可能其它成分（如杂质、降解物、辅料等）存在的条件下，采用的方法能正确测定待测物的特性。如方法不够专属，应采用多个方法予以补充4.5 检出限：检出限是限度试验的参数，指试样中被测物能被检测出的最低量。定量分析的检出限必须经过分析适量的在检出限附近的样品或分析按检出限条件配制的 样品的方法进行验证。4.6 定量限：定量限系指样品中被测物能被定量测定的最低值，其结果应具有一定的准确度和精密度。定量分析的定量限必

3、须经过分析适量的在定量限附近的样品或分析按定量限条件配制的样品的方法进行验证。4.7 线性：线性系指在设计的范围内，测试结果与被测物浓度呈正比关系的程度。4.8 范围：范围系指能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。4.9 稳定性：稳定性系指在正常实验条件下，供试品或对照品溶液在分析过程中的稳定程度。4.10 耐用性：耐用性系指在测定条件有小的变动时，测定结果和方法提供常规检查依据不受影响的承受程度。开始研究分析方法时，就应考虑其耐用性。4.11 取样效率：取样效率仅用于设备清洁验证时所用分析方法的验证，系指用棉签或特定溶剂从设备表面获取的被测物的量与设备表面被测物

4、的实际含量接近的程度。一般以回收率（）表示。5.0 规程 5.1 验证目的5.1.1证明采用的方法适合相应检测要求。5.2 验证原则5.2.1 通常情况下，分析方法需要进行方法验证。对于仅需按照实验室日常测试操作步骤测定的检验项目不需要进行验证，如外观、崩解时限、密度、重量、PH值、灰分、装量等。5.2.2 方法验证的内容应根据检验项目的要求，结合所采用分析方法的特点确认。5.2.3 同一分析方法用于不同的检验项目会有不同的验证要求。5.3 验证程序5.3.1 综述5.3.1.1无论是新方法的开发还是对原有方法的修订，都意味着变更，都需要有针对性地进行实验室验证，以证实该变更的合理性和必要性，

5、即证明该方法能够达到检验的预先目的。5.3.1.2当引入的分析方法没有任何变更，可直接在实验室全面实施时，虽然该方法已经进行过验证，但由于本地实验室的各种客观条件（如仪器、试剂、外界温湿度变化等）可能与原方法提供地不同，检验员对检验方法及操作标准的理解和认知程度也可能存在差异， 这些原因均可能造成检验偏差的产生，故应在使用前对所引入方法进行必要的转移或确认，以确保方法可以在本地无误实施。5.3.1.3各国药典或行业法规指定的检验方法，可视为已经过验证，但需参考方法确认进行药典或法规方法的引进确认。5.3.1.4若原方法已经过验证，则只需依据原方法的验证报告进行方法转移，不再进行全面完整的验证；

6、对以往老产品的分析方法，如原厂无力或无法进行方法转移，可用方法确认替代。5.3.1.5由于物理量的检验（如pH、粘度、相对密度、颜色等）通常只是纯粹的测量，其基本理论已经过多方验证，所以无需再验证、确认或转移。但必须保证测定值在所使用仪器量程范围内，仪器必须定期校验且校验结果符合要求。5.3.2人员及设备的要求5.3.2.1人员应有相应的教育背景，接受过方法验证的系统培训，具备丰富的检验知识及熟练的 检验技能。5.3.2.2设备应定期校验且校验结果符合要求。5.4 验证方案5.4.1方案的确定5.4.1.1所有自行开发的分析方法或对原方法进行的变更，均需进行完整全面的验证。对于HPLC、GC、

7、IR等测定方法，还应进行系统适应性测试，系统适应性测试应满足该方法适应性项下各项要求。5.4.1.2验证的数据要求视检验方法的不同特点，对验证数据的要求也不同，有的要求得到精确的检验结果，也有的要求对方法的属性进行主观评价。考虑到这些差异，在提出方法验证的数据要求时，只能具体问题具体分析，就不同的方法给出不同的验证方案。表1给出了常见分析方法所涉及的验证数据要求：表 1.验证内容和数据要求特征参数I类II类III类IV类定量方法限度测试准确度是是*否精密度是是否是否专属性是是是*是检测限否否是*否定量限否是否*否线 性是是否*否范 围是是*否*视专属测试的性质，可能需要测试该项目。类：定量测定

8、药品中主成分或成品药中活性组分（包括防腐剂）的分析方法。类：测量药品中杂质或成品药中降解化合物的分析方法，包括定量测定和限度试验。类：测量药品性能特性（如溶点、旋光度）的分析方法。类：鉴别反应。5.4.1.3分析方法的有效性分析方法的有效性只能在实验室中确认，所以圆满完成此类研究的文件也是判定方法是否适用于其用途的基本依据之一。现行的药典方法也不例外，同样也必须在实际使用条件下证明方法的适用性。5.4.2预验证预验证系指在正式验证前进行的实验，目的是收集证据，以初步证实该检验方法 可以达到预期要求。预验证主要用于自行开发的分析方法实验，对于引进的分析方法，可参照原供户方法验证报告直接进行验证。

9、自行开发的分析方法通常要经历三个步骤： 参照文献设计方法，此时可能有不只一种方案或设想； 进行预验证，优化筛选实验条件，制订验证草案； 方法一旦初步确定，根据草案进行正式验证，提交验证报告，完成检验方法评审，决定这一方法是否可用。一个检验方法的开发要获得成功，预验证中最重要的内容就是该方法的专属性及准确度测定（详情参见后续介绍）。完成这两项工作后，须进行评审。如满足要求，可进行简单的线性和范围实验，以确定方法最终验证的范围，此时根据“6.3 验证方案的确定”来判断方法类型，确定验证方案，制订验证草案，然后严格遵循验证草案实施验证；如不满足要求，则应重新设计检验方法后再次进行预验证。5.5验证操

10、作程序及要求5.5.1准确度5.5.1.1方法：在可得到空白样品的前提下，称取一定量的空白样品（相当于方法要求的标准称样量减去等量供试品中被测物量），在规定的范围内，精密加入已知量被测物对照品， 制备3个不同浓度的供试品溶液（通常为范围的上、下限及供试品的标示量），每个浓度平行两份，每份测定2次，计算回收率及相对标准偏差，即得。本法为推荐使用方法。5.5.1.2方法：在空白样品无法得到时，可使用标准加入法。称取标准量的样品，在规定范围内，精密加入已知量被测物对照品，制备3个不同浓度的混合标样（通常为范围的上、下限及供试品的标示量；对于不高于标示量的浓度，可在加入被测物对照品后进行稀释），每个浓

11、度平行制备两份，每份测定两次，计算混合标样与供试品样品差值的回收率及相对标准偏差，即得。准确度若由3名不同经验的检验员在3台不同型号仪器上分别进行验证，并注意尽可能 使用不同供户、不同批号的试剂，则将其数据汇，总即可用于评价通用性。5.5.2精密度重复性是指在同一实验室内，由同一分析人员用相同的设备测得的结果（两次测量之间的时间间隔很短）之间的精密度。ICH文件建议在评价重复性时，至少要在规定的范围内，获得9组测定结果（如设计三种不同浓度，每种浓度分别制备3组供试品；或将相当于100%浓度水平的供试品溶液，用至少测定6次的结果进行评价）。中间精密度：也称为再现性，指的是在同一个实验室内，不同时

12、间由不同分析人员用不同设备测得的结果之间的精密度。重现性：在不同实验室，由两位检验员将同一均匀样品分别重复称样制备供试品溶液6份，每份测定1次，分别计算平均值及相对标准偏差，即得。（此项考察仅用于方法转移，具体限度要求详见每一份转移草案。）5.5.3专属性根据方法规定，同条件下测定普通空白样、特殊条件空白样（如设定普通空白样在60条件下放置两周）、对照品、标准样品、可能的杂质和降解产物等，对照测定结果，良好的专属性应表现为其它各种组分均不干扰被测物的测定。如在液相色谱图谱中，普通空白样、特殊条件空白样、有关物质、内标、被测物对照品均应得到良好分离，如方法同时用于有关物质限度测定，则要求各有关物

13、质峰和可能存在的空白干扰峰 均应完全分离，互不干扰。5.5.4检出限5.5.4.1.仪器分析的处理方法5.5.4.1.1方法：把已知低浓度供试品溶液和空白样品溶液分别重复测定6次，计算测得信号的平均值与信噪比，以信噪比为3:1时的相应浓度或注入仪器的量定为检出限。5.5.4.1.2方法：平行测量空白样品6次，计算背景响应值的标准偏差，其3倍值在工作曲线上对应的待测物浓度即为估算的检出限。5.5.4.1.3方法： 按照计算出的检出限浓度平行制备6份供试品溶液，每份测定一次，分别测量信噪比（S/N），均应不小于2。5.5.4.2非仪器分析的处理方法用已知浓度的被测物，试验出其能被可靠地检测出的最低

14、浓度或量。5.5.5定量限5.5.5.1仪器分析的处理方法5.5.5.1.1方法：把已知低浓度供试品溶液和空白样品溶液分别重复测定六次，计算测得信号的平均值与信噪比，以信噪比为10:1时的相应浓度或注入仪器的量定为定量限。5.5.5.1.2方法：平行测量空白样品6次，计算背景响应值的标准偏差，其10倍值在工作曲线上对应的待测物浓度即为估算的定量限。5.5.5.1.3方法：按照计算出的定量限浓度平行制备6份供试品溶液，每份测定一次，计算回收率及相对标准偏差，应符合相应规定。5.5.5.2非仪器分析的处理方法用已知浓度的被测物，试验出其能以较好的准确度和精密度检测出的最低浓度或量。5.5.6范围应

15、根据分析方法的具体应用和线性、准确度、 精密度结果和要求确定范围，如50150和80120等。5.5.5.7线性在检测范围内，增加适当系列浓度，照“准确度”项下方法分别验证回收率，每个浓度的供试品溶液应平行制备两份并分别测定两次，计算回收率。如范围为50150，增加75和125；范围为80120，增加90和110。加上准确度测定的数据（共至少5个浓度），必要时可作适当数学变换（如进行双对数变换等），绘制回归直线，计算线性相关系数（R）。5.5.8稳定性将新制成的一份供试品溶液及可能存在的一份对照品溶液重复测定2次，作为初始值。根据期望的可稳定储存期限，在一定条件下（室温或冰箱中）储存一段时间，

16、在这一段周期中至少安排间隔测定两次，计算数次测定结果与初始值的最大绝对偏差及所有结果的相对标准偏差。色谱测定一般考察储存24小时的稳定性，需要注意主成分的含量稳定性，同时还需注意是否有新降解产物的出现；若检出新降解产物，应不大于主药含量的0.03。光谱测定一般考察储存8小时后结果即可。5.5.9耐用性有意识在可接受范围内稍微变化操作条件（如液相色谱可以变动流动相的配比、pH、离子强度、柱温、流量、检测波长、进样量、梯度曲线等；溶出度可以变动转速、搅拌时间等），一般每条件在范围内考察35个变数，将得到对检测结果的影响以图表形式表现，如色谱需考察选择性、分离度、拖尾因子、理论板数等的变化。结果间的

17、绝对偏差与精密度相结合来评价便可获得方法的粗放度。经试验，应说明小的变动能否通过设计的系统适应性试验，以确保方法有效。5.5.9.1取样效率（只针对设备清洁验证的检验方法验证）在清洁验证的方法验证中，须测量棉签或冲洗溶剂的取样效率。测量方法如下：在清洁验证专用钢板上，在1010cm 2的面积内涂上一定量已知浓度的标准溶液，晾干后，用事先经相应溶剂润湿过的取样棉签或一定量的冲洗溶剂按照清洁验证取样程序擦拭取样。然后按照待验证方法中所述方式进行处理，制备供试品溶液，重复制备6份，每份测定一次，计算各供试品溶液中被测物的回收率，所得单个棉签回收率结果均须大于 60。5.6再验证在下列情况下需要对检验

18、方法进行再验证仪器更新或经过大修（控制、电路部分全面更换）；对检验方法获得的结果作趋势分析，发现系统误差；对检验规程进行修订或检验条件发生变更；经过一段时间使用后对检验方法应再验证。再验证的计划和实施办法应根据具体情况制订，不宜制订统一尺度。5.6.1验证参数及其接受标准对清洁验证中分析方法的验证，其验证参数可参照表2中的第1类方法的标准适当放宽。表2列出了常见验证参数的可接受标准。表2.常见验证参数的可接受标准分类标准项目第1类方法第2类方法第3类方法准确度（%）单个值95.0105.085.0115.095.0105.0平均值98.0102.090.0110.098.0102.0RSD2.

19、0%6.0%3.0%重复性RSD2.0%3.0%2.0%中间精密度每人测得结果的RSD2.0%6.0%3.0%所有测得结果的RSD3.0%20.0%3.0%各人平均值间最大绝对差值3.0%10.0%3.0%线性相关系数(R)0.9990.990.99稳定性与初始值的最大绝对偏差2.0%10.0%2.0%RSD3.0%20.0%3.0%定量限单个值N/A70.0130.0N/A平均值N/A80.0120.0N/ARSDN/A20.0%N/A对于特殊检验方法，以上限度可作适当调整，具体限度以验证草案为准。6.0 附录6.1 N/A7.0 相关的记录表格7.1 N/A8.0 培训范围8.1培训对象（Trainees）：质量控制室。8.2培训负责人(Trainer)：质量控制室主管。9.0 参考及相关的文件 9.1 2010年版(二部) 附录A 药品质量标准分析方法验证指导原则9.2 2011年8月第一版10.0 修订历史 修订号修订内容描述生效日期9 / 9文档可自由编辑打印