酿酒葡萄中与原花色素生物合成相关的【推荐论文】

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1、精品论文酿酒葡萄中与原花色素生物合成相关的MYB 家族转录因子启动子的克隆与功能 研究5何非1，李强1，朱保庆1,2，潘秋红1，段长青1（1. 中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；2. 北京林业大学生物科学与技术学院，北京 100083）摘要：原花色素是葡萄果实中的一类重要的多酚代谢产物，对葡萄和葡萄酒的口味有着重要 的影响。近年来，一些涉及葡萄果实原花色素生物合成的调节基因得以被发现，其生理功能10也得到了阐明。特别是对葡萄 MYB 家族一系列转录因子的发掘，极大的推动了本领域相关 研究的发展。而到目前为止对这些调节基因启动子结构和功能的研究还非常有限。本研究旨 在克隆与

2、酿酒葡萄原花色素生物合相关的转录因子 VvMYBPA1、VvMYBPA2 和 VvMYB5a 的启动子序列，通过生物信息学对其潜在功能进行预测，通过启动子重组载体侵染烟草叶片 来检验其基本功能。研究发现，与原花色素生物合成有关的这些关键结构基因的启动子相比，15这些调节基因的启动子序列在潜在功能上有着极大的不同，特别是光响应元件在种类和数量 上的差别较大，且多含有其它转录因子和不同激素信号的响应位点。而启动子活性检验则表明，这些目标序列具有启动子的基本活性，且 UV-B 照射可以导致报告基因表达量的略微增 加，表明它们具备一定的响应紫外诱导的功能。 关键词：酿酒葡萄；原花色素；调节基因；启动子

3、；克隆；功能20中图分类号： S663.1Cloning and Functional Study for Promoters of MYB Family Transcription Factor Related to Proanthocyanidin Biosynthesis in Wine Grapes25HE Fei1, LI Qiang1, ZHU Baoqing1,2, PAN Qiuhong1, Duan Changqing1(1. China Agricultural University, College of Food Science and Nutritional Engi

4、neering,Beijing 100083;2. Beijing Forestry University, College of Biological Sciences and Technology, Beijing 100083)Abstract: Proanthocyanidins are an important group of polyphenolic metabolites in grape berries,30which have great influences on the taste of grape and wine. In recent years, some reg

5、ulatory genesrelated to proanthocyanidin biosynthesis in grape berries were found, and their physical functions were also clarified. Especially the studies of a series of regulator of MYB family in grapes have greatly developed the researches in this area. However, until now the researches for the s

6、tructures and functions of the promoters of these regulatory genes are still quite limited. In the present study,35the promoter sequences of the regulatory genes VvMYBPA1、VvMYBPA2 and VvMYB5a whichare related to proanthocyanidin biosynthesis were cloned, their potential functions were predicted with

7、 the help of bioinformatics, and their basic functions were tested by using infecting of promoter combinant vector on tobacco leaves. This research revealed that compared to the structure genes related to proanthocyanidin biosynthesis, the promoters of these regulatory genes40were quite different in

8、 the structure and the protentional functions, especially in the kinds and numbers of the photoresponse elements, and they often contain the response sites to other different regulators or phytohormone signals. Besides, the function test revealed that all these aimed sequences had the basic function

9、s of promoters, and after the irraidation of UV-B the expression of the report genes increased slightly, showing their function in responding the induction of UV.基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金资助（90008110018）作者简介：何非，（1983-），男，讲师，主要研究方向：酿酒葡萄分子生物学与葡萄酒化学。通信联系人：段长青，（1964-），男，教授，主要研究方向：酿酒葡萄风味代谢与调控、葡萄酿酒品质评 价、葡萄酒酿造与葡

10、萄酒化学。 E-mail: chqduan- 10 -45Keywords: Wine Grapes; Proanthocyanidin; Regutory Genes; Promoters; Cloning; Function0引言原花色素是葡萄果实中重要的多酚类次生代谢产物，不仅可以为葡萄和葡萄酒贡献一定 的苦和涩的味道1-2，通过辅色效应影响葡萄酒的颜色3-4，还会影响葡萄酒香气物质的表现505，因而对葡萄酒、特别是红葡萄酒的感官品质有着重要的影响。 随着对植物原花色素生物合成研究的不断深入，人们发现了该路径一系列重要的结构基因及其蛋白的生理功能，特别是无色花色素还原酶（Leucoant

11、hocyanidin reductase; LAR）和 花色素还原酶（Anthocyandin reductase, ANR）。前者可以催化一系列二氢黄烷酮生成 2R, 3S- 黄烷-3-醇类物质，如（+）-儿茶素、（+）-棓儿茶素、（+）-阿福儿茶精，后者则可以催化55一系列花色素生成 2R, 3R-黄烷-3-醇类物质，如（-）-表儿茶素、（-）-表棓儿茶素、（-）- 表棓儿茶素-3-O-没食子酸酯和（-）-表阿福儿茶精等，这两类黄烷-3-醇物质都是原花色素生 物合成的重要组成单元，对于酿酒葡萄果实的研究也进一步证明了这一点6-8。近年来，葡萄果实中调控苯丙烷代谢和类黄酮代谢的转录因子被陆续

12、鉴定。迄今认为至 少有六个家族的转录因子（MYB、bHLH、WD40、WRKY、锌指及 MADS box 蛋白）参与60了植物原花色素生物合成的调节，其中针对 MYB 家族转录因子的研究最为广泛。到目前为止，已发现了三个能够调控葡萄果实原花色素生物合成关键基因表达的 R2R3-MYB 类转录 因子，即 VvMYB5a9、VvMYBPA110和 VvMybPA2 11，在葡萄中，这些转录因子的基因表 达与原花色素的积累是同步的，即这些转录因子可以调节葡萄无色花色素还原酶和花色素还 原酶基因在转录水平的表达。65然而，尽管人们对葡萄及其它作物原花色素生物合成关键结构基因和调节基因的研究不 断深入，

13、但到目前为止，对这些基因启动子序列、结构和潜在功能的研究还较为有限。本研 究旨在结合分子生物学和生物信息学的相关技术，对酿酒葡萄赤霞珠原花色素生物合成关键 调节基因 VvMYB5a、VvMYBPA1 和 VvMybPA2 的启动子进行克隆，并对其潜在功能进行预 测，并对其基本生理功能进行验证，以期对本领域的进一步深入研究奠定一定的理论基础。701材料方法1.1 材料植物材料：2010 年 8 月采自河北省怀来县中法葡萄酒庄园的赤霞珠葡萄（Vitis viniferarL. cv. Cabernet Sauvignon）嫩叶，嫩叶经去离子水清洗晾干后，迅速用液氮速冻并储存于-80待用。75药品试

14、剂：植物基因组 DNA 提取试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；Taq plus 聚 合酶和 DNA marker DL 2000，大肠杆菌（Escherichia coli）DH5 感受态细胞，DNA 凝胶回 收试剂盒购自天根生化公司；表达载体 pMD19-T 质粒，T4 连接酶，Oligo (dT)18，DNase I 限制性内切酶购自于日本 Takara 公司；反转录酶购自 Promega 公司；MS 培养基、乙酰丁香 酮均购自 Sigma 公司；D-荧光素（D-Luciferin K salt）购自海德生物有限公司。所有寡聚糖80核苷酸引物的制备由上海生工承担。1.2 方法1.2.1葡

15、萄果实基因组 DNA 的提取采用上海生工生物工程有限公司植物基因组 DNA 提取试剂盒，并有所改动。1.2.2VvMYB5a、VvMYBPA1 和 VvMybPA2 启动子的克隆85根据 NCBI 数据库中已知 VvMYB5a、VvMYBPA1 和 VvMybPA2 的 cDNA 序列，于 NCBI 葡萄基因组数据库（http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch& PROG_DEF=blastn&BLAST_PROG_DEF=megaBlast&BLAST_SPEC=OGP 29760 12992） 和 Gra

16、pe Genome 葡萄基因组数据库（s.fr/blat-server/cgi-bin/vitis/ webBlat）中进行铆钉比对，查询起始密码子上游 1000 bp 范围内的序列信息，设计引物如90表 1 所示，采用设计的特异引物对目标基因启动子进行扩增。表 1 VvMYB5a、VvMYBPA1 和 VvMybPA2 启动子特异引物的设计Table 1 Design of the specific primers for VvMYB5a、VvMYBPA1 and VvMybPA2基因名称退火温度()预测扩增片段长度(bp)含有启动子片段长度(bp)引物序列VvMYBPA146.999794

17、0S: TTTCGTATTTGTTCTCAAAAA: GGCAGTCCATGAACCTCTATVvMYBPA254.010491019S: GTGTTTGGCTGCTGGGAAATA: CTCTTTGGCACAGCAAGGTCVvMYB5a52.11047994S: TGGGAAGAGGAAGTCTCACGA: ACCTTGGTACAGCACGGAGT95100105110以赤霞珠葡萄总 DNA 为模板，采用梯度 PCR 法对 VvMYB5a、VvMYBPA1 和 VvMybPA2的启动子进行扩增，并对扩增片段进行测序和拼接比对。1.2.3启动子功能预测利 用已经 得到的目 标基因 的启动 子

18、序列 ，在 PlantCARE 在线软 件（ http:/ bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）中进行比对分析，分析目标基因启动子 序列中的顺式作用原件，特别是潜在的光响应元件及其配件，以及与转录因子有关的顺式作 用元件12。1.2.4目标启动子 LUC 荧光表达载体的构建将克隆得到的 VvMYB5a、VvMYBPA1 和 VvMybPA2 的启动子片段进行双酶切后，重组 到改造的 pCAMBIA 1300-LUC 载体(改造后使其含有 LUC 全长片段)上，并转化 E.coli DH5 筛选阳性克隆，经过菌落 PCR 和酶

19、切鉴定正确后，送测序公司测序。提取测序正确的质粒 DNA 待转入农杆菌，用于后续实验。1.2.5烟草叶片的侵染将测序正确的农杆菌转接至含有 50 g/mL 的硫酸卡那霉素的 LB 液体培养基中，28，240 rpm 振荡培养过夜，至菌液浓度为 OD600=1.0 时，吸取 1mL 菌液至 1.5 mL 离心管中，4000 rpm 离心 5 min 集菌。用 1 mL 烟草注射缓冲液将菌重新悬起，4000 rpm 离心 5min，弃 上清，重复三次。用适量的烟草注射缓冲液将细胞悬起使其 OD600=0.6，静置 4 h。将菌液 注射至生长 6 周左右的烟草叶片中，正常光照培养 48-60 h。精

20、品论文1.2.6启动子活性检测叶片用 1D-荧光素工作液处理后，使用荧光成像系统（Andor iXon）拍照观察。1151201251301351.2.7紫外光诱导处理将构建好的目标基因启动子瞬时荧光表达载体转化根癌农杆菌，用农杆菌侵染烟草叶 片，暗培养 48 小时后，将烟草叶片沿中间叶脉分为两部分，其中 1 份不经紫外处理，用标 签纸包裹做黑暗对照，另一份在室温为 25的暗处分别用 UV-B（305 nm）照射，紫外灯管 距烟草叶片表面约为 50 cm，达到 1.8 kJ/m2 的照射剂量，照射达到相应剂量后立即将烟草叶 片取出，以待后续检测启动子活性，重复三次。2结果讨论2.1葡萄基因组

21、DNA 的提取以赤霞珠葡萄嫩叶为材料，采用改进的上海生工生物工程有限公司植物基因组 DNA 提 取试剂盒提取葡萄基因组 DNA。最终得到的葡萄基因组 DNA 质量高，并且无杂带污染， 可用于目标关键基因启动子的克隆。葡萄基因组 DNA 的电泳结果如图 1 所示。图 1，葡萄基因组 DNA 琼脂糖凝胶电泳结果Fig. 1 Agarose gel electrophoretic analysis of genomic DNA isolated from Cabernet Sauvignon grapes2.2关键基因启动子的预测与克隆采用生物信息学方法，利用已有文献报道的或葡萄基因组信息预测的结构

22、基因VvMYB5a 、 VvMYBPA1 和 VvMybPA2 的序列信息，在 NCBI 葡萄 基因组数据库 （http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/ blast/Blast.cgi）中进行 Blast 比对，铆钉目标基因在葡萄基因 组测序数据库中目标染色体上的定位。目标基因在葡萄基因组中的基本比对信息，如表 2 所示。表 2 目标基因在葡萄基因组中的基本比对信息Table 2 The comparison resultes of the aimed genes with the information in grape genome基因名称染色体编号染色体长度起始位点终止位点

23、片段长度内含子个数VvMYBPA1Unknown4442683324113314648612VvMYBPA2115503442104328310418058553VvMYB5a82945589126924112681739632140145150利用涉及的特异引物，通过梯度 PCR 克隆目标基因的启动子片段，目的片段的电泳图如图 2 所示，纯化产物用于测序。图 2 目标基因启动子的克隆Fig. 2 Cloning of the aimed genes promoters测序结果表明，本研究所克隆得到的目标基因启动子序列，与原假定序列基本一致，其 一致性在 98.48%以上。登记 VvMYB5a

24、、VvMYBPA1 和 VvMybPA2 的启动子序列于 NCBI 数 据库，其编号分别为：KC491174，KC447440 和 KC447441。由于大规模基因组测序中很难 对启动子片段中大量出现的重复片段进行有效地拼接，因此，通过 PCR 手段直接克隆目标 基因启动子仍是较为有效和可靠的方法。实际克隆得到的目标基因启动子序列与基因组预测 序列的比对信息如表 3 所示。155160165表 3 实际克隆目标基因启动子序列与基因组预测目标基因启动子序列的比对信息Table 3 The comparison of the sequences of the aimed genes promote

25、rs between cloning results and prediction results from grape genomic information基因名称 实际启动子片段长度(bp) 一致性缺口VvMYBPA1 939 100.00%(939/939)0.11%(1/940) VvMYBPA299198.48%(973/988)0.60%(6/994) VvMYB5a99699.60%(988/992) 0.60%(6/998)2.3关键基因启动子功能的生物信息学预测2.3.1VvMYBPA1 基因启动子中顺式作用元件的分析和预测通过比对分析，我们发现 VvMYBPA1 基因启动

26、子序列（939 bp）中共有 21 大类 24 种76 个潜在的顺式作用元件或顺式作用元件的部分配件，其中仅含有 5 种 13 个顺式作用元件 与光响应有关，包括 AE-box I（1 个）、Box I（2 个）、GAG-motif（1 个）、SP1（8 个） 和 chs-CMA2a（1 个），如表 4 所示13-14。这与结构基因 VvLAR1、VvLAR2 和 VvANR 的启 动子序列中涉及光响应的顺式作用元件有着极大的不同。尽管 VvMYBPA1 基因启动子序列 中能够单独起作用的顺式作用元件主要集中在 Box I 和 SP1 元件上，但由于 SP1 元件在370374 bp 处的集中

27、分布，使其具备了较强的光响应能力，表明了 VvMYBPA1 基因有一定 的受光诱导表达的能力。不同于结构基因 VvLAR1、VvLAR2 和 VvANR 的启动子序列，VvMYBPA1 基因启动子序 列中不含与转录因子调节有关的 MBS 和 W Box 位点，但包含涉及光响应的 MYB 结合位点 MRE（+链，331 位，AACCTAA），表明其相应光诱导的机制与 VvANR 基因可能较为类似：精品论文170175不仅仅直接相应光诱导，同时也会受到 MYB 家族转录因子光响应的间接诱导，而后者作用较为单一，所受 MYB 家族其它转录因子和 WRKY 家族转录因子的影响较小。此外， VvMYBP

28、A1 基因启动子序列中，包含多种响应植物激素调节的顺式作用元件：如涉及茉莉酸 甲酯响应的 CGTCA-motif 和 TGACG-motif 元件（各 1 个）、涉及赤霉素响应的 GARE-motif 和 P-box 元件（各 1 个），涉及水杨酸响应的 TCA-element 和生长素响应的 TGA-element 元件（各 2 个）。由此可见，VvMYBPA1 基因启动子序列中几乎囊括了除脱落酸以外的所有 响应元件，其表达可能受多种激素共同作用的影响，这也是其作为转录因子而常见的现象。表 4 VvMYBPA1 基因启动子序列中涉及光响应的顺式作用元件Table. 4 The cis-act

29、ing elements related to photoresponse in the promoters seguence of VvMYBPA1元件名称位点链基本序列功能AE-box359+AGAAACAA光响应单元的一部分Box I21+TTTCAAA光响应元件162-TTTCAAA光响应元件GAG-motif769-GGAGATG光响应元件的一部分SP1368-CC(G/A)CCC光响应元件372-CC(G/A)CCC光响应元件370-CC(G/A)CCC光响应元件374-CC(G/A)CCC光响应元件369-CC(G/A)CCC光响应元件373-CC(G/A)CCC光响应元件371

30、-CC(G/A)CCC光响应元件777-CC(G/A)CCC光响应元件chs-CMA2a52-TCACTTGA光响应元件的一部分1801852.3.2VvMYBPA2 基因启动子中顺式作用元件的分析和预测通过比对分析，我们发现 VvMYBPA2 基因启动子序列（991 bp）中共有 22 大类 35 种105 个潜在的顺式作用元件或顺式作用元件的部分配件，其中仅含有 4 种 8 个顺式作用元件 与光响应有关，包括 Box 4（2 个）、G-Box（2 个）、I-Box（2 个）和 TCT-motif（2 个）， 如表 5 所示13-15。其中能够单独起作用的顺式作用元件仅有 G-Box 一类，

31、表明 VvMYBPA2 基因基因受光诱导表达的能力可能较差。表 5 VvMYBPA2 基因启动子序列中涉及光响应的顺式作用元件Table. 5 The cis-acting elements related to photoresponse in the promoters seguence of VvMYBPA2元件名称位点链基本序列功能Box 4186+ATTAAT涉及光响应的保守的 DNA 单元的一部分729+ATTAAT涉及光响应的保守的 DNA 单元的一部分G-Box874+CACGTT涉及光响应的顺式作用元件36+CACATGG涉及光响应的顺式作用元件I-Box241+ATGATA

32、TGA光响应元件的一部分833-AAGATAAGA光响应元件的一部分TCT-motif200+TCTTAC光响应元件的一部分531+TCTTAC光响应元件的一部分190195然而，VvMYBPA2 基因启动子序列中转录因子和其它调节蛋白的结合位点的分布情况则与结构基因 VvLAR1、VvLAR2 和 VvANR 的启动子序列较为相似，不仅含有 MBS 和 W Box 位点，也包含涉及光响应的 MYB 结合位点 MRE（-链，490 位，AACCTAA），表明其相 应光诱导的机制可能主要依赖其它转录因子光响应的间接诱导16。较为特别的，VvMYBPA2 基因启动子序列中包含响应植物激素调节的顺式

33、作用元件较少：仅含有如涉及脱落酸响应的 ABRE 元件和涉及水杨酸响应的 TCA-element 元件（各 1 个）。由此可见，VvMYBPA2 基因精品论文的表达可能主要受到其它转录因子的调节，而对直接的光诱导和激素诱导不敏感17。2002052.3.3VvMYB5a 基因启动子中顺式作用元件的分析和预测通过比对分析，我们发现 VvMYBP5a 基因启动子序列（996 bp）中共有 36 大类 48 种103 个潜在的顺式作用元件或顺式作用元件的部分配件，其中仅含有 5 种 12 个顺式作用元 件与光响应有关，包括 Box I（1 个）、G-Box（8 个）、LAMP-element（1 个

34、）、as-2-box（1 个）和 Box II（1 个），如表 6 所示。尽管其独特的 LAMP-element 元件和 Box II 只是 光反应元件的一部分，但其 as-2-box 元件涉及短期特异表达和光响应，具有较强的作用18-19。 此外，其在 579 bp911 bp 间连续出现的 8 个具有完整功能的 G-box 元件，使其具有了较强 的光响应功能。表 6 VvMYB5a 基因启动子序列中涉及光响应的顺式作用元件Table. 6 The cis-acting elements related to photoresponse in the promoters seguence o

35、f VvMYB5a元件名称位点链基本序列功能Box I408-TTTCAAA光响应元件G-Box579+CACGTGG涉及光响应的顺式作用元件580-CACGTG涉及光响应的顺式作用元件722+CACGTC涉及光响应的顺式作用元件805-TTCCACGTGGCA涉及光响应的顺式作用元件806+GCCACGTGGA涉及光响应的顺式作用元件807-CACGTGG涉及光响应的顺式作用元件808+CACGTG涉及光响应的顺式作用元件911+CACGTC涉及光响应的顺式作用元件LAMP-element456-CCTTATCCA光响应元件的一部分as-2-box111+GATAatGATG涉及短期特异表达

36、和光响应Box II806-TCCACGTGGC光响应元件的一部分210215220此外，VvMYB5a 基因启动子序列中，不仅含有 MBS 和 W Box 位点，还含有两个CCAAT-box 元件，它们是 MYBHv1 的特异结合位点。这表明 VvMYB5a 基因的表达，除了 可以直接受作用于光响应外，还可以受到多种转录因子的调控。此外，VvMYB5a 基因启动 子序列中，包含多种响应植物激素调节的顺式作用元件：如涉及脱落酸响应的 ABRE 元件（2 个）和 ELI-box3 元件（1 个），涉及茉莉酸甲酯响应的 TGACG-motif 元件（1 个）、 涉及赤霉素响应的 P-box 元件（

37、1 个），涉及生长素响应的 TGA-element 元件（1 个）。由 此可见，VvMYB5a 基因启动子序列中几乎囊括了除水杨酸以外的所有响应元件，其表达可 能受多种激素共同作用的影响，这也是其作为转录因子而常见的现象。2.4 侵染烟草叶片和启动子活性的检测利用转染目的启动子片段重组载体的农杆菌侵染烟草叶片，适时培养和荧光素处理后分 别进行避光保存和紫外诱导，之后使用荧光成像系统拍照观察，结果如图 3 所示。由图可知， 侵染转录因子 MYB5a、MYBPA1 和 MYBPA2 启动子重组载体的叶片，在未照 UV 之前， 均可观察到清楚的荧光，表明本研究所克隆的启动子均有活性，能启动 LUC

38、基因的表达。 与之相比，采用 UV-B 照射部分的荧光略有增加，但差异均不显著，表明紫外照射可以在一 定程度上诱导启动子表达相关调节基因。225图 3 UV-B 照射对不同启动子活性影响的荧光检测分析Fig.3 Quantification analysis of LUC activity of different promoters after UV-B treatments230235240紫外光对植物类黄酮代谢的影响已在多种植物中见报道，1996 年在模式植物拟南芥上，有两个团队的科学家分别发现 UV-B、UV-A 和蓝光能通过特殊的光受体介导而引起查尔酮 合成酶（CHS）的基因表达20

39、-21。随后，利用拟南芥突变体发现，UV 主要影响类黄酮途径 中黄酮醇和羟基肉桂酸酯的合成22-23。在葡萄果实中关注 UV-B 影响的报道较多，研究发现， UV-B 和 ABA 均可促进黄酮醇和花色苷的的积累24-26，且激素与 UV 之间有协同作用，ABA 通过促进 UV 吸收物质和膜甾醇的合成及抗氧化酶活性而参与了葡萄叶片对 UV-B 的响应 26，这与我们的研究结果基本一致，即 UV 的影响并非的单一的，植物对 UV 的响应机制是 多元化的。关于紫外照射调控植物中原花色素合成的研究不多。Grotewold27等（1994）人发现在 没有 bHLH 蛋白存在的情况下，MYB 因子 P1

40、只能激活玉米中部分类黄酮合成基因的转录， 而当其与 bHLH 蛋白 R 相互作用后，MYB 因子 P1 能够激活全部的花色苷合成基因。Lavola 等28（2003）发现 UV-B 能够诱导桦树中原花色素的积累。Mellway 等29（2009）从白杨中 分离出了一个转录因子 MYB134，这个转录因子受 UV-B 诱导后能够调控和原花色素合成相 关的结构基因的表达。但最近的研究也发现30，完全滤减 UV 的葡萄果实并没有影响原花色 素的累积，分子水平也未受到影响，而完全遮避自然光处理却大大影响了它的合成，因此认 为是 UV 以外的自然光诱导了原花色素的合成，而非 UV。在西芹(Petrose

41、linum crispumcv. Hamburger Schnitt) 类黄酮路径中发现查尔酮合成酶245250255260265270275280285290(CHS)基因的启动子中有响应光的顺式作用元件31，并且在启动子序列中发现了光响应元件 ACGT(ACE)，Batschauer32等人将该启动子与报告基因相连构建载体转入不同的拟南芥突变 体中发现，只有在光敏色素存在的条件下该光响应元件才能激活报告基因的表达。因此，研 究者33认为植物是否响应某一特定波长的光刺激，还要看参与信号转导的激活子等信号物 质是否存在或是否有相应的辅助转录因子参与。本实验中采用的是瞬时表达系统，虽然这种 研究

42、方法已经被广泛应用，但也存在着一定的缺点。3结论本文通过分子生物学技术和生物信息学技术，克隆得到与酿酒葡萄原花色素生物合相关 的转录因子 VvMYBPA1、VvMYBPA2 和 VvMYB5a 的启动子序列，通过生物信息学对其潜 在功能进行预测，通过启动子重组载体侵染烟草叶片来检验其基本功能。研究发现，与原花 色素生物合成有关的这些关键结构基因的启动子相比，这些调节基因的启动子序列在潜在功 能上有着极大的不同，特别是光响应元件在种类和数量上的差别较大，且多含有其它转录因 子和不同激素信号的响应位点。而启动子活性检验则表明，这些目标序列具有启动子的基本 活性，且 UV-B 照射可以导致报告基因表

43、达量的略微增加，表明它们具备一定的响应紫外诱 导的功能。这表明：酿酒葡萄花色素生物合成相关关键调节基因 VvMYBPA1、VvMYBPA2 和 VvMYB5a 的启动子响应光信号诱导较差，但可能广泛受到其它转录因子和激素信号的影 响。致谢本课题受到高等学校博士学科点转向科研基金资助，项目号：90008110018。参考文献 (References)1 SANTOS-BUELGA C, SCALBERT A. Proanthocyanidins and tannin-like compounds - nature, occurrence, dietary intake and effects o

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