动植物检疫专业毕业论文

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1、学号：20071040113河北北方学院毕业论文 食品中微生物学质量调查分析与安全评价Analysis of Quality of Food Microbiology and Safety Evaluation姓 名： 李 强 指导教师： 王 爱 华 院 系： 动物科技学院动物医学系专 业： 动植物检疫专业 年 级： 2007级 论文提交时间：2010年06月9日16 目 录引言31 材料和方法51.1实验材料51.2食品菌群总数的测定51.2.1实验设备 51.2.2培养基及试剂 51.3 大肠菌群MPN计数 71.3.1 实验设备71.3.2 培养基及试剂 71.3.3 试验方法82试验结

2、果92.1 集贸市场食品的检测情况102.2超市食品的检测情况103讨论114结论12参考文献13致 谢15河北北方学院学士论文食品中微生物学质量调查分析与安全评价李强（河北北方学院动物科技学院动物医学系）指导教师：王爱华摘要：目的: 检测市售鲜奶、乳制品以及肉制品的微生物性污染情况，初步评定当今社会的食品安全系数。方法: 采集200份鲜奶、乳制品以及肉制品样品，经増菌后，分别采用常规培养基检验法测定菌落总数，采用GB/T 4789.32008法进行大肠菌群MPN计数，并按照国家食品安全评定标准对其符合率进行比较分析。结果：样品的检测总合格率为78.5%，其中在超市中购买的食品检测合格率（82

3、%）比在集贸市场上购买的食品检测合格率（75%）高。结论: 市售鲜奶、乳制品以及肉制品存在不同程度的细菌污染，但在超市购买比集贸市场上更加安全卫生，同时应该加强食品卫生的监督和管理，为居民群众提供安全的饮食环境。关键词：食品 微生物学 菌群总数 大肠菌群 Analysis of Quality of Food Microbiology and Safety Evaluation Liqiang(Veterinary Medicine,Colloge of Animal Science and Technology, Hebei North University ) Guide Teacher:

4、 Wang AihuaAbstract: Objective: To detect the microbial contamination of commercial milk,dairy products and meat ,and to achive the initial assessment of the food safety Coefficient in todays society. Methods: Collect 200 milk,dairy products and meat samples,Increase bacteria,the test medium were de

5、termined by conventional colony count,using GB / T 4789.3-2008 method MPN to count coliform,and in accordance with the National Food safety assessment Standard to compare their compliance rates. Results: The overall pass rate of detection is 78.5%,of which buying in the supermarket testing pass rate

6、 (82%) higher than buying on the qualified rate (75%) .Conclusion: There are different levels of bacterial contamination in the commercially available milk,dairy products and meat products,but buying in the supermarket is more health and safety than buying in the fair trade market,at the same time w

7、e should strengthen the supervision and management of food hygiene to provide the residents of a safe eating environment.Key words: Food Microbiology Total bacteria Coliform引言近年来，随着食品加工过程中化学品和新技术的广泛使用，新的食品安全问题不断涌现，一些国家和地区的食品安全恶性事件不断发生。然而，尽管现代科技已发展到了相当高的水平，但无论在发达国家还是发展中国家，食品的生物性污染仍是危害食品安全的头号杀手1，它依然严重

8、危害着人类的健康，成为当今世界各国最关注的食品卫生安全问题之一。根据世界卫生组织的估计，全球每年发生食源性疾病数十亿人2，其中大肠杆菌致病性极高3。发达国家(包括美国)发生食源性疾病的概率也相当高，平均每年有13的人群感染食源性疾病4。这表明，工业化程度的发达并不能保证食源性疾病爆发危险性的降低，反而由于工业化程度越发达，食物供应链越难控制，一旦发生食品安全问题，其影响面和波及面会更大。另一方面，由于工业化产品的规模大，不安全食品的召回、销毁所带来的经济损失也会更大5。也就是说，每年由数十亿例食源性疾病而导致的医疗费增加，以及产品的销毁可带来数十亿美元的消耗。由此可以看出，食品安全对社会、对经

9、济的影响是非常大的，在食品安全不良的条件下，儿童、孕妇、年老体弱者和免疫力低下的人群更容易感染食源性疾病，成为最主要的受害人群。所以食品安全被列为公共卫生优先领域。食品安全之所以受到广泛关注，是因为其与人群的健康、疾病以及经济发展密切相关。奶制品，肉制品为人们所喜爱，又是每天必备的营养食品，因此产生的危害也不可小视6-7。近年来，中国乳制品消费量呈逐年上升趋势，目前已成为全球第二大液态乳制品消费市场。但因乳原料污染和乳制品中丰富的蛋白质、脂肪等营养物质在生产过程中极易受到大肠菌群的污染，严重影响了人类健康，这方面的负面报道屡见不鲜8-9。而长期以来，我国熟肉制品的卫生合格率低于其他各类食品，且

10、由其引起的食物中毒发病率一直居于首位10。天然食品内部没有或仅有很少的细菌，食品中的细菌主要来源于产、储、运、制、销等各个环节的外界污染。而食品中的细菌数量对食品的卫生质量具有极大的影响。根据数据显示，食品中细菌数量越多，食品腐败变质的速度就越快，甚至可引起食用者的不良反应，有人认为细菌数量达到100-1000万个/g时食品就可能引起食用者的食物中毒，因此食品中的细菌数量对食品的卫生质量具有极大的影响，它反映了食品受微生物污染的程度。细菌数量可采用菌落总数来计数。菌落总数是指一定数量或面积的食品样品，在一定条件下进行细菌培养，使适应该条件的每一个活菌必须而且只能形成一个肉眼可见的菌落，然后进行

11、菌落计数所得的细菌数量，通常以1g或1ml样品中所含的菌落数量来表示。菌落总数是用以判定食品被细菌污染的程度，反映食品的新鲜程度和卫生状况的重要微生物指标之一。在实际运用中，不少国家，包括我国多采用菌落总数来评价食品的污染状况。食品的菌落总数越低，表明该食品被细菌污染的程度越轻，耐放时间长，食品的卫生质量较好，反之亦然。如果食品的菌落总数严重超标，说明其产品的卫生状况达不到基本的卫生要求，将会破坏食品的营养成分，加速食品的腐败变质，使食品失去食用价值。 大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化

12、及血清学方面并非完全一致，其定义为:需氧及兼性厌氧、在37能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌11。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。 大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。大肠菌群主要来源于人畜粪便，作为粪便污染指标来评价食品的卫生状况12。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小13。粪便是人类肠道排泄物

13、，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在(如沙门氏菌、志贺氏菌等)，因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。大肠菌群常作为食品被粪便污染指标来评价食品卫生质量14-15，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。 由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，即:需氧及兼性厌氧、在37能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。据介绍，菌落总数是用以判定食品被细菌污染的程度，反映食品的

14、新鲜程度和卫生状况的重要微生物指标之一。消费者食用微生物超标严重的食品，很容易患痢疾等肠道疾病，可能引起呕吐、腹泻等症状，危害人体健康。 而此课题就是重点检测人们日常生活中所接触的各类奶、乳制品以及肉制品的微生物学指标，得出其菌群总数和大肠杆菌群总数，更加直观的了解了当今食品的安全系数，最大限度的保障人们的食品安全。 1 材料和方法1.1 实验材料 在集贸市场和超市分别取鲜奶、奶粉和含奶饮料样品分别为20份、20份和10份，肉制品同样取样50份，其中包括10份肉灌肠、10份酱卤肉、10份肉干和20份火腿。所有取样均采取随机采样的取样方法， 严格以无菌方法采集样品约250 g，置于无菌铝盒，密封

15、后2 h内送实验室检测。1.2 食品菌群总数的测定1.2.1 实验设备除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：恒温培养箱：36 1 ，30 1 。冰箱：2 5 。恒温水浴箱：46 1 。天平：感量为0.1 g。均质器、振荡器。无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。无菌锥形瓶：容量250 mL、500 mL。无菌培养皿：直径90 mm。pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。放大镜或菌落计数器。1.2.2 培养基及试剂 1.2.2.1 平板计数琼脂（plate count agar，PCA）培养基成分表：胰蛋白胨 5.

16、0 g酵母浸膏 2.5 g葡萄糖 1.0 g琼 脂 15.0 g蒸馏水 1000 mLpH 7.00.2制法： 将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。分装试管或锥形瓶，121 高压灭菌15 min。1.2.2.2 磷酸盐缓冲液成分：磷酸二氢钾（KH2PO4） 34.0 g蒸馏水 500 mLpH 7.2制法：贮存液：称取34.0 g的磷酸二氢钾溶于500 mL蒸馏水中，用大约175 mL的1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH，用蒸馏水稀释至1 000 mL后贮存于冰箱。稀释液：取贮存液1.25 mL，用蒸馏水稀释至1 000 mL，分装于适宜容器中，121 高压灭菌15 min。1.2.2

17、.3 无菌生理盐水成分：氯化钠 8.5 g蒸馏水 1 000 mL制法：称取8.5氯化钠溶于1 000 mL蒸馏水中，121 高压灭菌15 min。1.2.3 试验方法 1.2.3.1以无菌操作将检样25g(mL)剪碎放于含有225mL灭菌生理盐水或其它稀释液灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做出1：10的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置均置器中以8000rmin10000rmin的速度处理1min，做出1：10的均匀稀释液。1.2.3.2用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水或其它稀释液的试管内(注意吸管尖

18、端不要触及管内稀释液)，振摇试管，混合均匀，做出1：100的稀释液。1.2.3.3另取1mL灭菌吸管，按上条操作方法，做10倍递增稀释，如此每递增稀释一次，即换用1支1mL灭菌吸管。1.2.3.4根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择2个3个适宜稀释度，分别在做10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1mL稀释液于灭菌培养皿内，每个稀释度做两个培养皿。1.2.3.5稀释液移人培养皿后，应及时将凉至46 营养琼脂培养基(可放置于46 1 水浴保温)注入培养皿约15mL，并转动培养皿使混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾人加有1mL稀释液灭菌培养皿内作空白对照。 1.2.3.6待琼脂凝

19、固后，翻转平板，置36 1 温箱内培养48h2h。1.2.3.7作平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。1.2.3.8选取菌落数在30300之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。平板内如有链状菌落生长时(菌落之间无明显界线)，若仅有一条链，可视为一个菌落；如果有不同来源的几条链，则应将每条

20、链作为一个菌落计。1.3 大肠菌群MPN计数1.3.1 实验设备同食品菌群总数测定的设备。1.3.2 培养基及试剂 1.3.2.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(lauryl sulfate tryptose，LST)肉汤成分：胰蛋白胨或胰酪胨 20.0g氯化钠 5.0g乳糖 5.0g磷酸氢二钾 2.75g磷酸二氢钾 2.75g月桂基硫酸钠 0.1g蒸馏水 1000mLpH 6.80.2制法： 将上述成分加于蒸馏水中，调节pH。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL。121 高压灭菌15 min。1.3.2.2 煌绿乳糖胆盐(brilliant green lactose bile，BGLB)肉汤成

21、分：蛋白胨 10.0g乳糖 10.0g牛胆粉溶液 200.0mL0.1%煌绿水溶液 13.3mL蒸馏水 1000mLpH 7.20.1制法：将蛋白胨、乳糖溶于约500mL蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200mL（将20.0g脱水牛胆粉溶于200mL蒸馏水中，pH7.0-7.5），用蒸馏水稀释到975mL，调节pH至7.4，再加入0.1%煌绿水溶液13.3mL，用蒸馏水补足到1000mL，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL。121 高压灭菌15 min。1.3.2.3 磷酸盐缓冲液成分和制法同1.2.2.2。1.3.2.4 无菌生理盐水成分和制法同1.2.2.3。1.3.3 试验方

22、法1.3.3.1样品的稀释定型包装样品用无菌操作开封取样，称取样品25g，放入盛有225mL的无菌生理盐水的无菌均质杯内，充分研磨制成1:10的样品均匀稀释液。液体样品用无菌吸管吸取25mL，放入盛有225mL的无菌生理盐水的无菌锥形瓶中，充分混匀，制成1:10样品均匀稀释液。用lmol/LNaOH或lmol/HCI调节样品均匀稀释液用值在6.5-7.5之间。用lml无菌吸管吸取1:10样品均匀稀释液lmL，沿管壁缓缓注入装有9mL生理盐水的无菌试管中，振摇试管，使其混合均匀，制成1:100的样品均匀稀释液。根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。1.3.3.

23、2初发酵试验每个样品选择适宜的三个连续稀释度的样品均匀稀释液，每个稀释度接种3支10mL月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤管，每管接种lmL，37下24h培养，观察倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h。记录24h和48h内产气的LST肉汤管数。未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。1.3.3.3复发酵试验用接种环从所有的24-48h内发酵产酸产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于10mL煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤管中，37下24h培养，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。1.3.3.4大肠菌群MPN的报告根据大肠菌群阳性管数，查检索MPN表，报告每克(或每毫

24、升)样品中大肠菌群的MPN值。2 试验结果按照上述试验方法对200份食品进行微生物学检测，并按照各种食品所含细菌的国家标准（见表1）进行对照，食品的总合格率为78.5%。见表2。表1 鲜奶、乳制品以及肉制品细菌学标准食品种类菌落总数（cfu/g）大肠菌群MPN/100g鲜奶50000 -奶粉5000090含奶饮料3000070肉灌肠5000030酱卤肉80000150肉干1000030火腿3000090表2 食品样品的检测结果样品来源检测数合格数合格率集贸市场1007575%超市1008282%总计20015778.5%2.1 集贸市场食品的检测情况对集贸市场上随机采购的100份样品均进行菌落

25、总数和大肠菌群检测，食品合格率为75%，其中细菌总数合格率为84%，大肠菌群合格率为82%。见表3。 表3 集贸市场食品检测结果样品类别检测数合格数合格率菌落总数大肠菌群合格数合格率合格数合格率鲜奶201680%1890%-奶粉201575%1680%1890%含奶饮料10 770%880%770%肉灌肠10660%770%880%酱卤肉10770%880%880%肉干10770%880%880%火腿201785%1995%1680%合计1007575%8484%8282%2.2 超市食品的检测情况对超市中随机采购的100份样品均进行细菌总数和大肠菌群检测，食品合格率为82%，其中细菌总数合格

26、率为92%，大肠菌群合格率为87%。见表4。 表4超市食品检测结果样品类别检测数合格数合格率菌落总数大肠菌群合格数合格率合格数合格率鲜奶201890%1995%-奶粉201785%1995%1890%含奶饮料10880%990%990%肉灌肠10770%990%880%酱卤肉10880%990%880%肉干10770%880%880%火腿201785%1995%1890%合计1008282%9292%8787%3 讨论 实验数据显示， 集贸市场食品合格率为75%，超市食品合格率为82%，总体水平都低于国家食品卫生标准，但超市里的食品相对于集贸市场上要安全的多。分析其原因，主要是超市里比较干净卫

27、生，集贸市场上的食品暴露在空气中，卫生条件差，受细菌污染可能性比较大。所以说食品监管、监测力度应该加大，并有计划地对从业人员进行卫生培训，从业人员逐步完善相应的卫生设施，取消露天作业的销售摊，做好操作卫生，防止食品的再次污染，同时消费者自我保护意识应该增强。除了实验室外的影响因素外，在实验室操作过程中也会有一些误差，主要有以下几点：3.1 采用GB/T 4789.32008法进行大肠菌群MPN计数，是国家的新标准。MPN为最大可能数(Most Probable Number)的简称。这种方法，对样品进行连续系列进行稀释，加入培养基进行培养，从规定的反应呈阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌

28、数最近似的数值16。MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。新标准与老标准相比大肠菌群的MPN从以乳糖胆盐为主要培养基的MPN法，修改为以月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤为主要培养基的MPN法。同时报告方式每100 g (mL)大肠菌群的MPN值修改为每g (mL)大肠菌群的MPN值。虽然这两个单位在同一检索表里可以换算，但要注意检样量和接种量的概念问题，接种量是往培养基内注入的稀释样液(或原液)的量，检样量是接种量中所含实际原液的量。检验方法中MPN检索表里列出的克(毫升)的含义是检样量，并非样品稀释后的克(毫升)数，许多检验员容易搞混淆。3.2 两个标准

29、都利用了乳糖发酵管进行了两次发酵试验，培养基的配制略有不同，但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义，即“在37分解乳糖产酸产气”。初发酵阳性管，不能肯定就是大肠菌群细菌，经过证实试验后，有时可能成为阴性。有数据表明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵与证实试验相差较大。因此，在实际检测工作中，证实试验是必需的。3.3 在乳糖发酵试验工作中，经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡，有时在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡，尤其在肉制品的检测时较为多见。分析如下:肉与肉制品因为不能完全溶解于水，即使经过稀释后，发酵管内仍有肉眼可见的悬浮物，这些沉淀于管底，堵住了发酵倒管的管口，影响气体进

30、入倒管中17。实验表明，大肠菌群的产气量多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。或者将倒管改进成开口不规则的倒管，管口不完整使其开口与发酵管底部有一段距离，提高了气体的收集率，使产气明显便于观察。3.4 国家标准中，需要对初发酵阳性培养物接种伊红美蓝平板分离，对典型和可疑菌落进行观察和证实试验。由于大肠菌群是一群细菌的总称，在平板大肠菌群菌落的色泽、形态等方面较大肠菌更为复杂和多样，而且与大肠菌群的检出率密切相关。国家标准方法规定伊红美蓝平板为分离

31、培养基，在该平板上，大肠菌群菌落呈黑紫色有光泽或无光泽时，检出率最高;红色、粉红色菌落检出率较低。另外，挑取菌落数与大肠菌群的检出率有密切关系，只挑取一个菌落，由于机率问题，尤其当菌落不典型时，很难避免假阴性的出现。所以一定要挑取典型菌落，如无典型菌落则应多挑几个，以免出现假阴性。4 结论当今市场上的食品都存在一定的安全隐患，需要相关部门加强监管、监督，并加强对食品生产、加工、包装、储存、运输和销售等各个环节卫生监测，教育有关人员搞好生产环境和个人卫生，最大限度地保证食品卫生安全，防止食物中毒和食源性疾病的发生。参考文献1毛露甜绍芬，曾伟，等惠城区部分市售食品的微生物学质量调查J中国卫生检验杂

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