《CRISPR系统编辑布鲁氏菌磷酸甘油酸激酶基因的初步探索》由会员分享，可在线阅读，更多相关《CRISPR系统编辑布鲁氏菌磷酸甘油酸激酶基因的初步探索（2页珍藏版）》请在装配图网上搜索。
1、CRISPF 系统编辑布鲁氏菌磷酸甘油酸激酶基因的初步探索 CRISPF 系统是来源于细菌的一种适应性免疫防御系统，目前,CRISPR 已经被 雇佣编辑真核生物和原核生物的基因组 , 并且已发展成为一种高效准确的基因编 辑系统。CRISPF 系统由 CRISPFg白和 gRNA 两部分组成,CRISPR 蛋白负责靶向切 割目标基因,gRNA 通过碱基互补配对特异指导 CRISPFg白到目标基因。 虽然该系统已经在超过 16 种的细菌中成功编辑了目标基因 ,但布鲁氏菌等 胞内寄生菌仍没有文献报道。由于布鲁氏菌感染引起的布鲁氏菌病在我国 , 特别 是北方地区流行十分严重 , 目前尚未有良好的防治措
2、施 , 其感染机制也尚未清晰。 如果能成功将 CRISPRS因编辑系统引入到布鲁氏菌，将会给布鲁氏菌疫苗 开发及相关感染机制研究提供强大的工具。因此,本课题将尝试 CRISPRS统编辑 布鲁氏菌基因的工作。 我们取得了如下相关结果。1、以布鲁氏菌表达载体 pBBR2 为骨架,成功构建 布鲁氏菌磷酸甘油酸激酶基因(PGK)的 pBBR2-cas9-gRNA1/2/3 剪切系统(A)。 同时,为克服布鲁氏菌缺乏非同源末端修复机制的缺点,将 PGKS因左右各 1000bp 的同源臂克隆到 pBBR2-cas9-gRNA1/2/3,构建了另一种 PGK 的 pBBR2-cas9-gRNA1/2/3-H
3、 编辑系统(B)。 将这两种系统电转入布鲁氏菌 S19 疫苗 株,转化含有 A 的布鲁氏菌在平板上都不能生长；转化含有 B 的布鲁氏菌在平板上 尽管有少量菌落 , 但测序检测皆为阴性。 而所有对照组(pBBR2-cas9)的转化，布鲁氏菌的生长正常。该实验表明组成 型CRISPR/cas9 系统能剪切布鲁氏菌基因组，但是不能修复剪切后的缺口。 2、由于 pBBR2-cas9-gRNA1/2 係统不能编辑布鲁氏菌基因组,我们推测一个 可能的原因是细菌来源的 cas9 脱靶效应，为排除这种可能性。我们利用高忠诚度 的组成型 CRISPR/Fncpfl 和 CRISPR/Lbcpfl 蛋白,成功构建
4、了 pBBR2-Fn/LbCpf1-crRNA剪切系统(C,D),同时，将PGK基因左右各1000bp的同源 臂克隆到 pBBR2-Fn/Lb Cpf1-crRNA, 构建了 Fn/Lbcpf1-crRNA1/2/-H(E,F) 。 将 C,D,E,F 系统分别电转入布鲁氏菌 S19 疫苗株,所有转化的布鲁氏菌在平 板上都不能生长,但是,对照组(pBBR2-Fn/LbCpf1)的转化,布鲁氏菌的生长正常。 该实验表明脱靶效应应该不是 CRISPR 不能编辑布鲁氏菌基因组的原因。 3、由于组成型 CRISPR/cas9 CRISPR/FnCpf1 和 CRISPR/LbCpf1 都不能编辑 布鲁
5、氏菌基因组,我们推测另一个可能的原因来源于 CRISPR的 cas9或 Fn/LbCpf1 表达过于持续 ,同源重组时间不充分。 为此,我们成功构建了布鲁氏菌 IPTG 诱导型 CRISPR/cas9(pBBR2-lac-cas9-gRNA1/2/3(G)及含有 PGK 同源臂的 pBBR2-lac-cas9-gRNA1/2/3-H(H)和温度诱导型 CRISPR/cas9 系统 (pBBR2-cits-cas9-gRNA2(J), 及含有 PGK同源臂的 pBBR2-cits-cas9-gRNA2-H(K) 。 将 G,H,J,K 系统分别电转入布鲁氏菌 S19 疫苗株,然后进行相关的诱导,
6、所有 转化的布鲁氏菌在平板上都不能生长 ,但是,相应的未诱导的对照组的转化 ,依然 没有布鲁氏菌生长。 该实验表明 IPTG 诱导系统，以及温敏诱导系统在布鲁氏菌中 存在泄漏 , 不能延迟 cas9、Lcpf1 和 Fncpf1 剪切的时间 , 为同源修复提供更长的 时间,从另一个角度说明在含有 gRNA 勺 CRISPF 系统中 cas9 或其相关蛋白的表达 即使微量对布鲁氏菌也存在毒性 , 不能用于编辑布鲁氏菌基因组。 综上所述,为了探究 CRISPR 系统能否成为高效的布鲁氏菌基因编辑工具,进 行了以上探索研究,成功的构建了 5 种能切割布鲁氏菌基因组的 CRISPR 系统,研 究表明传统的 all-in-one CRISPR 还不能成功编辑布鲁氏菌基因 , 如何在布鲁氏 菌中发挥 CRISPS 基因编辑功能,具体的机理机制还有待进一步的研究
CRISPR系统编辑布鲁氏菌磷酸甘油酸激酶基因的初步探索
