禽用中药抗病毒冲剂的研制与应用

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1、禽用中药抗病毒冲剂的研制与应用技 术 总 结 报 告我国养禽业虽已走向集约化生产之路，但由于种种原因家禽发病率仍居高不下，特别是鸡的新城疫、法氏囊传染、传染性支气管炎等病毒性疾病给养禽业造成很大的经济损失。市场上虽有多种治疗病毒性疾病的药物，但由于质量和使用不当，导致大量和反复用药，造成禽产品药物残留超标，从而对人类身体健康和环境造成许多不利影响。为解决这一难题，我们在祖国传统中兽医理论指导下，结合现代医学的研究方法，经过对组抗病毒制剂组方、剂型与剂量、生产工艺等的严格筛选，研制出“禽喘康颗粒冲剂”。采用鸡胚病毒抑制试验，研究并取得了“禽喘康颗粒冲剂”杀灭病毒的时间和浓度；经过临床试验及田间推

2、广试验研究了“禽喘康颗粒冲剂”对人工感染和自然发病的病毒性与细菌性疾病的防治效果；经过毒性试验研究了对家禽的毒副做作用；同时还进行了“禽喘康颗粒冲剂”的稳定性试验并起草了质量标准，取得了满意的效果。一、 “禽喘康颗粒冲剂”最佳组方和剂型、剂量筛选的研究1 、最佳组方的筛选试验：依据传统中兽医的理、法、方、药与现代中药的研究成果，结合家禽病毒性传染病的临床症状，参考众多资料，选定金银花、连翘、大青叶、板蓝根、浙贝、杏仁、黄芩、大黄、薄荷、芦根、牛旁子、桔梗、荆芥、豆豉、竹叶、甘草等10余种具有清热解毒、止咳化痰、平喘的中药材作为处方选用药。由单味、复味、多味中药各组成3个组方，共9各组方，通过人

3、工混合感染传染性支气管炎和鸡副嗜血杆菌的疗效对比试验，分两步进行最佳组方的筛选试验。第一步从9个组方中筛选出3个组方，第二步再从第一步筛选出的3个组方中筛选出1个最佳组方，作为“禽喘康颗粒冲剂”的定型方：金银花30g 大青叶30g 杏仁20g 板蓝根30g 桔梗30g 浙贝20g 黄芩20g 连翘30g 甘草10g（见表1、表2）。表1：组方初步筛选结果组别1组2组3组4组5组6组7组8组9组空白组试验数（只）30303030303030303030发病数（只）16151614151716151716发病率（%）53.350.053.346.750.056.753.350.056.753.3死

4、亡数（只）1091088866513死亡率（%）33.330.033.326.726.726.7202016.743.3存活数（只）20212022222224242517存活率（%）66.770.066.773.773.773.780.080.083.356.7显效时间（天）77765544314症状消失时间（天）12131410111077721表2、不同方剂的疗效对比组 别 7 组8 组9 组空白组试验数（只）30303030发病数（只）13141314发病率（%）433467433467存活数（只）24252718死亡数（只）65312死亡率（%）20.0167100400存活率（%）

5、80.083.390.060.0显效时间（天）53310症状消失时间（天）765202、 最佳剂型的筛选由于剂型严重影响药物的疗效，我们将组方制成散剂、汤剂、冲剂三种剂型，通过鸡人工感染传染性支气管炎的疗效对比试验对剂型进行筛选。试验结果表明，汤剂与冲剂的治疗速度疗效显著优于散剂组，汤剂与冲剂差异不明显，但颗粒冲剂具有使用、运输、储存方便等优点，最后定型为颗粒冲剂。详见下表。 组 别散剂组汤剂组颗粒剂组空白对照组试验数（只）30303030发病数（只）13141314发病率（%）433467433467存活数（只）25282818死亡数（只）53312死亡率（%）167100100400存活率

6、（%）83.393.393.360.0显效时间（天）533症状消失时间（天）1066203、 剂量筛选试验 通过对鸡人工混合感染鸡副嗜血杆菌和传染性支气管炎病毒的疗效观察，筛选出该制剂的最佳剂量为治疗量为0.5%预防量减半，连续使用57天为一疗程。 表、制剂治疗IBV和鸡副嗜血杆菌混合感染临床试验结果组别试验数(只)发病数(只)康复数(只)死亡数(只)治愈率(%)发病率(%)死亡率(%)1302301311284.643.36.73301210280.040.06.7430148657.146.720.0530139469.243.313.36300007302012866.726.7二、禽喘

7、康颗粒冲剂鸡胚内病毒抑制试验我们采用鸡胚法，经过预试验、作用时间梯度与作用浓度梯度试验，研究了禽喘康颗粒冲剂在鸡胚上对NDV（Lasota）、 IBV（M41）的抑制或杀灭效果与体外作用时间、药物浓度的关系；抑制或杀灭病毒的最大浓度与最短作用时间。试验结果表明： “禽喘康颗粒冲剂”直接与相应病毒作用10min对含100EID50 的NDV的保护率为100%，对NDV具有较强的杀灭作用，金刚烷胺无保护；对M41(1:10)的保护率为87.5%，对M41(1:100)的NDV的保护率为100%；而西药病毒灵对M41(1:10、1:100) 无保护。若将原液稀释100倍NDV（Lasota）仍然有杀

8、灭作用。同时表明“禽喘康颗粒冲剂”对NDV的抑制作用优于西药病毒灵和金刚烷胺。表1 NDV作用时间梯度试验组 别血 凝 价NDV病毒对照1011111111111010101111NDV病毒+药物+终止液(10min)00000000000NDV病毒+药物+终止液(20min)00000000000NDV病毒+药物+终止液(30min)00000000000NDV病毒+药物+终止液(40min)00000000000NDV病毒+药物+终止液(50min)00000000000NDV病毒+药物+终止液(60min)00000000000表2 NDV作用浓度梯度试验之一固定药物稀释病毒组 别血 凝

9、 价10-1中药9 10101081010101010-2中药99810997810-3中药09900970010-4中药00000000010-5中药0000000010-6中药000000000病毒对照（10-6）9910998109109中药对照00000000010-3病毒灵997910-4病毒灵99910表3 NDV作用浓度梯度试验之二固定病毒稀释药物组 别血 凝 价原液病毒00000000010-1病毒756688787810-2病毒6797788510-3病毒77888878810-4病毒9858997910-5病毒7599981010910-6病毒10991099101010硫

10、代硫酸钠0000000000表4 IBV作用时间梯度试验（枚、h、%）项 目组 别孵化时间接种胚数侏儒胚数蜷缩胚数肾脏尿酸盐沉积胚数正常胚数感染率保护率M41病毒+药物+终止液(10min)168111101001000M41病毒+药物+终止液(20min)168112918.1881.82M41病毒+药物+终止液(30min)168113827.2772.73M41病毒+药物+终止液(40min)168112918.1881.82M41病毒+药物+终止液(50min)168112918.1881.82M41病毒+药物+终止液(60min)168112918.1881.82M41病毒+终止液1

11、68112918.1881.82药物对照16811110100盐水对照16811110100空白对照1681100100备注：药物1禽喘康颗粒冲剂，药物2病毒灵表5 IBV作用浓度梯度试验（枚、h、%）项目名称 孵化时间接种胚数侏儒胚数蜷缩胚数肾脏尿酸盐沉积胚数正常胚数感染率保护率M41168102080100%0M41+药物1+终止液1688103450%50%M41（1：10）+药物1+终止液1688100712.5%87.5%M41（1：100）+药物1+终止液168800080100%M41（1：10）+药物2+终止液1681002801000M41（1：100）+药物2+终止液168

12、101180100 0药物1对照168800080100%药物2对照168800080100%盐水对照168600060100%空白对照168600060100%备注：药物1禽喘康颗粒冲剂，药物2病毒灵三、禽喘康颗粒冲剂生产工艺的研究 1、配方：金银花30g 连翘30g 大青叶 30g 板蓝根30g 桔梗30g 浙贝20g 杏仁20g 黄芩 20g 甘草10g。 2、工艺流程： 原料药筛选 配料称量 有效成分分类提取 粗品合并 清膏（1.38） 精确配制 化验 制粒 过筛 干燥 检验 分装。四、“禽喘康颗粒冲剂”的急性毒性试验一般认为中药经过特殊的加工、炮制与制剂加工等环节，可减轻、降低或消除

13、其毒害作用，但研究证明加工后的中药制剂仍具有一定的毒副作用，只是相对化学类药物而言毒副作用较低而已。为科学评价“禽喘康颗粒冲剂” 治疗家禽疾病时的毒副作用，我们用昆明鼠对其进行了急性毒性试验。经最大耐受量试验，给小鼠的灌胃禽喘康颗粒冲剂总剂量达到85ml/kg，相当于成年鸡日用量的400倍，仍未见死亡和明显的中毒症状。证明该药基本无毒副作用。五、临床疗效试验家禽疾病，特别是由新成疫、传染性支气管炎病毒等引起的的呼吸道病，是近年来给养禽业造成严重损失的病害之一。“禽喘康颗粒冲剂”是本课题组研制的纯中药制剂，该药的主要成分为大青叶 、板蓝根、黄芩、桔梗等，用于治疗家禽呼吸道疾病。我们对该药进行了非

14、免疫鸡人工感染鸡新城疫病毒（F48E8株）、混合感染鸡副嗜血杆菌（N株）和传染性支气管炎病毒（M41株）的临床效果观察、对感染法氏囊病毒（D78）雏鸡的免疫器官病理学的影响试验及免疫调节作用试验。1、“禽喘康颗粒冲剂”对鸡人工感染新城疫病毒疗效果的试验1.1发病及防治效果 1、2组较3、4、5、6组推迟48h出现症状，防治率分别为 90.0 %和 93.7%，3、4组治愈率分别为80.0%和75.0%。5组治愈率为73.3%。均显著高于对照组（p0.01）。见表1表：“禽喘康颗粒冲剂”对鸡人工感染ND防治效果组别出现症状时间（h）发病率（%）病情出现死亡时间（d）死亡数（只）死亡率（%）防治率

15、（%）0.5%预防组（1）72100较轻4310.090.00.7%预防组（2）72100轻微426.793.70.75%治疗组（3）24100较轻3516.783.71.0%治疗组（4）24100较轻3620.080.0LaSota紧接组（5）24100较重3826.773.3空白对照组（6）24100严重33010.002.2治愈情况 用药组和紧急接种组与对照组比较，能迅速减轻临床症状而治愈病鸡，治愈率和有效率显著高于对照组（p0.01），用药5天内各组的病鸡的痊愈、显效、死亡、无效情况见表2。2.3剖检特征 攻毒后连续观察7天后全部扑杀，1、2、3、4、5组剖检可见腺胃乳头、肌胃角质层下

16、、盲肠扁桃体、泄殖腔等症状都较轻或轻微症状，对照组症状很明显，见表3。2.3 治疗组用药量虽大，但保护率不如预防组，这主要是受试鸡在出现症状后，随饮水量的减少或废绝，摄取的药量也随之减少甚至终止有关，同时也正说明该药确实具有杀灭NDV的作用。本次试验与前期的抗NDV鸡胚人工攻毒试验的结果表现一致，进一步证实了该药对NDV具有很强的抑杀作用。表：“禽喘康颗粒冲剂”对鸡人工感染ND防治效果组别有效数（只）治愈数（只）无效数（只）治愈率（）有效率（）死亡率（）2727390.090.010.02828293.793.76.725201080.083.716.724181275.080.020.022

17、151568.273.326.7003000100 包括死亡数表：典型病变等级界定值组别病情轻轻微较轻较轻较重严重打分指标2.80.122.50.154.50.204.30.186.10.317.002、鸡人工混合感染鸡副嗜血杆菌和传染性支气管炎病毒的疗效观察2.1 禽喘康预防组的保护率为93.3%，极显著高于感染不治疗组（46.4%），说明该药对传染性支气管炎有较好的预防效果。适于治疗由IBV和鸡副嗜血杆菌引起的慢性呼吸道病。2.2 禽喘康治疗组的治愈率分别为84.6%、83.3%、78.6%，比鸡清瘟散组高15.4、14.1、9.4个百分点，均具显著差异。2.3攻毒60小时后，攻毒对照组开

18、始发病，表现为张口呼吸，并伴有罗音和打喷嚏流眼泪等症状，96小时出现死亡。剖检病死鸡只，可见病鸡颜面肿胀，鼻腔有粘液性分泌物，眼结膜发炎水肿；气管有粘液性渗出物，气囊浑浊。各用药组于用药48小时后症状开始缓解，6天后症状基本消失。试验用药组发病率明显低于攻毒对照组（P0.01）。临床治疗试验结果组别试验数(只)发病数(只)死亡数(只)治愈率（保护率）(%)致死率(%)0.5%预防组（1）302193.3500.7%预防组（2）3013284.616.40.75%治疗组（3）3012283.316.71.0%治疗组（4）3014378.642.9LaSota紧接种组（5）3013469.230.

19、8空白对照组（6）30281346.4730-3、中草药“禽喘康颗粒冲剂”防治鸡肾型传染性支气管炎的探讨采用中草药“禽喘康颗粒冲剂”对鸡传染性支气管炎进行试验，结果表明：中药预防（I、II）组的发病率分别比攻毒对照组低46.14%和50.06%；中药预防组和攻毒对照组差异极显著(P0.01)；中药治疗（I、II）组的死亡率比攻毒对照组低82.66% 和86.96%，且差异极显著(P0.01)；治愈率均达80%以上。（详见表1、表2）表1：不同攻毒剂量致鸡IB发病及死亡情况攻毒剂量 发病数（只） 死亡数（只） 发病率（%） 死亡率（%）0.1ml/只组 2 1 40 200.2ml/只组 4 3

20、 80 600.3ml/只组 5 4 100 800.4ml/只组 5 4 100 80 表2： “禽喘康颗粒冲剂”对IB的防治试验 组别发病（死亡）/鸡数（只）发病率(%)死亡率(%)有效率(%)治愈率(%)保护率(%)预防14（3）/3046.7109086.390预防13（2）/3043.36.793.389.794治疗20（4）/3066.713.386.781.378.7治疗18（3）/30601090.84.784.3攻毒对照组26（23）/3086.776.7空白对照组0004、禽喘康冲剂免疫增强功效的研究为进一步验证其免疫增强功效，我们选用30日龄非免疫公鸡用左旋咪唑做对照，鸡

21、新城疫低毒力活疫苗（ Lasota株）2羽份免疫前，0.5%饮水3天，于免疫0、7、14、21d翅静脉无菌采血,分离血清,低温冰箱保存,测定鸡新城疫抗体和免疫球蛋白(IgG)。 21d时静脉采血涂片，酯酶染色法测定T细胞总数， 同时捕杀后采用器官重量法进行免疫器官(法氏囊、胸腺和脾脏)指数的测定，试验数据采用SPSS软件进行统计分析。4.1 鸡新城疫抗体效价测定：试验组、药物对照组新城疫抗体效价于空白对照组差异不显著，说明禽喘康冲剂对肌体的体液免疫的影响不大，这与早期杀灭病毒，减少抗原刺激有关。见表1 表1禽喘康冲剂对的影响组别试验数效价（Log2）/d07142128试验组1004.40.4

22、87.880.916.50.86.130.69药物对照组1004.50.737.331.07.210.915.830.83空白对照组1005.00.288.50.837.71.16.750.38 4.2 淋巴细胞转化试验：试验组与左旋米唑组均能显著提高淋巴细胞转化率，增强细胞免疫功能，提高抗病能力。见表2表2 禽喘康冲剂对鸡T细胞总数的影响(OD570nm的光吸值)组别重复1重复2重复3重复4Xsd试验组0.1140.1370.1330.1200.1260.01药物对照组0.1340.1490.1490.1360.1420.01空白对照组0.0330.0340.0360.0350.03450.

23、0014.3 免疫器官指数的测定4.3.1 试验组法氏囊指数低于空白对照组，而脾脏指数与胸腺指数均高于空白对照组，者与上述结论是一致的。既具有较强的细胞免疫增强功能，对NDV病毒具有较强的杀灭作用，故体液免疫器官法氏囊指数低于空白对照组，体液免疫增强作用不明显。4.3.2药物对照组免疫器官指数均低于空白组，者可能与临床用两有关，有待进一步研究。表3 禽喘康冲剂对鸡免疫器官指数的影响组别法氏囊指数脾脏指数胸腺指数试验组2.830.802.630.493.350.78药物对照组2.360.781.240.401.620.39空白对照组3.370.572.210.443.070.525、 禽喘康冲剂

24、对感染法氏囊病毒（IBDV）雏鸡的免疫器官病理学的影响选用15日龄海兰白公雏人工感染IBDV（D78），以观察“禽喘康颗粒冲剂”对这些免疫器官组织学变化的影响探讨该药防治家禽传染病的作用机理。5.1 法氏囊 显微镜下观察法氏囊粘膜下及间质呈不同程度的水肿、出血和异嗜性粒细胞浸润，严重的见黏膜下水肿可波及到泄殖腔，实质的淋巴细胞变形坏死。有的被网状细胞取代，坏死严重的呈囊腔状，萎缩的法氏囊淋巴滤泡体积缩小，治疗组和预防组大量的淋巴滤泡（淋巴小结）存在于固有膜中，沿着上皮密集排列，并可见上皮索深入淋巴滤泡。淋巴滤泡可分为皮质和髓质两部分，髓质在滤泡中央，由上皮细胞和较大的淋巴细胞组成。5.2 胸腺

25、：治疗组和预防组，每个胸腺叶的外周由染色较深的皮层和中央染色较浅的髓质构成，无论皮质和髓质的面积均大于对照组，淋巴细胞较密集。5.3脾脏：治疗组和预防组，淋巴细胞、浆细胞和巨噬细胞的数目和体积均多于和大于对照组，脾小体多而明显，动脉周围淋巴组织鞘丰富，脾索淋巴细胞密集。5.4“禽喘康颗粒冲剂”可以减弱IBDV对雏鸡免疫器官的损害，具有明显的免疫保护作用。六、田间推广试验为进一步验证中药“禽喘康颗粒冲剂”对自然发病鸡的疗效，我们从山东聊城、荷泽、潍坊等地蛋鸡和肉鸡的病鸡户中，选择经过临床初诊和试验室确诊为新城疫、传染性支气管炎、传染性鼻炎、慢性呼吸道病（败血性支原体）的鸡群，进行了田间试验。分别

26、用金刚烷胺、病毒灵、复方泰灭净（磺胺间甲氧嘧啶）、慢呼速停作为对照药物。1 、“禽喘康颗粒冲剂”对蛋鸡、肉鸡ND的有效率分别达98.7%、96.0%、，较金刚烷胺组高1.5、3.7个百分点；死亡率为降低1.5、3.7个百分点；产蛋鸡用药3天后产蛋率开始回升，第5天较病初提高4.9个百分点，而对照组5天后产蛋率反而降低1.8个百分点。见表1。表1 对ND的治疗效果组别发病数（只）用药5天死 亡 数（只）死亡率（%）有效数（只）有效率（%）1d2d3d4d5d合计禽喘康组肉鸡142724201120574.0137096.0蛋鸡23101510220291.3228198.7产蛋率72.973.0

27、78.781.687.8金刚烷胺组肉鸡142726262520131107.7131792.3蛋鸡2310161515108642.8224697.2产蛋率74.075.776.771.972.2注:黑体字为产蛋率2、对肉鸡IB的有效率为98.1%，较病毒灵组高2.7个百分点。死亡率为降低1.5、3.7个百分点。表2对肉鸡IB的治疗效果组别 日龄发病数量（只）用药5天死亡数（只）死亡率（%）有效数（只）有效率（%）1d2d3d4d5d合计禽喘康组3518901616310361.9185498.1病毒灵组3518901420331810874.6180395.43、对肉鸡CRD的有效率达93.

28、5%，较复方泰灭净组高3.9个百分点，死亡率为降低4.1个百分点；对IC蛋鸡用药5天产蛋率用药后提高3.1个百分点，而复方泰灭净组慢用药5天后产蛋率仍降低13.7个百分点,呼速停组用药5天后产蛋率仍降低4.9个百分点。见表3表3 禽喘康对IC、CRD的田间治疗效果组别品种日龄d病名数量只投药前后死亡数或产蛋率（只、%）投药前3d投药后5d12312345合计死亡率有效率禽喘康组肉30CRD2310152730352611511496.593.5蛋200IC320087.481.174.073.977.083.786.690.5+3.1复方泰灭净肉25CRD1690132326272825231

29、017510.489.6蛋302IC632375.974.070.766.467.867.656.962.2-13.7慢呼速停肉21CRD260018233840453120122278.791.3蛋210IC307584.982.0808079.08.080.80.0-4.9注:黑体字为产蛋率4、 用“抗病毒冲剂”治疗总的经济效益大约提高10-20%。七、稳定性试验本品为纯中药制剂，为进一步检验其稳定性，我们按新兽药审批办法的规定，用留样观察法，将三批“禽喘康颗粒冲剂”放置于室温条件下观察其外观性状、ph值、相对密度、容解性等方面的变化。结果表明“禽喘康颗粒冲剂”的质量是稳定的，说明其制备工艺是合理的，所生产的产品质量是稳定的，拟定的质量标准是可行的，故“禽喘康颗粒冲剂”的研制工作是成功的，可以投入大生产。八、质量标准草案及起草说明依据中华人民共和国兽药典1990年版二部与中华人民共和国药典1995年版一部的有关规定，制定了“禽喘康颗粒冲剂”的处方、制法、性状、鉴别、检查、功能与主治、用法和用量、储藏等方面的质量标准。