572.菌核侧耳—花椰菜抗辐射发酵饮料研制

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1、 毕 业 设 计 （论文）题 目 :菌核侧耳花椰菜抗辐射发酵饮料研制英文题目:Development of anti-radiation Fermentation Beverage by using Pleurotus Tuber-regium(Fr.) Sing- Brassica oleracea学生姓名: 学 号: 指导老师: 职 称: 副教授专 业: 生物科学二 零 零 九 年 六 月 十 日Graduation project (paper)Title: Development of anti-radiation Fermentation Beverage by using fleu

2、rotus Tuber-regium(Fr.) Sing- Brassica oleracea Name : Number : Instructor: Title:AssistantprofesMajor: BioscienceOn June 10，2009摘 要随着科学技术和人们生活的现代化，人们越来越多的接触射线，电脑、手机、电视机、微波炉、空调以及医疗设备等。因此，开发抗辐射保健饮料，越来越受到人们的极大关注。基于此，本课题以富含抗辐射物质芥子碱的花椰菜和富含抗辐射物质多糖的菌核侧耳为研究对象，探索有效途径将两者有机的组合在一起，开发新型抗辐射保健饮料。首先以1000ml培养基内加108

3、0g新鲜花椰菜进行单因子考察（每10g 一个因子），得出最佳发酵条件下所需的花椰菜量，然后进行正交实验进行饮料口味的调配，接着进行基本营养成分和抗辐射物质含量的测定，最后以果蝇进行饮料抗辐射功能的检测。结果表明：单因素考虑，1000ML培养基内加50g新鲜花椰菜发酵液能得到最多芥子碱和最大生物量。正交实验结果表明以两倍的水稀释后的100ml发酵饮料中加入0.15g柠檬酸、0.04g苹果酸、7g白砂糖、0.04g蛋白糖、0.10g果胶和0.2gCMCT调味料后口感最好，入口甘甜，回味不绝。100ml液体发酵培养基中含有总糖2g、蛋白质7g、脂类0.45g、维生素C 4.4mg、黄酮0.01143

4、g、芥子碱0.0192g，调配好的100ml发酵饮料含有总糖0.1718g、蛋白质6.56g、脂类0.97g、维生素C 1mg、黄酮0.0107g、芥子碱0.01896g，各种营养成分丰富,且主要的抗辐射有效成分得到了保留。发酵饮料对经紫外辐射后的果蝇具有较好的辐射保护作用，喂养饮料的果蝇，繁殖率上升了10.84%，雌雄性别比下降了9.38%，生长周期有所恢复，突变率下降了19.44%。试验结果表明，发酵饮料是具有较强的辐射保护作用。本课题初步完成了抗辐射饮料的设计与研究，饮料既保留原料抗辐射物质及其他营养成分，又能去除大豆腥味，花椰菜的生味，并具有菌核侧耳发酵后的香味及好的口感，是一种价格低

5、廉的具有抗辐射效果的发酵饮料。关键字: 花椰菜； 菌核侧耳； 抗辐射； 饮料； 芥子碱ABSTRACTAs science and peoples lives modernized , more and more people contact with rays, computers, mobile phones, television sets, microwave ovens, air conditioners and medical equipments. Therefore, the development of anti-radiation health drinks gets mo

6、re and more concern. Based on this, this thesis is to research the cauliflower with rich anti-radiation material and sclerotia of Pleurotus with polysaccharide-rich substance radiation study to explore an effective way to combine these and develop a new anti-radiation health drink.First ,1000ml add

7、the medium 10-80g fresh broccoli single factor study (per 10g a factor), obtained under the best conditions of fermentation volume required for cauliflower, and then drink tastes Orthogonal experiment of the deployment, followed by basic nutrient composition and anti-radiation material and the deter

8、mination to fly for the last drink of the detection of anti-radiation features. The results showed that: a single factor, 1000ML added medium cauliflower 50g fresh fermentation broth can be the most sinapine and the largest biomass. Orthogonal experimental results show that twice as much water to th

9、e 100ml diluted fermented beverages by adding 0.15g of citric acid, 0.04g malic acid, 7g sugar, 0.04g protein, sugar, 0.10g pectin and seasonings 0.2gCMCT taste best after entrance sweet aftertaste never. 100ml liquid fermentation medium containing total sugar 2g, Protein 7g, fat 0.45g, Vitamin C 4.

10、4mg, flavonoids 0.01143g, sinapine 0.0192g, the deployment of good drinks containing 100ml total sugar fermentation 0.1718g, protein 6.56g, lipid Class 0.97g, Vitamin C 1mg, flavonoids 0.0107g, sinapine 0.01896g, a variety of nutrient-rich, and the main active ingredient of anti-radiation have been

11、retained. Fermented beverages by the ultraviolet radiation of the Drosophila radiation has a good protective effect of fruit fly feeding beverages, an increase of reproductive rate 10.84%, male and female sex ratio dropped by 9.38%, the growth cycle has been restored, a decrease of mutation rate 19.

12、44%.The results show that the fermented beverage has strong protective function of radiation. This thesis has completed the preliminary design and study of radiation, the beverage not only retains the anti-radiation material and other nutrients, but also removes the smell of soybean, the fresh smell

13、 of cauliflower. Whats more, it contains fermented flavor and good taste of sclerotia of Pleurotus, is a low-cost of fermented beverages with anti-radiation effect.Keyword: cauliflower; sclerotia of Pleurotus; anti-radiation; beverages; sinapine目 录摘 要IABSTRACTII绪论11.1. 花椰菜的形态特征以及研究进展.11.1.1 花椰菜的生物学特

14、征11.1.2花椰菜的有效化学成分21.1.3 花椰菜有效成分的药理作用21.2、菌核侧耳的形态特征以及研究进展41.2.1 菌核侧耳的生物学特征41.2.2 菌核侧耳的有效化学成分51.2.3 菌核侧耳有效成分的药理作用51.3、本课题研究的目的和意义62. 实验部分72.1 仪器与试剂72.1.1 仪器72.1.2 试剂与材料72.2 实验方法与步骤82.2.1发酵饮料芥子碱含量的检测82.2.1.1测定波长的选择82.2.1.2 标准曲线的绘制92.2.1.3 发酵饮料中芥子碱的测定92.2.2 最佳发酵条件的确定92.2.3 发酵原液的处理92.2.4 饮料口味的调配102.2.5 灌

15、装，杀菌及检测102.2.6 营养成分的测定102.2.6.1 发酵培养基营养成分的测定.102.2.6.2 发酵饮料营养成分的测定.132.2.7 饮料的紫外辐射保护133 结果与分析153.1 花椰菜芥子碱含量的确定153.1.1 花椰菜芥子碱波长的确定153.1.2 标准曲线的绘制153.1.3 热醇回流单因素对芥子碱含量影响与结果分析153.1.4正交实验考虑花椰菜芥子碱提取最优的工艺的结果与分析153.2 最佳发酵条件的确定163.2.1花椰菜单因素实验163.2.2 口味的调配173.3 营养成分的测定183.3.1 发酵培养基营养成分的测定.183.3.2 发酵饮料营养成分的测定

16、.193.4 饮料的紫外辐射保护203.5 讨论20研究展望22致 谢23参考文献24东华理工大学毕业设计（论文） 绪论绪 论 花椰菜，拉丁文学名：Brassica oleracea，英文名：cauliflower，又名菜花、花菜、椰菜花，是十字花科芸苔属甘蓝种的一个变种。花椰菜食用器官为花球，具有较高的营养价值，除含有钙、磷、钾等矿质营养外，还含有蛋白质、碳水化合物、多种维生素、多种生物碱类、黄酮类化合物、硫代葡萄糖苷等1。人类流行病学研究结果表明：经常摄食十字花科植物如花椰菜、芥菜、包菜等可以防止直肠癌、胃癌、乳腺癌、防止心血管病、高血压、糖尿病、防止衰老、防止眼睛失明、提升解毒能力、提高

17、免疫力、抗辐射等。特别是其中含有的芥子碱，具有显著辐射保护作用，还具有抗氧化、抗衰老、抗雄性激素、抗炎、抗腹泻等作用。因此，学者们越来越关注十字花科植物，研究其药用价值，抗辐射能力等。菌核侧耳，拉丁文学名：Pleurotus tuber - regium ( Fr. ) Sing，又名虎奶菌、核耳菇、茯苓侧耳、南洋侧耳(日本)，是担子菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属的一种大型珍稀真菌，子实体单生或丛生。该菌子实体及菌核富含蛋白质、矿质元素、多种维生素等，味道鲜美，干品具独特香味，具有较高的食药用价值。据本草纲目、千金要方等有关典籍记载 ,它具有治疗胃病、感冒、哮喘、高血压等疾病的药效。现代科学研究

18、表明，它富含的虎奶多糖，具有增强人体免疫能力，补血生津，抑制多种肿瘤生长等功效。该菌子实体及菌核人药有治疗胃病、哮喘、高血压、便秘、发烧、感冒、水肿、脑病、疗疮、神经系统疾病等功效2。1.1 花椰菜的形态特征以及研究进展1.1.1 花椰菜的生物学特征 图1 花椰菜 图2 花椰菜 图3 花椰菜花椰菜属于绿体春化作物，植株长到一定大小才能感受低温通过春化阶段。一般早熟品种茎粗56毫米，展开叶67片；中熟品种茎粗78毫米，展开叶1112片；晚熟品种茎粗10毫米，展开叶15片，即能感应低温，进行花芽分化。花椰菜喜冷凉温和的气候条件，属半耐寒蔬菜，忌炎热干旱，也不耐霜冻，对外界环境条件的要求与结球甘蓝相

19、似，但它的耐寒、耐热能力均不如结球甘蓝，是甘蓝类蔬菜中对温度要求较为严格的一种蔬菜，其营养生长适温为1824。花椰菜属长日照作物，对光照要求不严，但花球在日光直射下，花球颜色由白变成浅黄色，进而变成绿紫色。 花椰菜根系较浅，多分布在距地表20厘米之内，植株叶丛大，蒸发量多，因此花椰菜不耐干旱，喜湿润的环境条件，同时它又是耐涝能力比较差的蔬菜1。 花椰菜在我国各地均有栽培，主要分布在海河流域、黄河流域、长江流域和东南沿海地区；甘肃、陕西、河北、辽宁、山东、河南、湖北、云南、安徽、浙江、上海、福建、广东等地是花椰菜的主栽地。其中，华北、东北和西北地区可以利用平原和高原寒冷气候实现从每年4月到11月

20、花椰菜连续生产；长江中下游地区可以在每年10月到第2年4月连续生产；云贵高原地区则可以利用多样性的小气候实现周年生产，但主要的生产季节在每年的11月到第2年4月，以昆明周围栽培为主；广东、福建等东南沿海地区每年11月到第2年3月是花椰菜生产的最好季节1。1.1.2 花椰菜的有效化学成分花椰菜营养丰富，水分92.4%，蛋白质2.1%，脂肪0.2%，碳水化合物4.6%，膳食纤维1.2%，灰分0.7%，维生素A 0.005%，胡萝卜素0.03%，维生素C0.061%，钙0.023%，磷0.047%，钾0.2%，钠0.0316%，镁0.018%，谷氨酸0.315%，芳香族氨基酸0.129%，天冬氨酸0

21、.215%，亮氨酸0.112%，赖氨酸0.114%，缬氨酸0.115%，丙氨酸0.135%，异亮氨酸0.077%，苏氨酸0.084%，苯丙氨酸0.073%，丝氨酸0.104%3。1.1.3 花椰菜有效成分的药理作用1.1.3.1 增强免疫力美国加利福尼亚大学科研人员的一项新研究发现4，花椰菜和甘蓝菜这些十字花科蔬菜在被咀嚼和消化时，能够产生出一种叫做DIM的化合物。研究证明DIM确能阻止某些癌细胞的生长，可能有助于提升免疫力。以往的研究已经证明,DIM可以阻止乳腺癌细胞的分裂，抑制睾丸素即前列腺癌细胞生长所需的雄性激素。为了检验DIM所具有的抗病毒性能，科研人员让试验鼠感染上呼肠弧病毒，这种病

22、毒生存于肠内，但对生命没有威胁，DIM试剂可以更高效地把病毒从鼠的肠内清除掉。这就是说，DIM可以通过抑制病毒扩散的方式来增强身体自身防御的能力。为了达到对免疫反应的效果，DIM必须口服而不能注射，因为以注射代替口服，会发生化合物代谢的改变。科研人员指出，DIM的效应开启了抗御癌症的全新领域。DIM正由科研人员在美国政府资助的临床试验中进行试验，以作为治疗前列腺癌和子宫癌的治疗手段。1.1.3.2有助降低患皮肤癌风险 美国科学家近日研究发现5，花椰菜的一种提取物能帮助人体预防太阳紫外线伤害，从而降低患皮肤癌的风险。之前的研究表明：花椰菜中含有的异硫氰酸盐(Sulforaphane)能帮助减少紫

23、外线照射造成的炎症。最新的研究表明：美国约翰霍普金斯大学的药理学家PaulTalalay和同事让6个志愿者背部接受不同量的紫外线照射，其中有些志愿者使用花椰菜提取物作为防护，另一些则没有.结果发现，如果在紫外线照射前3日每天都使用花椰菜提取物，在照射后，细胞损伤平均会下降37%。Talalay说，这表明花椰菜中的异硫氰酸盐能够帮助细胞抵御伤害，所以含有异硫氰酸盐成分的药膏能够降低因紫外线照射而患皮肤癌的风险。1.1.3.3 防癌抗癌研究表明6：花椰菜中含有的硫代胡萝卜素能促使人体细胞产生具有保护作用的酶，从而抵制人类生存环境中的致癌物质，而含有的吲哚类化合物则具有强烈的酶诱导作用，可使芳香烃化

24、合酶活性提高54倍，使小肠黏膜中此酶的活性提高30倍，故能对苯丙吡等致癌物质有分解作用，能防癌抗癌作用；同时7黄酮类物质可诱导芳烃化酶提高活性,产生抗癌防癌功效。一般可通过三种途径: 对抗自由基；直接抑制癌细胞生长； 对抗致癌促癌因子，直接抑制癌细胞生长，抗致癌因子。黄酮类物质能产生抗癌作用的生物活性包括对酪氨酸激酶的抑制作用、类激素作用、抗增生效应、抗扩散效应、抗氧化作用和免疫功能等。致癌因子使体内产生自由基，并以自由基的形式富集于脂质细胞膜的周围，引起脂质过氧化。破坏细胞的DNA 而致癌，类黄酮是自由基猝灭剂和抗氧化剂，能有效地阻止脂质过氧化引起的细胞破坏，起到抗癌防癌的作用。并且类黄酮还

25、有抑制肿瘤细胞糖酵解、生长、线粒体琥珀酸氧化酶活性和磷脂酰肌醇激酶活性的功能起到抗癌防癌的作用,尤其是槲皮素能有效地诱导微粒体芳烃羟化酶、环氧化物水解酶,使多环芳烃和苯并芘等致癌物通过羟化、水解失去致癌活性。同时其含有的维生素C和胡萝卜素和硒元素均能阻止癌细胞的形成和发展。所以经常食用花椰菜可明显减少直肠癌，胃癌，乳腺癌的发生。1.1.3.4 提升解毒能力研究表明8，人体中肝脏的解毒机制有两道解毒程序：分别称为第一道解毒程序和第二道解毒程序。此系统主要由细胞色素P450酶组成，在解毒过程中扮演着一个氧化与分解毒素的角色，但经第一道解毒程序活化后的毒素有可能比原来的分子更具毒性，因此需借由第二道

26、解毒程序来去除。第二道解毒程序酶系统的功用即是发挥解毒作用，增加这些分子的水溶性或使这些分子失去活性，中和毒素分子对细胞、DNA的伤害。被第一道解毒程序酶活化的毒素其实需要大量第二道解毒程序酶来平衡。基因研究发现，许多人天生就比较缺乏第二道解毒程序酶的基因，可能会因此造成肝脏解毒能力的不足，如果再加上现代人饮食与生活方式不规律的因素可能会提高罹患肿瘤的机率。研究中发现，常见的青花椰菜、甘蓝菜、山葵等十字花科食物，都富含有植物性硫配醣体，可诱导第二道解毒程序酶活性的多酚物质，能够提升肝脏的解毒功能。同时第二道解毒程序酶也是一种间接的抗氧化系统，第二道解毒程序酶能活化体内原有的抗氧化酶，间接地提升

27、自身的抗氧化能力。这种物质具有抗氧化和抑制癌细胞生长的功能。同时7黄酮类物质也具有抗氧化功能,它是借助于酚羟基的氢供体自由基清除活性,其抗氧化活性必须具备两个条件: 在比可氧化底物浓度更低的情况下能有效地延迟或防止这些底物的自氧化或自由基介导的氧化；清除反应之后的自由基形式必须稳定，能通过分子内羟基结合进一步氧化。自由基是引起癌症、衰老、心血管等退变性疾病的罪恶之源。生物体内常见的自由基有，超氧阴离子自由基、羟基自由基等，自由基形成最早,羟基自由基作用最强，ROOH 链锁反应循环最持久，清除自由基，羟基自由基的形成即中断，则可以从根本上预防体内形成过多的羟基自由基和其它活性氧自由基，达到防衰、

28、抗癌、抗心血管病的目的。生物类黄酮具有清除自由基的能力，其机理在于阻止了自由基在体内产生3个阶段:即与自由基反应阻止自由基引发；与金属离子螯合阻止羟基自由基生成；与脂质过氧反应阻止脂质过氧化过程。1.1.3.5 辐射保护作用研究表明：十字花科植物如花椰菜、芥菜、包菜等蔬菜中含有一种芥子碱，具有明显的辐射保护作用，DNA是细胞内辐射主要靶分子，造成DNA碱基和脱氧核糖的各种损伤，这些损伤将给细胞带来突变，癌变，衰老甚至死亡。芥子碱可以通过清除细胞内的自由基和转移因辐射在碱基上形成的电子来抵抗辐射。李卫业9等用32p后标记法进一步研究了电离辐射对小牛胸腺DNA 造成的损伤机理以及芥子碱的保护作用。

29、比较芥子碱和高浓度的二甲亚砜对碱基损伤的保护效率，得出芥子碱对DNA 损伤的保护效率很高，这说明了芥子碱是一种强有力的抗辐射物质。本文将以芥子碱的含量来作为判断抗辐射饮料的质量的重要标准。1.2、 菌核侧耳的形态特征以及研究进展1.2.1 菌核侧耳的生物学特征菌核侧耳是一种土生木腐菌，夏秋生于阔叶树的根或埋木上，子实体从地下的菌核上长出，单生或丛生。菌盖直径1020cm漏斗形或杯形，后平展，中央仍保持下凹，菌肉变皮革质表面光滑常有散生、翘起的小鳞片，特别是近中央的部分，淡白色至肉桂色，没有条纹，边缘初内卷且薄。菌褶延生很密集，小菌摺的长度为大菌褶长度的1/6 ，宽达2mm，苍白至淡黄色，边缘完

30、整。菌柄3.513cm*0.73.5cm，中央生，偶尔偏心生圆柱形，中实，表面与菌盖同色,通常有和菌盖表面一样贴生的小鳞片或小绒毛。褶缘不孕，形成密集的囊状体毛，2038m*46m，大多数近顶端成梭状，透明，壁薄侧囊体和菌丝柱罕见或缺。孢子印白色，孢子7.510m*2.54m，柱状椭圆形，无色，透明，担子2126m*56mm，棍棒状圆柱形有4枚小梗，长达4m。菌核生于地下，直径1025cm球状、卵形或梭形、不规则形，坚实，内部白色、外皮壳暗褐色。菌丝体抗杂能力强。生长温度为1036，最适温度为2328，子实体生长温度1828，最适温度25，属中温型菌类，非变温型。培养料含水量以60%65%为宜

31、，菌丝生长阶段空气相对湿度为60%70%，出菇阶段空气相对湿度为80%90%，土壤含水量以65%70%为宜。菌丝生长阶段不需光，但催蕾与出菇阶段需要比较多的散射光，在黑暗条件下不出现子实体分化。培养基了范围内均能正常生长，最适PH为47，子实体分化与生长需要良好的通气条件，在缺氧环境中，子实体生长发育不良10。菌核侧耳分布于云南、海南等地。野生态的菌核侧耳过去在我国仅云南省和海南省有分布记载，国外日本、东南亚、澳大利亚，非洲也有分布记载。1.2.2 菌核侧耳的有效化学成分菌核侧耳中蛋白质含量为15.60%、脂肪2.50%、粗纤维6.30%、粗多糖10.8%、总糖34.60%；矿质元素中钾、钙、

32、铁、锌、硒含量较高，分别为22.4g/kg、768mg/kg、157mg/kg、105mg/kg、0.05mg/kg；氨基酸总含量为14.9%，其中人体必需的8种氨基酸量占氨基酸总量的46.10%，异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸含量相对较高11。1.2.3 菌核侧耳有效成分的药理作用菌核含有丰富的蛋白质、矿质元素、多种维生素、真菌多糖、膳食纤维等食、药用成分。作为一种真菌药材具有补肾壮阳、补血、平喘、解毒养颜等功效。另外，菌核侧耳中的虎奶多糖具有提高人体免疫功能，抗肿瘤等神奇功效12-13。30东华理工大学毕业设计（论文） 实验部分1.3、 本课题研究的目的和意义随着科学技术和人们生活的现代化，人们

33、越来越多的接触射线，电脑、手机、电视机、微波炉、空调以及医疗设备等，尤其是放疗的肿瘤患者、职业受照人员的辐射性损害日益得到重视。因此，开发抗辐射保健饮料，越来越受到人们的极大关注。从目前研究进展来可知，14十字花科植物中的花椰菜有很多活性物质，比如生物碱，黄酮，多糖等成分，这些物质在很多研究中报道具有抗辐射作用，其中芥子碱具有显著的抗氧化、抗衰老、降血压、抗炎、抗腹泻和抗雄激素活性15-17。菌核侧耳含有丰富的菌核多糖，也具有很强的抗辐射性，并且它发酵用的培养基原料大豆也含有抗辐射物质异黄酮。基于此，本课题精心选择了花椰菜和菌核侧耳为主要原料，探索有效途径将两者有机的组合在一起，开发新型抗辐射

34、保健饮料。本课题拟以豆浆、新鲜花椰菜为材料制成液体培养基，接入菌核侧耳菌种进行深层发酵，研制出一种新型抗辐射发酵饮料。菌核侧耳和花椰菜来源广，价格便宜，符合大众消费。饮料拟通过原料混合再经菌核侧耳发酵成抗辐射饮料，达到营养互补。既保留原料抗辐射物质及其他营养成分，又能去除大豆腥味，花椰菜的生味，获得菌核侧耳发酵后的香味及好的口感，以达到提高人体抗辐射功效的目的。2. 实验部分2.1 仪器与试剂2.1.1 仪器 表1仪器仪器名称 仪器型号 生产厂家紫外/可见分光光度计UV751GD型上海精密科学仪器有限公司数字PH计PHS-2F型上海虹益仪器仪表有限公司真空干燥箱2K-2BS型天津市中环实验电炉

35、有限公司电子天平 BS-223S型北京赛多利斯仪器系统有限公司调温电热套KDM型华鲁电热仪器有限公司数显恒温水浴锅HH-2型江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司高速组织捣碎机DS-1型上海标本模型厂制造气浴恒温震荡器SHZ-82A华城开元实验仪器厂桌上式洁净工作台VD-650 型苏州净化设备有限公司循环水真空泵SHZ-III型上海亚荣生化仪器厂索式提取器改良自制鼓风干燥机DH64上海跃进医疗机械厂高压灭菌锅YX280A上海三申无菌操作台VD650苏州净化可见分光光度计VIS723G北京瑞利分析仪器公司旋转蒸发仪RE52A上海亚容生化仪器厂真空仪SHZO予华仪器有限公司豆浆机JYDZ-23九阳2.1

36、.2 试剂与材料2.1.2.1 实验试剂 表2实验试剂试剂名称规格生产厂家石油醚 分析纯（AR）上海焱晨化工实业有限公司无水乙醇分析纯AR国药集团化学试剂有限公司氢氧化钠分析纯AR国药集团化学试剂有限公司丙酸分析纯AR国药集团化学试剂有限公司盐酸分析纯AR国药集团化学试剂有限公司芥子碱硫氰酸盐对照品中国药品生物制品检定所葡萄糖DK- 16中国沧州远威化工有限公司浓硫酸分析纯AR国药集团化学试剂有限公司苯酚分析纯AR国药集团化学试剂有限公司硫酸钾分析纯AR国药集团化学试剂有限公司硫酸铜分析纯AR国药集团化学试剂有限公司硼酸分析纯AR国药集团化学试剂有限公司甲基红分析纯AR国药集团化学试剂有限公司

37、甲基蓝分析纯AR国药集团化学试剂有限公司亚硝酸钠分析纯AR国药集团化学试剂有限公司硝酸铝分析纯AR国药集团化学试剂有限公司氢氧化钠分析纯AR国药集团化学试剂有限公司柠檬酸分析纯AR国药集团化学试剂有限公司苹果酸分析纯AR国药集团化学试剂有限公司白砂糖分析纯AR国药集团化学试剂有限公司蛋白糖分析纯AR国药集团化学试剂有限公司果胶分析纯AR国药集团化学试剂有限公司CMC-Na分析纯AR国药集团化学试剂有限公司琼脂分析纯AR国药集团化学试剂有限公司蔗糖分析纯AR国药集团化学试剂有限公司酵母粉分析纯AR国药集团化学试剂有限公司2.6二氯靛酚分析纯AR国药集团化学试剂有限公司2.1.2.2 实验材料玉米

38、粉、黄豆、新鲜花椰菜、菌核侧耳试管种。其中花椰菜、大豆、玉米粉均购于抚州菜市场，菌核侧耳试管种来自东华理工大学生物系大型真菌实验室。 表3菌核侧耳液体培养基配方试剂或材料黄豆(g)葡萄糖(g)蒸馏水(ml)用量12.5201000 表4果蝇培养基配方试剂或材料蒸馏水(ml)琼脂(g)蔗糖(g)玉米粉(g)酵母粉(g)苯甲酸(ml)用量1501.513171.412.2 实验方法与步骤2.2.1 发酵饮料芥子碱含量的测定2.2.1.1 测定波长的选择芥子碱在自然界中只有极少一部分是以单体的形式存在, 常与有机酸结合成盐而存在, 或以糖苷、有机酸酯和酰胺的形式存在, 而在常用十字花科药用植物中以芥

39、子碱硫氰酸盐的形式存在最为广泛18 精密称取芥子碱硫氰酸盐对照品10mg，溶于25ml的容量瓶，制成0.4mg/ml的标准品对照溶液。从此对照液中精密量取2.5ml的溶液，溶于25ml的容量瓶，制成0.04mg/ml的溶液。以蒸馏水为空白对照，置1cm的石英接收池中，在波长200nm400nm每2nm进行波长扫描，根据所测的最大吸收度值来确定最大波长19。2.2.1.2 标准曲线的绘制精密称取芥子碱硫氰酸盐对照品10mg，溶于25ml的容量瓶，制成0.4mg/ml的标准品对照溶液。从此对照液中精密量取2.5ml的溶液，溶于25ml的容量瓶，制成0.04mg/ml的溶液。再分别精密称取1ml，2

40、ml，3ml，4ml，5ml，6ml，10ml，配成浓度分别为：0.004mg/ml，0.008mg/ml，0.012mg/ml，0.016mg/ml，0.02mg/ml，0.024mg/ml，0.04mg/ml，分别装入4cm的石英比色皿中，以蒸馏水为空白对照，在最大的吸收波长处测定其吸收值。根据吸收度来绘制标准曲线，得出回归方程，计算提取液中的芥子碱含量，计算芥子碱得率20。2.2.1.3 发酵饮料中中芥子碱的测定每次取1ml液体培养基或是发酵饮料稀释到6ml，按照芥子碱标准测定方法，以蒸馏水为空白对照，在最大吸收峰处测定吸光度，测定3次求平均值，根据回归方程计算其含量21。2.2.2 最

41、佳发酵条件的确定2.2.2.1 培养基的配置 先将12.5 黄豆g浸泡24h，然后用九阳豆浆机制成豆浆（黄豆磨成粉末），然后加2 0g葡萄糖，用水稀释到1000mL22。2.2.2.2 花椰菜单因素实验 取24个50ml的小锥形瓶，分成8组，每组3瓶，依次编号为1-8。向所有锥形瓶中加入25ml培养基。用高速组织搅拌机将新鲜花椰菜打碎，以1000ml加入10g、20g、30g、40g、50g、60g、70g、80g的量按18的编号分别加入到锥形瓶中，盖上棉塞，用高压灭菌锅灭菌。 将灭好菌的培养基拿出冷却，在已用紫外灯照射15min的无菌操作台接试管种，然后将接好种的锥形瓶放在恒温气浴振荡箱内培

42、养，温度设为25，转速为150r/min。培养7天。发酵完成后，将菌丝体与发酵液一起经研磨磨碎菌丝，再经 4 5 5 5 恒温处理 5 6 h，使菌丝体内的营养成分游离到菌丝体外，再升温至 7 5 保持 3 0 mi n，使酶失活待用23。 用移液枪移取1ml发酵液，加5ml蒸馏水稀释，用紫外分光光度计测芥子碱的含量，确定最佳的花椰菜加入量。2.2.3 发酵原液的处理 以最佳的配方进行发酵，再经4 5 5 5恒温处理56h，使菌丝体内的营养成分游离到菌丝体外，再升温至75保持3 0min，使酶失活待用。 2.2.4 饮料口味的调配在处理过的发酵液中加入2倍体积的水，再加入适量的柠檬酸(A)、苹

43、果酸(B)、白沙糖(C)、蛋白糖(D)、果胶和CMCNa(E)(每100ml饮料加入量)做正交实验调味至适口24。 表5饮料口味的调配水平A(g)B(g)C(g)D(g)E(g)10.150.0260.020.05+0.120.200.0470.040.10+0.230.250.0680.060.15+0.340.300.0890.080.20+0.42.2.5 灌装，杀菌及检测将调配好的饮料灌装于干净消毒瓶中，压盖，经巴氏消毒后即得成品。按国家卫生标准GB478921994、GB一478931994进行微生物卫生标准检测23。 2.2.6 营养成分的测定2.2.6.1 发酵培养基营养成分的测

44、定1 多糖的测定（苯酚硫酸法）（1） 葡萄糖标准曲线的绘制 准确吸取1.00mL的0.1g/L标准葡萄糖溶液，加蒸馏水1mL，浓硫酸5mL，测波峰，然后取0.00mL，0.20mL，0.40mL，0.60mL，0.80mL，1.00mL的0.1g/L标准葡萄糖溶液，补至1mL，加5.5%苯酚溶液1mL，浓硫酸5mL，摇匀放至室温后在波峰值处测吸收度，然后绘制葡萄糖标准曲线25（2） 多糖含量的测定 取液体发酵培养基1mL，然后在烧杯内用量筒稀释到500mL，取出1mL的稀释液用上述的苯酚硫酸法进行糖类的测定26。2 脂类的测定（石油醚分层法）烘干一小烧杯，向里面加入10mL液体发酵培养基，称重

45、量。然后加入5mL的石油醚，倒入分液漏斗中摇匀分液，取上液称重量，计算脂的含量。M = M1 - M2其中M为10ml液体发酵培养基脂的含量，M1为液体发酵培养基和烧杯的重量，M2为经石油醚处理过的液体发酵培养基重量27。3 蛋白质的测定（凯氏定氮法）（1） 实验原理 有机含氮物的试样在硫酸和催化剂中加热消化，使氮变成氨的同时形成铵盐。向消化液中加入过量碱液，在加热条件下使硫酸铵变成氢氧化铵，同时将氨蒸馏出来，并收集于稀硼酸溶液中，然后用盐酸标准溶液进行滴定，从而求得含氮量，再将总氮量乘以蛋白质系数换算蛋白质含量。消化反应式：R-CH-NH2COOH+H2SO4CO2+SO2+NH3+H2O2

46、NH3+H2SO4（NH4）2SO4蒸馏反应式：（NH4）2SO4+2NaOH（过量）Na2SO4+2NH4OH2NH4OH加油NH3 +2H2O滴定反应式：NH3+4H3BO3 NH4HB4O7+5H2O NH4HB4O7+HCL+5H2ONH4CL+4H3BO3（2） 实验步骤1）、 样品处理：精密量取2ml发酵培养基于干燥的100ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，6g硫酸钾及20毫升硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45度角斜支于有小孔的石棉网上，小火加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5小时。取下放冷，小心加

47、10ml水，放冷后，移入50ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸铵同一方法做试剂空白试验。2）、 按下图装好定氮装置，于水蒸气发生器内装水约2/3处加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。图4 凯式定氮1.安全管 2.导管 3.汽水分离管 4.样品入口 5.塞子6.冷凝管 7.吸收瓶 8.隔热液套 9.反应管 10.蒸汽发生瓶3）、 向接收瓶内加入10ml 2%硼酸溶液及混合指示剂1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml样品消化液由

48、小玻璃杯流入反应室，并以10ml水洗涤小烧杯使流入反应室内，塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞。将10ml 40%氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其缓慢流入反应室，立即将玻璃盖塞紧，并加水于小玻璃杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏，蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，蒸馏5min。移动接收瓶，使冷凝管下端离开液皿，再蒸馏1min，然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.01N盐酸标准溶液滴定由绿变淡紫色为终点。同时吸取1.0ml试剂空白消化液按3操作。4）、计算X =(（V1-V2）*N*0.014)/( m*（10/100）) +F*100X：样品中蛋白质的含量，g；V1：样品消

49、耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml；V2：试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，ml；N：盐酸标准溶液的当量浓度；m：样品的体积，ml；F：氮换算为蛋白质的系数。F= 6.254 维生素C的测定（2.6二氯靛酚法）吸取10.00mL0.02mg/mL的抗坏血酸标准溶液和2%草酸溶液于100mL小锥形瓶中，立即从微量滴定管中滴入0.025%染料标准溶液至粉红色，在15s内不消失为终点，读数为V1；空白试验：吸取10.00mL液体培养基于100mL小锥形瓶中，加1%CuSO4溶液1mL，在110烘箱中加热10min,冷却后用染料液滴至粉红色,在15s内不消失为终点，读数为V3；吸取10.00mL液体培

50、养基和2%草酸溶液于100mL小锥形瓶中，立即从微量滴定管中滴入染料标准溶液至粉红色，在15s内不消失为终点，读数为V2。样品中含有维生素C量T=0.2（V2 V3）/ V1(mg)式中V1为抗坏血酸标准溶液耗染料毫升数；V2为样品液消耗抗坏血酸毫升数；V3为空白液消耗抗坏血酸毫升数29。5 黄酮的测定（可见分光光度计法）（1） 芦丁标准曲线的绘制 称取在105 干燥恒重的芦丁对照品10mg，用3 ml水溶解，摇匀，定容至10ml，使之成为浓度为1mg/ml的芦丁标准品溶液，作为贮备液备用。量取上述溶液0、0.1 、0.2 、0.3 、0.4 、0.5 、0.6ml，分别加水至3 ml，摇匀。

51、加入0.5mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀，放置6min，加入10%硝酸铝溶液0.5mL，摇匀，放置6min，加入4%氢氧化钠溶液5mL，摇匀，定容至10mL，放置12min，以试剂为空白参比液，于510nm 波长处测量吸光度，得到吸光度与其浓度的线性关系。以吸光度为纵坐标，以芦丁标准溶液质量浓度C 为横坐标绘制标准曲线30。（2） 黄酮含量的测定准确移取2ml发酵培养基，按上述操作进行吸光度的测定，根据标准曲线的线性关系计算黄酮的含量31。6 芥子碱的测定取1ml液体培养基稀释到6ml，用紫外分光光度计测芥子碱的含量。2.2.6.2 发酵后饮料营养成分的测定（发酵液经高速组织搅拌机搅碎）1 多糖

52、的测定取发酵好的饮料1mL，然后在烧杯内用量筒稀释到30mL，取出1mL的稀释液用上述的苯酚硫酸法进行糖类的测定。2 脂类的测定烘干一小烧杯，向里面加入10mL发酵好的饮料，称重量。然后加入5mL的石油醚，倒入分液漏斗中摇匀分液，取上液称重量，计算脂的含量。3 蛋白质的测定精密量取2ml发酵好的饮料按上诉方法进行测定。4 维生素C的测定吸取10.00mL0.02mg/mL的抗坏血酸标准溶液和2%草酸溶液于100mL小锥形瓶中，立即从微量滴定管中滴入0.025%染料标准溶液至粉红色，在15s内不消失为终点，读数为V1；空白试验：吸取10.00mL液体培养基于100mL小锥形瓶中，加1%CuSO4

53、溶液1mL，在110烘箱中加热10min,冷却后用染料液滴至粉红色,在15s内不消失为终点，读数为V3；吸取10.00mL发酵液和2%草酸溶液于100mL小锥形瓶中，立即从微量定管中滴入染料标准溶液至粉红色，在15s内不消失为终点，读数为V2。5 发酵液黄酮的测定准确移取2ml发酵液，稀释到10ml，再取2 ml按上述操作进行吸光度的测定，根据标准曲线的线性关系计算黄酮的含量。6 发酵液芥子碱的测定取1ml发酵饮料稀释到6ml，用紫外分光光度计测芥子碱的含量。2.2.7 饮料的紫外辐射保护芥子碱是通过清除细胞内的OH和转移因照射在碱基上形成的电子来抵制辐射和活性氧的损伤322.2.7.1 果蝇

54、培养基的配制先用100克水加热溶解琼脂，再溶入蔗糖，用50克溶解玉米粉，再缓缓加入溶解的琼脂中，搅拌成稀糊状停火，然后加入丙酸搅拌均匀，趁热分装瓶，稍微冷却后加入酵母粉33-34。表6果蝇培养基的配制名称水琼脂蔗糖玉米粉酵母粉丙酸配方150克1.5克13克17克1.4克1ml2.2.7.2 果蝇的培养以及抗辐射作用 图5 雌雄果蝇 图6 果蝇生长周期 图7 果蝇的变异体果蝇培养条件参考遗传学实验书上的方法进行，收集同一批10小时内先羽化果蝇成虫（处女蝇），乙醚麻醉分雌雄，移入后必须将瓶子横卧，以免果蝇粘在培养基上，待果蝇苏醒 ，放置在25的恒温培养箱中培养32-33。在培养基上培养2周后随机分

55、组实验。2.2.7.3 果蝇的抗辐射作用培养以及收集处女蝇，试验分A，B，C三组，每组10瓶，每瓶雌雄果蝇养5对。A组为对照，B组紫外线辐射，C组紫外线辐射后用含饮料的酵母粉喂养。培养3天后把亲本转至新的培养基中继续培养，而原来的培养基继续培养，使卵发育成蛹并孵化，羽化，每天定时观察，统计记录各组每瓶子代雌果蝇的数量，雄果蝇的数量，总的成虫的数量，突变的数量。从而判断经辐照后，是否喂养芥子碱，果蝇的性别比，繁殖率，突变率是否发生了变化，芥子碱是否具有抗辐射作用35。3 结果与讨论3.1 花椰菜芥子碱含量的测定3.1.1 花椰菜芥子碱波长的确定 在200nm400nm，每2nm进行扫描。扫描结果

56、见表1和扫描图1，芥子碱在318nm处有最大吸收峰，故芥子碱的波长确定为318nm。表7 不同波长（nm）下芥子碱的吸收值265270275280282284286A0.2660.2720.3010.3460.3680.3890.412 288290292294296298300302304306A0.4410.4690.4930.5210.5440.5690.5900.6130.6310.650 308310312314316318320322324326A0.6680.6820.6950.7060.7100.7120.7100.7030.6930.683283303323343363383

57、40345350355A0.6560.6270.5850.5480.5040.4670.4280.3170.2160.143360365370375380385390395400A0.1110.0620.0610.0580.0550.0700.0910.1020.11600.10.20.30.40.50.60.70.8265305345385波长OD值 图8 芥子碱硫氰酸盐对照品的紫外扫描图东华理工大学毕业设计（论文） 结果与讨论3.1.2 标准曲线的绘制表8 芥子碱硫氰酸盐对照品的吸光度编号空白1234567溶液浓(mg/ml)0.0000.0040.0080.0120.0160.0200.

58、0240.040吸光度值(A)0.0000.0780.1510.2280.2960.3600.4340.740 图9 分光光度法测定芥子碱硫氰酸盐标准曲线图以蒸馏水为空白对照，在318nm处分别测得光吸收值，求得回归方程：A=18.306C+0.0021(R2=0.9994)。表明芥子碱在0.0040.04mg/ml的浓度范围内光吸收值与浓度具有良好的线性关系。3.2 最佳发酵条件的确定3.2.1 花椰菜单因素实验 表9 最佳发酵条件的确定特征用量（g）颜色气味菌球大小密度湿重(g)芥子碱含量（mg）10透明微黄略有豆浆芳香较大密2.011.5420透明微黄略有豆浆芳香较大密2.131.9130透明微黄略有豆浆芳香较大密2.301.9640透明微黄略有豆浆芳香较大密2.412.7750透明微黄略有豆浆芳香较大密2.444.7460透明