土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及淀粉酶活力的测定

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1、微生物综合实验报告土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及淀粉酶活力的测定学院：生命科学学院班级：生物技术121班姓名：学号： 一， 摘要本次实验选取广大的土壤，使用五点法采样，并制备出土壤悬液。然后将土壤悬液的上清液分四个梯度稀释，使用平板划线法反复进行分离纯化，得到纯净的菌株。我们得到菌株后，采用形态学的辨别方法，单染色，芽孢染色，革兰氏染色，淀粉水解实验，温度实验，糖类发酵试验（葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇），VP试验，MR试验，吲哚试验，柠檬酸盐利用实验，耐盐性试验，硝酸盐还原实验，明胶液化试验，运动性穿刺试验，酪素水解试验，卵黄实验等方法检验，查阅伯杰氏手册后，鉴别其为蜂房芽孢杆菌。二，材料

2、与方法1 材料1.1 试剂碘原液：碘1lg，碘化钾22g，加水定容至50OmL；单染色：草酸铵结晶紫或石炭酸复红；革兰氏染色：草酸铵结晶紫染色液，卢戈氏碘液，95%乙醇，0.5%沙黄染色液。芽孢染色：5%孔雀绿染色液，0.5%沙黄染色液。V.P试验：40%NaOH 溶液，-奈酚。吲哚试验：乙醚，吲哚试剂。硝酸盐试验：甲液（对氨基苯磺酸0.8g+5mol/L醋酸100mL；乙液（-奈胺0.5g + 5mol/醋酸100mL）；酪素水解：牛奶；酪氨酸水解：L-酪氨酸；淀粉酶活力测定：1% 3,5-二硝基水杨酸试剂。1.2仪器：无菌培养皿，接种环，土样，三角瓶，烧杯，试管，酒精灯，无菌吸管，载玻片，

3、吸水纸等。恒温摇床，恒温培养箱，高压蒸汽灭菌箱，超净工作台，水浴箱，磁力搅拌器，涂布器，显微镜，移液管，移液枪。1.3 培养基筛选及活化培养基淀粉20 g，蛋白胨10 g，NaCl 2.5 g，琼脂10 g，自来水1000 ml, pH 自然。斜面种子培养基牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂1520 g，自来水1000 ml，pH 7.27.4；摇瓶发酵培养基称取可溶性淀粉2 g，蛋白胨1 g，牛肉膏03 g，氯化钠05 g溶于100 mL蒸馏水中。pH自然；蛋白胨液体培养基（作吲哚实验用）蛋白胨10 g，NaCl 5 g，自来水1000 ml，pH 7.27.4，121 灭

4、菌20 min；葡萄糖蛋白胨培养基（VP和MR试验用）蛋白胨5 g，葡萄糖5 g，NaCl 5 g，自来水1000 ml，pH 7.27.4，121 灭菌20 min；糖发酵培养基（作细菌糖发酵试验用）蛋白胨2 g，NaCl 5 g，K2HPO4 0.2 g，1%溴麝香草酚蓝水溶液3 ml，待试糖10 g(一般糖或醇按1 % 量加入，而半乳糖、乳糖按1.5 % 的量加入)，自来水1000 ml，pH 7.27.4；酪氨酸平板（作酪氨酸水解试验用）L酪氨酸0.5g悬浮于10mL蒸馏水中，20分钟灭菌，然后于100mL无菌的营养琼脂混合，即成酪氨酸水解平板；酪素平板（作酪素水解试验用）取5g脱脂奶

5、粉加入50mL蒸馏水中（或用50mL脱脂牛奶），另称1.5g琼脂溶于50mL蒸馏水中，将两液分开灭菌。待冷至4550时，将两液混匀倒平板，即成牛奶平板；西蒙斯氏柠檬酸盐培养液（作柠檬酸盐利用试验用）柠檬酸钠2 g，NaCl 5 g，MgSO47H20 0.2 g, K2HPO43H20 1 g,(NH4)2HPO4 1 g, 1%溴麝香草酚蓝水溶液10 ml，琼脂1520 g，自来水1000 ml，pH 7.0 , 121 灭菌20 min；淀粉牛肉膏蛋白胨琼脂培养基可溶性淀粉2 g，牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂1520 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.27.4；（

6、2%、5%、7%）高盐培养基牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl（ 2g、5g、7g），琼脂1520 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.27.4；明胶培养基牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，明胶12g，蒸馏水1000 mL ，pH 7.0；半固体培养基（作运动性实验用）琼脂含量0.5%，其他组分比例按牛肉膏蛋白胨培养基配制；2 方法2.1 土样的采集选取广大梅苑公寓楼下花园、广大生化楼前小河附近两处的土壤，五点法采集，边长15cm。铲去表层土，取10cm深土壤，每一个土样约25g 左右（每个点5g）。将土样放入无菌的纸袋中,并记录采集的时间、地点、植被类型,4 保存备用。2.2 土壤样品悬液制

7、备2.2.1 土壤悬液制备各称取5 g 土壤样品于装有45ml 无菌水的100ml锥形瓶中，加入玻璃珠与土壤悬液一起振荡, 制成土壤悬液。置100沸水浴10 min，以杀死非芽孢杆菌。静置5min。2.2.2 土壤悬液稀释吸取上清液0. 5 ml 加到含有49. 5 ml 无菌水的三角瓶中,配成10 - 3 g/ ml 的土壤悬液,并进一步稀释至10 - 4g/ ml 和10 - 5g/ ml。2.3 分离纯化2.3.1 芽孢杆菌属的纯培养分别吸取不同稀释度的土壤悬液0. 2 ml 于牛肉膏蛋白胨琼脂平板上，用无菌玻璃涂棒涂布均匀。每个稀释度3 个重复,37 倒置培养24h。每个土样随机挑取2

8、0 个形态特征不同的单菌落,在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上划线纯化。菌落的形状、颜色、质地、透明度一致,菌体形态为直杆状,长度均一、宽度一致,并能产生芽孢时,确认为芽孢杆菌属的纯培养物。单染色镜检步骤：涂片、干燥及固定；染色：在涂有菌种的载玻片上滴加适量的草酸铵结晶紫染色液或石炭酸复红液，染1 min，倾去染液，用水冲洗至无染色液颜色为止。镜检：用油镜观察染色结果；芽孢染色镜检步骤：取37培养1824h的枯草芽孢杆菌涂片，干燥，固定。于涂片上滴人35滴5%孔雀绿水溶液。用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开始计算时间约4-5min。加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染

9、料。倾去染液，待玻片冷却后，水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。用石炭酸复红液复染l min，水洗。制片干燥后用油镜观察。芽孢呈绿色，菌体红色。观察芽孢的形状和位置.将筛选出的菌株接种于肉汤琼脂斜面，37培养18-20h。2.3.2 产淀粉酶菌株的筛选淀粉水解实验对通过单染色和芽孢染色的镜检得到的纯培养的芽孢杆菌进行淀粉水解实验，并从中筛选出水解圈较大的6株菌作为目的菌，进行后续实验。具体步骤如下：挑取菌种，采用点解法接种于可溶性淀粉培养基中，每两种菌做一个平板，并做一次平行实验和空白对照组。将接种完成的平板置于37恒温箱中倒置培养24h。2.3.3 菌株保藏 将筛选出的菌株接种于肉汤琼脂斜面，4下保

10、存待用。2.4初步鉴定2.4.1形态学鉴定将所得的斜面菌种接种到新的平板上培养以观察筛选出的产淀粉酶芽孢杆菌菌落的大小、颜色、干湿情况、形态 、高度 、透明程度、边缘、是否易被挑起、气味等。然后进行一系列的镜检革兰氏染色、芽孢染色（具体步骤同上）观察是否符合芽孢杆菌的指标。革兰氏染色经查阅伯杰氏手册，芽孢杆菌属基本为革兰氏阳性菌。由此，运用革兰氏染色技术，将不被脱色而保留初染剂的颜色（紫色）者筛选出来，初步缩小需要检验范围。主要步骤：先用结晶进行出染，再加媒染剂碘液，以增加染料与细胞的亲和力，使结晶紫和碘在细胞膜上形成相对分子质量较大的复合物，然后用脱色剂乙醇进行脱色，最后用沙黄液复染，最后镜

11、检。2.42生理生化鉴定温度对微生物生长的影响 将牛肉膏蛋白胨培养基熔化倒平板（培养基厚度为一般培养基的1.5 到2倍）。使用牛肉膏蛋白胨培养基，于平板划线接种，分别在5，15，25，35，45，60，65条件下培养24h，观察细菌是否生长。 糖类发酵试验（葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇）取斜面培养菌种接种于37温箱中培养24h，观察培养基是否由紫变黄，杜氏小管中是否有气泡，以证实菌株是否产酸产气。IMViC试验（1）乙酰甲基甲醇试验(VP试验)取葡萄糖蛋白胨培养基，接种37培养两天， 取出以上试管，每管分别加入40NaOH溶液10-20滴，并加等量-奈酚，振荡试管，以使空气中的氧溶入，置37

12、恒温箱中保温15-30min后，若培养液呈红色，记为阳性（+）反应，若不呈红色，记为阴性（-）。（2）甲基红试验（MR试验）取葡萄糖蛋白胨培养基，接种37培养两天，取出以上试管，每管分别加入甲基红2滴，震荡，若培养液呈红色，记为阳性（+）反应，若不呈红色，记为阴性（-）。（3）吲哚试验取蛋白胨水培养基,接种，37度培养2天，在培养基中加入乙醚12ml,经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入510滴吲哚试剂，如有吲哚存在，乙醚层呈现玫瑰红色，为吲哚试验阳性（+），否则为阴性（-）。（4）柠檬酸盐利用实验取装有西蒙斯氏柠檬酸盐培养基斜面的试管，分别将少量

13、菌苔接种于各支相应的管中，然后置于37恒温箱中培养24h。观察结果，若培养基变蓝色，则表明该菌能利用柠檬酸盐作为碳源而生长，即为阳性（+），若培养基无变色，则为阴性（-）。耐盐性试验将分离获得的细菌分别接种在NaCl浓度为2%，5%，7%，10%，的牛肉膏蛋白胨液体培养基中,置37下培养,观察生长情况 ，并做记录。硝酸盐还原实验被检菌接种于硝酸盐培养基中，于35培养l4d.将甲、乙液等量混合后（约0.1 mL）加入培养基内，立即观察结果。明胶液化试验穿刺接种，深度至明胶层2/3处，于37温箱培养24h.。取出静置冰箱中待其凝固后，再观察其是否被细菌液化，如被液化,则为阳性,能产生蛋白酶。运动性

14、试验使用半固体营养琼脂试管，将接种针从直立柱培养基中央自上而下直刺到离管底11.5cm处,沿原穿刺线拔出接种针。于37温箱培养24h，观察是否产生树根状生长，若有，则菌株有鞭毛，若直立生长，则菌株无鞭毛。酪素水解试验（酪蛋白水解）牛奶平板的制备：取5g脱脂奶粉加入50mL蒸馏水中（或用50mL脱脂牛奶），另称1.5g琼脂溶于50mL蒸馏水中，将两液分开灭菌。待冷至4550时，将两液混匀倒平板，即成牛奶平板。将平板倒置过夜，使表面水分干燥，然后将菌种点接在平板上，每皿可点接35株菌。37培养，记录菌落周围和下面酪素是否已被分解而呈透明。酪氨酸水解实验 将营养琼脂融化，冷却至温热，与L-酪氨酸混匀

15、，分别将菌种点接在平板上，37培养24h。记录菌落周围是否有透明圈，若有，则菌株能够水解酪氨酸。2.4.3菌种鉴定根据从伯杰式细菌学手册芽孢杆菌属中检索到的芽孢杆菌的生理生化特点，选取能从土壤中分离到的芽孢杆菌种为标准菌种，其生理生化特征如下表：通过对目的菌种进行多项生理生化实验，对比伯杰式手册的实验结果，从而鉴定出目的菌的种别；2.5酶活测定2.5.1 菌株活化将分离纯化的菌种接种在营养牛肉汤培养基的试管中，37培养12h，中间摇震35次。2.5.2 初检将上述培养好的液体管菌种用滴种法接种于淀粉酶试验培养基中，每个菌种接两个板，争取平板上一定要出现5个以上的单个菌落，以易于观察测量和计算透

16、明圈。将接好的上述平板置于恒温箱中37培养24h。将培养好的平板取出，分别滴加现配制的鲁格尔氏碘溶液，直至全部弥漫平板。稍停片刻，观察其菌落形成的透明圈。2.5.3 复选 采用3,5-二硝基水杨酸显色法进行测定。2.5.3.1 粗酶液的制备将活化的芽孢杆菌菌液接种于种子培养基中，35培养12h，然后以5的接种量接种于发酵培养基中摇床培养，160rpmmin，37，48h。发酵24h后补加碳酸钙使整个发酵过程中碳酸钙的含量大约保持在0.02。离心(4000rpmmin，20min)、收集上清液即为待测粗酶液。2.5.3.2 淀粉酶活力的测定 标准曲线的制作。取7 支20 mL 预先洁净灭菌干燥的

17、有刻度试管，编号，加入试剂见表1。每个浓度做3 个平行样本。摇匀，至沸水浴中煮沸5 min。取出后冷却，加蒸馏水定容至20 mL，以1 号管作为空白调零点，在520 nm 的波长下比色测定吸光度值，并建立通过吸光度值求麦芽糖含量的回归方程。麦芽糖标准溶液 表1 淀粉酶标准曲线的制作试管号1234567标准麦芽糖溶液/mL00.20.61.01.41.82.0蒸馏水/mL2.01.81.41.00.60.20麦芽糖含量/mL00.20.61.01.41.82.03,5-二硝基水杨酸/mL2.02.02.02.02.02.02.0粗酶液淀粉酶活力测定按以下顺序操作：取20ml具塞刻度试管，预先洁净

18、灭菌干燥、编号。取粗酶液100ml，2的可溶性淀粉l ml，蒸馏 3ml，于60水浴中预热5min。加01 moll柠檬酸缓冲液(pH6.0) l ml，于60水浴中保温30min。加入1.5ml 3，5-二硝基水杨酸，沸水中5min，迅速冷却，加蒸馏水定容至20ml。空白对照加发酵液后加pH36以下的酸钝化淀粉酶，使酶失活，其余步骤同上。定容后，摇匀，用分光光度计测定OD520的值。在上述条件下以单位体积样品在30min释放l毫克麦芽糖所需的酶量为一个麦芽糖单位(MMU)表示酶活性。三， 结果与分析1， 形态学肉眼观察为白色，花状，半透明，边缘光滑，能被接种环挑起。2， 革兰氏染色经过革兰氏

19、染色后，在显微镜上观察，发现该菌颜色为紫色，呈杆状，且附近有透明颗粒，这些透明颗粒应为脱落的芽孢。3， 芽孢染色在显微镜上观察，小部分的菌呈紫色，大多数的菌两边为紫色，中间为绿色。分析：小部分的菌未成熟，没有长出芽孢或芽孢脱落;大多数的菌长出芽孢，中间绿色的为芽孢。芽孢染色需要注意初染时玻片不要离火源太近，我在染色时就弄碎了玻片。且复染要注意时间，不然芽孢不能被染绿。4，温度对微生物生长的影响 平板划线接种，分别在不同时间条件下培养24h。发现5，10，15，50，55，60没有细菌长出。45的菌生长茂盛，长出8个菌落，乳白色，花状。40长出4个菌落，体型较大，为乳白色。30长出4个菌落，中间

20、透明，边缘白色。25长出4个菌落，体型较小，乳白色，呈云状。20的菌只有一小点，乳白色。分析：根据生长情况，该菌的生长适宜温度为20-45左右。5，糖类发酵试验葡萄糖发酵实验中，空白试管溶液为紫色，小试管没有气泡，1，2号管溶液变为橙黄色，小试管没有气泡。阿拉伯糖发酵实验中，空白试管溶液为紫色，小试管没有气泡，1，2号对照试管溶液为紫色，小试管没有气泡。木糖发酵实验中，空白试管，1，2号试管溶液为红色，小试管没有气泡。甘露醇发酵实验中，空白试管溶液为紫色，小试管没有气泡，1，2号对照试管溶液为紫色，小试管没有气泡。分析：该菌菌能利用葡萄糖进行发酵产酸，但不产气。而对于阿拉伯糖，木糖，甘露醇，它

21、不能利用。杆菌对不同糖的利用情况可以判断其为哪种菌，是一项重要的生化试验。6 ，VP试验空白试管的上，下层溶液均为黄色，而1,2号试管溶液分层明显，上层溶液为玫瑰红色，下层溶液为黄色。分析：该菌VP试验上层溶液为玫瑰红色，呈阳性。7，MR试验MR试验中，空白试管溶液为黄色，1,2号试管的溶液颜色为黄色。分析：该菌MR试验呈阴性。但三支试管的颜色深浅有所不同，可能是菌利用了一些葡萄糖的缘故吧。还是别的原因？8，吲哚试验经吲哚试验后，空白试管上，下层溶液无色透明；1,2号试管溶液分层明显，上层乙醚层交薄，下层溶液交深，上层溶液呈玫瑰红色。分析：该菌吲哚试验结果为阳性，说明该菌能产生吲哚。9，运动性

22、试验使用半固体营养琼脂试管，将接种针从直立柱培养基中央自上而下直刺到离管底11.5cm处,沿原穿刺线拔出接种针。于37温箱培养24h，观察到没有直立根生长。分析：该菌株没有鞭毛。10，耐盐性试验将分离获得的细菌分别接种在NaCl浓度为2%，5%，7%，10%，的牛肉膏蛋白胨液体培养基中,置37下培养.发现4个浓度都长有菌落，长菌程度分别为+，+，+，+分析：该菌耐盐性不强，只能在2%，5%时长出菌落，而在10%NACL时，所长菌落数极小。11，酪素水解试验（酪蛋白水解）发现菌落下的酪素已被分解而呈透明。长出4个菌落，其直径分别为2.5,2.6,1.7,1.9分析：说明该菌能产生分解酪素的酶。1

23、2，酪氨酸水解实验培养皿被污染，无法观察结果。13，卵黄实验24小时培养后，没有发现有菌落生长。14，淀粉实验48小时培养后，2个培养皿上的菌落生长旺盛，并且出现很大的透明圈。分析：该菌在淀粉实验中能产生透明圈，说明其是能产淀粉酶的芽孢杆菌，其能利用淀粉。15，菌种鉴定经过多个实验，发现该菌革兰氏染色为不稳定的性状，耐盐性不强，VP试验呈阳性，MR实验呈阴性，吲哚试验结果为阳性，运动性实验为阴性，酪素水解试验为阳性，能利用葡萄糖产酸，不能利用阿拉伯糖，木糖，甘露醇。该菌的生长适宜温度为20-45左右。最后查阅伯杰氏手册后发现该菌为蜂房芽孢杆菌。四 分析与讨论本次实验非常考验团队之间的信任程度，

24、分工合作能力。一个团队只有能团结合作，才能发挥队员的积极性和团队的工作效率。我们组虽然分工的好，但有时会有一些小意外出现。比如，在一位组员配好斜面培养基后，另一位组员负责包扎，但她不小心弄碎了，而配培养基的同学很愤怒，我们就去平息一下他。平板划线时，我有时没有等接种环冷却后再划线，导致培养基熔了，细菌烧焦了。还有一次，我用力过大，划掉了一块培养基，然后要重来。这些都是我实验动手能力不足的体现。但经过组员们的教导后，我努力改正，技术得到进一步的提升。在配制生化试验的溶液时，需要精确地量取所需试剂，需要精确量取蒸馏水，还需要调好PH值。有一次就是因为PH值调错了，致使又要配多一次，好在有组员包容，不然惨了。细节决定成败，这是真理。革兰氏染色为不稳定的性状，耐盐性不强，VP试验呈阳性，MR实验呈阴性，吲哚试验结果为阳性，运动性实验为阴性，酪素水解试验为阳性，能利用葡萄糖产酸，不能利用阿拉伯糖，木糖，甘露醇。该菌的生长适宜温度为20-45左右。最后查阅伯杰氏手册后发现该菌为蜂房芽孢杆菌。而在酪氨酸水解实验中，可能是无菌操作有些失误，导致被污染，这些事是不应该发生的，或者是无菌台风力太小。这次实验总体上来说是成功的，这都有赖于我们组的配合与互助，这次实验还能增加我们的实验动手能力，我从中得到提升。