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1、.利用峰面积分析混合DNA样品【关键词】阴道混合物，强奸，dna【中图分类号】d9192；q75【文献标识码】b【文章编号】10079297(2004)01005103在法医dna检验过程中，经常会遇到多个体的混合样本，如受害人和嫌疑人的混合样品，几个嫌疑人的混合样品。荧光标记自动分析str系统，不仅能根据位点等位基因的个数判断样品是否为混合样品，而且还能根据等位基因峰面积(谱带荧光总强度)确定混合样品中各组分的混合比例，推断混合样品中各组分的基因分型_1j。gill等建立了利用峰面积分析混合样品的方法_2。本文利用该法对一宗案件中的混合样品进行了分析，推断混合样品各组分的比例及各组分的基因分
2、型。材料和方法2001年于中山某地发生一宗强奸案，送检材料为事主血纱，嫌疑人1血纱，嫌疑人2血纱，以及在嫌疑人2住处提取的一根带毛囊的阴毛(上沾有少量分泌液)，分别编为14号样品。按chelex一100法 提取dna，采用ampfi str identifiler复合扩增试剂盒(美国abi公司)同时扩增d8sl179、d21sll、d7s820、( f1p0、193s1358、tho1、d13s317、d16s539、d2s1338、d19s433、vwa、tpox、d18s51、d5s818、fga等15个位点和性别位点amelogenin，扩增产物在abi310遗传分析仪上进行电泳分离，g
3、enescan30软件分析结果，genotypern 25软件进行基因分型。结 果一、样品分型样品分型结果见表1。表1 样品分型结果二、结果分析结果分析方法参照文献2。(一)确定是否有混合样品1根据谱带数目。正常情况下进行常染色体str分型时，纯合子应检出一条带，杂合子检出2条带，混合样品会出现谱带数目增多。4号样品在d8sl179等3个位点检出4个等位基因(表现为4条谱带)，在d21s11等6个位点检出3条谱带，提示该样品为混合样品。2等位基因峰面积的不对称。理论上对于杂合子来说，两个等位基因的峰面积应大致相等，比例接近于1；而混合样品由于等位基因的叠加，可能会出现不正常的杂合子现象，两个等
4、位基因的峰面积差异会增大。表2列出了混合比例为1：10、1：1、10：1时出现2个等位基因时峰面积的比例。4号样品在th01、d13s317、tpox、d18s51、amelogene等位点均检出2条带，类似杂合子，但2条带的峰面积明显不平衡(见表3)，同样提示4号样本为混合样本，且为男女混合。(二)确定混合样品中供体的数目样品4所有位点出现的等位基因数最多为4个，提示供体数为2个。(三)确定混合样品中各供体的基因型组合对于杂合子来说，两个等位基因的峰面积应大致相等，比例接近于1。基于此原理，分析者可以通过观察到的峰面积来推断可能的基因型组合和各组分的比例。对确定是二供体组成的混合样本来说，分
5、型结果可以表现为一带型、二带型、三带型或四带型。除一带型外，其余各种表现均可提供基因型组合的信息。其中四带型由于直观地表现出2个供体的基因型，所以最易于通过其推断2个供体的基因型组合及其比例。假设某一位点出现的4个等位基因依片段由小到大的顺序定为a、b、c、d，观察到的面积分别为paa、pab、pac、pad，定义mx为所有位点都接近相等，然后给出一个估计的混合比例(mx)，如果解释正确的话，观察值和期望值应接近，这对任意基因型组合可用峰面积的剩余值eq来检验，峰面积的剩余值eq=(pa观察值一pa期望值) ，峰面积的剩余值越低，该基因型组合的可能性越高。以4号样品的d8sl179位点为例，混
6、合物中检出10(a)、14(b)、15(c)、16(d)，据eq值可推断混合比例(mx)bcad=062，相反混合比例(mx)adbc =038，其他的基因型组合(如ab，cd)不可能存在，因为eq不可能接近零。表4列出了对出现4个等位基因的位点的分析，在列出某个位点的所有可能的基因型组合后，计算他们各自的eq值，将eq值最小的基因型组合作为推断的基因型组合列入表4中。取表4计算出的mx的平均值036，并定义mx为所有位点都接近相等，计 1 2 算各位点的eq值，见表4。可以看出取mx的平均值后，各位点的eq值变化不大 52 分析出现3个等位基因比出现4个等位基因的模式复杂的多，因为排列组合更
7、多，不过可应用同样原则。除部分位点可推断基因型并推断各组分比例，大部分出现3个等位基因的位点只能推断各组分的多少而不能计算出具体数值。法律与医学杂志2004年第ll卷(第l期)取表l计算出的mx的平均值036，并定义mx为昕有位点都接近相等，计算各位点推断基因型组合的eq值，表5列出eq为最小值时的基因型组合。表2 出现2个等位基因时峰面积的比例的分析表3 出现2个等位基因的位点的分析表4 出现4个等位基因的位点的分析表5 出现3个等位基因的位点的分析律与医学杂志2004年第11卷(第1期)表6 混合样品各组分基因型的推断结果 53 从单个str位点等位基因峰面积计算得出的混合物比例mx通常可
8、应用于所有位点，但当某几个位点可以推断基因型组合并推断混合物比例时，取mx的平均值去验证各位点的eq值显得更为准确。组分的比例越悬殊，基因型组合越易鉴别，比例越接近，可能的基因型组合越多，越难判断。需注意的是峰面积值太低(<1 000个单位)时判型不准确，应通过增加或减少dna样品浓度、增加电泳上样浓度、增加电泳进样时间等方法来提高峰面积及增加相应峰的平衡，使峰面积更好地反映混合样品中各组分的dna比例。研究表明，当混合比例为1：10和10：1时，较少组分的等位基因峰面积已接近与主要组分等位基因的“stutter”峰面积 ，所以混合比例过分悬殊时，分析应多加注意。根据上述计算、分析推断得
9、出样品4的混合物比例为036，基因型组合见表6，可以看出组分1有8个str位点与嫌疑人1基因型相同，可达认定。而组分二则有8个str位点与事主基因型相同。在vwa位点中，1818、1417的基因型组合eq值经计算为0013 9，并非最小，可能由于等位基因扩增不平衡所致。讨 论本文利用峰面积对两组份的简单混合斑进行分析，方法简单，贯穿推断过程的是各等位基因的峰面积剩余值要接近于零，峰面积的剩余值越低，该基因型组合的可能性越高。(1)在确定样本为两组份的简单混合物后，通过出现4个等位基因的位点的各峰的峰面积推断可能的基因型组合和该组合的混合比例，取平均值。(2)利用此混合比例平均值对出现3个等位基
10、因的位点和性别位点进行分析，推断出可能的基因型组合和性别组合。(3)将推断出的各组分基因型与相关样品基因型比对：(4)需注意的是扩增时混合物dna 的浓度应控制在一个合适的范围，使各等位基因扩增尽量平衡，这样结果更准确。(5)应尽可能多做几个位点，位点越多，信息量越大，认定的几率也越大。(6)分析时尽量进行盲分析，这样可以保证分析的可重复性和科学性，可能会有个别位点出现错误，可将该位点去除或进行修正。参考文献1郑秀芬，纪贵金，刘超，等二组份混合dna样品str图谱解释中国法医学杂志，2001，15(4)：2032072gill p，sparker r，pinchin r，et a1interpreting simple str mixtures using allele peak areas forensic sci inter，1998，91(1)：41533公安部物证编写组法医物证检验技术与应用北京：人民法院出版社1997 333334(收稿；20030613，修回；20030727).
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