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1、南京农业大学实验报告纸课程 分子遗传学实验 班级 遗传学 09 学号 2009101003姓名 常圣鑫实验三 用于大分子分离的电泳技术一、实验目的了解各种类型电泳的原理与应用并且掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的制胶过程。二、实验原理 电泳技术，是指在电场作用下，带电颗粒在由于所带的电荷不同以及分子大小差异而有不同的迁移行为从而彼此分离开来的一种实验技术。 许多生物分子都带有电荷，其电荷的多少取决于分子结构及所在介质的pH值和组成。由于混合物中各种组分所带电荷性质、电荷数量以及相对分子质量的不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速率也各异。因此，在一定时间内各组分移动的距离也不同，从而达到分离鉴定
2、各组分的目的。 （一）电泳技术应用电泳技术主要用于分离各种有机物（如氨基酸、多肽、蛋白质、脂类、核苷酸、核酸等）和无机盐；也可用于分析某种物质纯度，还可用于分子量的测定。电泳技术与其他分离技术结合：电泳法与层析法结合，用于蛋白质结构的分析；用免疫原理测试电泳结果，提高对蛋白质的鉴别能力；电泳与酶学技术结合，发现同工酶，对于酶的催化和调节功能有了深入的了解。（二）常见的电泳技术(1)琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶孔径较大适用于分离同工酶及其亚型、大分子核酸等，应用较广。琼脂糖可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA
3、段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。目前，一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。 (2)聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶简称PAGE，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，这一聚合过程需要有自由基催化完成。常用的催化聚合方法有两种：化学聚合和光聚合。化学聚合通常是加入催化剂过硫酸铵(AP)以及加速剂四甲基乙二胺(TEMED)，四甲基乙二胺催化过硫酸铵产生自由基。溶液的pH对聚合作用是重要的，因为过低pH没有足够的碱基加速催化反应，同样过多的氧分子存在，会使聚合作用很快停止。所以制备凝胶时，在加过硫酸铵之前，
4、混合物必须抽去空气。核黄素催化的聚合作用，常用于制备浓缩胶，因为这样制得的凝胶孔度要大些。核黄素在光照射下及有微量氧存在时，产生自由基使Acr发生聚合作用。三、 实验仪器与试剂 微量移液枪及枪头、聚丙烯酰胺凝胶电泳槽、三角瓶、吸管、丙烯酰胺、TBE、水、AP、TEMED等。四、实验步骤 聚丙酰烯胺凝胶制备过程： 1. 按要求装配好垂直电泳板，两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂糖封边，防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出。 2将装好的玻璃电泳板倾斜成4560角。 3配制所需浓度凝胶的毫升数。 4加入TEMED后，立即混匀，缓缓倒入两玻璃板间的胶床中，直到液体接近溢出时为止。 5立即插入适当的梳子，密切注意防止梳齿下产生气泡，用一有力的夹将梳子夹在一边的玻璃板上，然后将玻璃板斜靠在物体上，使成10角，可减少液体泄漏的机会。 6室温聚合一小时，将玻璃板插入电泳槽中，上紧，倒入TBE缓冲液。 7小心取出梳子，加样。五、注意事项 1严格按照操作步骤进行，并注意不要产生气泡。 2特别注意要封边，防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出 3TEMED最后加入，加入后立即混匀，开始灌胶。六、实验结果 我们制的胶很好，未出现气泡，只是在拔梳子时，用力过猛，点样孔处胶留得较少。七、实验结果
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