ELISA 双抗夹心法检测抗原

《ELISA 双抗夹心法检测抗原》由会员分享，可在线阅读，更多相关《ELISA 双抗夹心法检测抗原（44页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、2021/6/16 1 ELISA 双 抗 体 夹 心 法 检 测 抗 原王 春复 旦 大 学 免 疫 学 系复 旦 大 学 免 疫 生 物 学 研 究 所 2021/6/16 2 酶 联 免 疫 吸 附 实 验 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent A ssay ， ELISA ) 一 种 固 相 酶 免 疫 测 定 技 术 ， 利 用 酶 标 记 的 抗 原 或 者抗 体 ， 在 固 相 载 体 上 定 量 或 定 性 测 定 特 异 性 抗 体 、 可 溶性 抗 原 及 细 胞 表 面 抗 原 。1971年 由 瑞 典 学 者 Engrall和 Perlmann,荷

2、兰 学 者weeman和 Schuurs报 道 ；开 创 了 运 用 酶 标 记 免 疫 技 术 进 行 液 体 标 本 中 微 量 物质 测 定 的 实 验 方 法 ； 2021/6/16 3 ELISA-测 抗 原 （ Ag） 或 抗 体 （ Ab） 三 要 素o 抗 原 或 抗 体 的 固 相 化 ： 已 知 的 Ag/Ab结 合 到 固 相 载 体表 面 ， 并 保 持 其 免 疫 活 性 ；o 抗 原 或 抗 体 的 酶 标 记 ： 酶 标 Ag/Ab,并 保 持 其 免 疫 活 性和 酶 活 性 ；o 底 物 显 色 ： 底 物 被 酶 催 化 成 为 有 色 产 物 定 性 和

3、定 量 放 大 免 疫 反 应 的 信 号 2021/6/16 4 高 度 特 异 性 ： 保 持 抗 原 抗 体 反 应 的 特 异 性高 灵 敏 度 ： 酶 催 化 底 物 显 色 的 高 效 性 ， pg水 平 微 量 检 测定 性 定 量 检 测 ： 反 应 液 颜 色 深 浅 或 光 密 度 值基 本 特 点 2021/6/16 5 抗 体 测 定 法 间 接 法 检 测 特 异 性 抗 体 抗 原 测 定 法 直 接 竞 争 法 检 测 可 溶 性 抗 原 双 抗 体 夹 心 法 检 测 可 溶 性 抗 原 （ 改 良 双 抗 体 夹 心 法 检 测 可 溶 性 抗 原 ） 应 用

4、 生 物 素 -亲 和 素 双 抗 体 夹 心 ELISA法 2021/6/16 6 抗 体 测 定 法 间 接 法 检 测 特 异 性 抗 体 抗 原 测 定 法 直 接 竞 争 法 检 测 可 溶 性 抗 原 双 抗 体 夹 心 法 检 测 可 溶 性 抗 原 （ 改 良 双 抗 体 夹 心 法 检 测 可 溶 性 抗 原 ） 应 用 生 物 素 -亲 和 素 双 抗 体 夹 心 ELISA法 2021/6/16 7 间 接 法 检 测 特 异 性 抗 体包 被 已 知 抗 原 与 待 测 抗 体 孵 育 与 酶 标 抗 体 孵 育 加 入 底 物包 被 已 知 抗 原 2021/6/16

5、 8 优 点 : 只 要 变 换 包 被 抗 原 就 可 利 用 同 一 酶 标 抗 抗 体 建 立 检 测相 应 抗 体 的 方 法 操 作 简 单 迅 捷缺 点 ： 可 重 复 性 差 通 常 用 于 抗 体 效 价 的 检 测 和 某 些 疾 病 的 早 期 诊 断 2021/6/16 9 抗 体 测 定 法 间 接 法 检 测 特 异 性 抗 体 抗 原 测 定 法 直 接 竞 争 法 检 测 可 溶 性 抗 原 双 抗 体 夹 心 法 检 测 可 溶 性 抗 原 （ 改 良 双 抗 体 夹 心 法 检 测 可 溶 性 抗 原 ） 应 用 生 物 素 -亲 和 素 双 抗 体 夹 心

6、ELISA法 2021/6/16 10 直接竞争法 检 测 可 溶 性 抗 原原 理 ： 待 检 抗 原 和 一 定 量 的 酶 标 抗 原 竞 争 与 固 相 抗 体 结 合 ； 待 检 抗 原 含量 愈 多 ， 结 合 在 固 相 上 的 酶 标 抗 原 愈 少 ， 最 后 的 显 色 也 愈 浅 。 2021/6/16 11 优 点 ： 待 检 抗 原 只 需 要 一 个 抗 原 决 定 簇 ， 适 合 小 分 子抗 原 ， 如 ， 激 素 ， 药 物 等 ； 操 作 步 骤 简 单 快 捷 ， 只 需 要 一 个 保 温 洗 涤 过 程缺 点 ： 酶 标 记 抗 体 用 量 大 ； 定

7、 量 检 测 的 灵 敏 度 和 重 复 性 存 在 不 足 。 2021/6/16 12 抗 体 测 定 法 间 接 法 检 测 特 异 性 抗 体 抗 原 测 定 法 直 接 竞 争 法 检 测 可 溶 性 抗 原 双 抗 体 夹 心 法 检 测 可 溶 性 抗 原 （ 改 良 双 抗 体 夹 心 法 检 测 可 溶 性 抗 原 ） 应 用 生 物 素 -亲 和 素 双 抗 体 夹 心 ELISA法 2021/6/16 13改 良 双 抗 夹 心 法 双 抗 夹 心 法 2021/6/16 14 优 点 ： 待 测 抗 原 需 要 2个 抗 原 决 定 簇 ， 所 以 适 合 大 分 子

8、抗原 的 检 测 ， 一 般 在 分 子 量 5000D以 上 ； 由 于 增 加 了 一 层 抗 体 ， 提 高 了 特 异 性 检 测 的 灵 敏 度 ，尤 其 是 改 良 双 抗 夹 心 法 ； 只 要 获 得 针 对 受 检 抗 原 的特 异 性 抗 体 ， 就 可 用 于 包 被 固 相 载 体 和 制 备 酶 结 合物 就 可 以 建 立 此 法 ； 重 复 性 较 好 ；缺 点 ： 操 作 复 杂 ， 费 时 费 力 2021/6/16 15 抗 体 测 定 法 间 接 法 检 测 特 异 性 抗 体 抗 原 测 定 法 直 接 竞 争 法 检 测 可 溶 性 抗 原 双 抗 体

9、 夹 心 法 检 测 可 溶 性 抗 原 （ 改 良 双 抗 体 夹 心 法 检 测 可 溶 性 抗 原 ） 应 用 生 物 素 -亲 和 素 双 抗 体 夹 心 ELISA法 2021/6/16 16 应 用 生 物 素 -亲 和 素 双 抗 体 夹 心 ELISA法（ BA-ELISA法 ） o间接包被o放大终末反应 2021/6/16 17 BA-ELISA原 理 BA-ELISA是 在 常 规 ELISA原 理 的 基 础 上 ， 结 合 生 物 素 (B， biotin)与亲 和 素 (A， avidin)间 的 高 度 放 大 作 用 ， 而 建 立 的 一 种 检 测 系 统 。

10、生 物 素 是 动 植 物 体 内 广 泛 分 布 的 一 种 小 分 子 生 长 因 子 ， 又 名 辅 酶 R或 维生 素 H；亲 和 素 是 卵 白 蛋 白 中 提 取 的 一 种 碱 性 糖 蛋 白 ， 对 生 物 素 有 非 常 高 的 亲和 力 ； （ 链 酶 亲 和 素 是 从 链 霉 菌 中 提 取 ， 对 载 体 吸 附 性 比 前 者 低 ）亲 和 素 与 生 物 素 都 可 与 蛋 白 质 (包 括 抗 原 、 抗 体 、 酶 等 )、 荧 光 素 等 分 子结 合 而 不 影 响 后 者 的 生 物 活 性 ， 是 理 想 的 标 记 剂 ；结 合 了 酶 的 亲 和

11、素 分 子 与 结 合 有 特 异 性 抗 体 的 生 物 素 分 子 产 生 反 应 ， 既 起 到 了 多 级 放 大 作 用 ， 又 由 于 酶 在 遇 到 相 应 底 物 时 的 催 化 作 用 而 呈色 ， 达 到 检 测 未 知 抗 原 (或 抗 体 )分 子 的 目 的 。 2021/6/16 18 实 验 材 料小 鼠 INF-检 测 试 剂 盒 的 组 成 ： Capture Ab： purified anti-mouse IFN- Detection Ab ： biotin-conjugate-anti-mouse IFN- Avidin-conjugate-HRP Sta

12、ndard： recombinant mouse IFN- （ 定 量 测 定 ） Coating buffer 5 Assay diluent TMB solution待 测 样 品 - 经 ConA活 化 的 小 鼠 淋 巴 细 胞 培 养 上 清 2021/6/16 19 ELISA 操 作 要 点p 样 品 的 保 存p 试 剂 的 准 备p 固 相 载 体p 包 被p 加 样p 孵 育 (温 育 ）p 洗 涤p 显 色 和 比 色 2021/6/16 20 样 本 的 制 备 与 保 存 ：血 清 样 品 和 细 胞 培 养 上 清 ： 5天 内 测 定 ， 可 以 放 置 于 4

13、，超 过 一 周 ， -80 保 存 ；ConA活 化 的 小 鼠 淋 巴 细 胞 培 养 上 清 ： 分 别 于 活 化 后 不 同 时 间 点 收 集 培 养 的 细 胞 ， 2000rpm，4 离 心 分 离 上 清 ， 冰 上 放 置 ， 分 装 2021/6/16 21 试 剂 的 准 备 ELISA 中 用 的 蒸 馏 水 或 者 去 离 子 水 ， 包 括 用 于 配 置coating buffer， 稀 释 Assay buffer， 洗 涤 的 ， 应 为 新鲜 的 和 高 质 量 的 ； 从 冰 箱 中 取 出 的 试 剂 应 该 平 衡 至 室 温 后 使 用 ； 试 剂

14、 最 好 现 配 先 用 2021/6/16 22 固 相 载 体 最 常 用 的 是 聚 苯 乙 烯 ： 有 较 强 的 吸 附 蛋 白 质 的 性能 ； 国 际 上 标 准 的 是 微 量 滴 定 板 8 12的 96孔 板 式 ； 已 经 包 被 抗 原 或 者 抗 体 的 固 相 载 体 在 低 温 （ 2-8 ） 干 燥 的 条 件 下 一 般 可 以 保 存 6个 月 。 2021/6/16 23 包 被 定 义 ： 将 抗 原 或 者 抗 体 固 定 在 固 相 载 体 的 过 程 称 为 包被 ； 物 理 吸 附 ： 两 者 的 疏 水 基 团 通 过 疏 水 键 的 作 用

15、抗 体 或 者 蛋 白 质 抗 原 一 般 采 用 pH9.6的 碳 酸 盐 缓 冲 液 作为 稀 释 液 （ 即 本 次 实 验 用 的 coating buffer） 4-8 包 被 过 夜 (有 利 于 蛋 白 活 性 的 保 持 ） ， 与 37 孵 育2小 时 被 认 为 具 有 相 等 的 包 被 效 果 包 被 的 最 适 当 浓 度 随 着 载 体 和 包 被 物 的 性 质 和 酶 结 合物 的 浓 度 调 定 2021/6/16 24 封 闭 定 义 ： 继 包 被 之 后 用 高 浓 度 的 无 关 蛋 白 质 溶 液 再包 被 的 过 程 ； 目 的 ： 抗 原 或 抗

16、 体 包 被 时 所 用 的 浓 度 比 较 低 ， 吸收 后 固 相 载 体 表 面 尚 有 未 被 占 据 的 空 隙 ， 封 闭 就是 让 大 量 的 不 相 关 蛋 白 质 填 充 这 些 空 隙 ， 从 而 排斥 在 ELISA其 后 的 步 骤 中 干 扰 物 质 的 再 吸 附 ； 常 用 封 闭 液 ： 2%牛 血 清 白 蛋 白 ， 10%NBS+5%羊血 清 ， 5%脱 脂 奶 粉 ； 本 实 验 用 封 闭 液 ： 1 Assay buffer。 2021/6/16 25 加 样 ELISA中 一 般 有 3次 加 样 步 骤 ， 即 ， 加 样 本 （ 和/或 标 准

17、品 ） ， 加 酶 结 合 物 ， 加 底 物 ； 加 样 时 应 将 所 加 物 加 在 ELISA板 孔 的 底 部 ， 避免 加 在 孔 壁 上 部 ， 并 注 意 不 可 以 溅 出 ,不 可 以 产生 气 泡 ； 多 道 加 液 器 的 使 用 2021/6/16 26 孵 育 (温 育 ） 在 ELISA中 抗 原 抗 体 反 应 的 完 成 需 要 有 一 定 的 温度 和 时 间 ， 这 一 保 温 的 过 程 称 为 孵 育 ； 常 用 温 度 ： 43 ， 37 ， 室 温 ， 4 等 孵 育 时 为 了 避 免 蒸 发 ， 可 以 用 塑 料 封 口 胶 或 者 保鲜 膜

18、 封 板 2021/6/16 27 洗 涤 洗 涤 在 ELISA中 虽 然 不 是 一 个 反 应 步 骤 ， 但 决 定 了 实 验 的 成 败 聚 苯 乙 烯 等 塑 料 对 蛋 白 的 吸 附 是 普 遍 的 ， 洗 涤 可 以 清除 在 反 应 过 程 中 非 特 异 性 吸 附 于 固 相 载 体 的 干 扰 物 质 洗 涤 可 以 清 除 残 留 在 板 孔 中 没 有 能 够 与 固 相 抗 原 或 者抗 体 结 合 的 物 质 常 加 入 非 离 子 表 面 活 性 剂 （ 含 有 疏 水 基 团 +亲 水 基团 ） ， 以 抑 制 蛋 白 质 吸 附 于 塑 料 表 面 ，

19、 如 吐 温 20，0.05%的 浓 度 比 较 合 适 ， 浓 度 2%会 洗 脱 包 被 在 板 上的 抗 原 或 者 抗 体 2021/6/16 28 洗 涤 方 式 ： 甩 干 孔 内 的 反 应 液 浸 泡 ， 即 将 洗 涤 液 注 满 板 孔 (约 300l） ， 静 置 3min， 浸泡 时 间 不 可 以 随 意 缩 短 ； 甩 去 液 体 后 在 吸 水 纸 上 拍 干 重 复 操 作 2， 3， 洗 涤 次 数 按 要 求 操 作 2021/6/16 29 显 色 和 比 色 显 色 是 ELISA中 的 最 后 一 步 孵 育 反 应 ， 此 时 ， 酶 催 化 无 色

20、 的 底 物 生成 有 色 的 产 物 ； 定 量 实 验 中 ， 加 入 底 物 后 的 反 应 温 度 和 时 间 应 该 按 规定 力 求 准 确 ； 定 性 测 定 的 显 色 时 间 一 般 不 需 要 严 格 控制 和 及 时 判 断 ； 终 止 反 应 ， 防 止 反 应 过 度 ： TMB受 光 照 影 响 不 大 ， 经 HRP作 用 后 ， 40min达 到 高 峰 ； 终 止 液 有 多种 ， 叠 氮 钠 或 SDS等 酶 抑 制 剂 可 以 维 持 蓝 色 12-24h不 褪 色 ； OPD受 光 照 会 自 行 变 色 ， 要 避 光 ， 经 HRP作 用 后 ， 3

21、7 孵 育 20-30min后 颜 色 即 不 再 加 深 ； 常 用 终 止 液 为 2M H2S04； 2021/6/16 30 HRP的 色 原 底 物 系 统 与 HRP反 应后 的 颜 色 加 终 止 液 后的 颜 色 读 数 波 长 特 点OPD临 苯 二 胺 492nm 致 畸 ，但 本 底 好TMB四 甲 基 联 苯胺 450nm 操 作 方 便 ，本 底 较 高 2021/6/16 31 ELISA 数 据 的 处 理 根 据 standard的 浓 度 和 对 应 的 OD值 计 算 出 线 性 方 程 将 所 测 定 样 品 的 OD值 代 入 方 程 计 算 出 相 应

22、 的 样 品 的浓 度 2021/6/16 32 包 被 ： 用 Coating buffer 1:1000稀 释 Capture Ab ， 100ul/孔 ， 湿 盒 4 过 夜 ； 洗 板 ： 弃 去 孔 内 液 体 ， PBST洗 涤 ， 3 3min， 控 干 ； 封 闭 ： 加 1 Assay diluent 200ul/孔 ， 37 避 光 孵 育 2h； 洗 板 ： 弃 去 孔 内 液 体 ， PBST洗 涤 ， 4 3min， 控 干 ；5. 加 样 ： 100ul/孔 ， 37 避 光 孵 育 1h ；6. 洗 板 ： 弃 去 孔 内 液 体 ， PBST洗 涤 ， 4 3m

23、in， 控 干 ；7. Biotin-Detection Ab: 用 1 Assay diluent 1:1000 稀 释 detection Ab ， 100ul/孔 ， 37 避 光 孵 育 1h；8. 洗 板 ： 弃 去 孔 内 液 体 ， PBST洗 涤 ， 4 3min， 控 干 ；9. Avidin-HRP: 用 1 Assay diluent 1:250稀 释 AV-HRP ， 100ul/孔 ， 37 避 光 孵 育 45min；10. 洗 板 ： 弃 去 孔 内 液 体 ， PBST洗 涤 ， 5 3min， 控 干 ；11. 显 色 ： 1 TMB solution， 10

24、0ul/孔 ， 37 孵 育 1-30min；12. 终 止 反 应 ： 显 色 完 全 后 加 2M H 2SO4 50ul/孔 ， 终 止 显 色 反 应 ； 于 450nm处 读 取 光 密 度 OD值 或 吸 光 度 A值 ；13. 绘 制 标 准 曲 线 ， 分 析 数 据 2021/6/16 332.洗 涤 次 日 ， 弃 去 孔 内 液 体 ， 用 0.05%PBST洗 板 3次 （ 将PBST加 入 每 孔 ， 静 置 3min 后 倾 去 ） ， 控 干 ， 洗 去 游 离抗 体 。 湿 盒 中 ， 4 过 夜 酶 标 板1.包 被(Note PBST洗 涤 液 :0.05%

25、 Tween-20 -PH 7.4 1 PBS) 1 Coating buffer 1:1000稀 释 Capture Ab ， 100l/孔 加 入 到 酶 标 板 中 ， 封 口 膜 (或 保 鲜 膜 等 ） 封 闭酶 标 板 后 ， 放 入 湿 盒 中 ， 4 过 夜 。 2021/6/16 34 1 Assay diluent， 200l/孔 加 入 到 酶 标 板 中 ， 封口 膜 封 闭 酶 标 板 后 ， 放 入 湿 盒 中 ， 37 避 光 孵 育2h。4.洗 涤 弃 去 孔 内 液 体 ， 用 0.05%PBST洗 板 4次 ， （ 将PBST加 入 每 孔 ， 静 置 3m

26、in 后 倾 去 ） ； 控 干 ；37 避 光 孵 育 2h3.封 闭（ Note 1 Assay diluent： 用 纯 水 将 5 Assay diluent 稀 释 至 1 ） 以 上 助 教 老 师 负 责 完 成 2021/6/16 35 5. 加 样 -抗 原 与 抗 体 孵 育 1） 制 作 标 准 曲 线 ： 1 Assay diluent 倍 比 稀 释 standard， 每 个 梯 度 各 取 100l加 入酶 标 板 ， 做 复 孔 ； 2） 待 测 样 品 ： 取 100l待 测 样 品 加 入 酶 标 板 ， 做 复 孔 ； 3） 空 白 对 照 ： 取 100

27、l 1 Assay diluent加 入 酶 标 板 ， 做 复 孔 ； 37 避 光 孵 育 1h50ulStandard原 液 1/8 1/16 1/32 2021/6/16 36 待 测 抗 原100l 空 白 对 照阳 性 对 照每 组 4位 同 学 的 加 样 顺 序 ：待 测 抗 原100l 待 测 抗 原100l 样 本 有 4种 ， 每 人 选 一 种 做 复 孔 每 组 做 阳 参 2个 孔 每 组 做 空 白 对 照 2个 孔 （ 加 样 1 Assay buffer）每 孔 加 样 100l 待 测 抗 原100l 2021/6/16 37 6. 洗 板 ： 弃 去 孔

28、内 液 体 ， PBST洗 涤 ， 4 3min， 控 干 ；7.Biotin-Detection Ab: 用 1 Assay diluent 1:1000稀 释 detection Ab ，100 l/孔 ， 37 避 光 孵 育 1h；8. 洗 板 ： 弃 去 孔 内 液 体 ， PBST洗 涤 ， 4 3min， 控 干 ；9. Avidin-HRP(HRP见 光 分 解 ， 之 后 所 有 步 骤 避 光 操 作 ） 用 1 Assay diluent 1:250稀 释 AV-HRP ， 100 l/孔 ， 37 避 光 孵 育 45min；10. 洗 板 ： 弃 去 孔 内 液 体

29、， PBST洗 涤 ， 5 3min， 控 干 ； 2021/6/16 38 11. 显 色 ： 1 TMB solution， 100 l/孔 ， 37 孵 育 1-30min； 12. 终 止 反 应 ： 显 色 完 全 后 加 2M H2SO4 50 l/孔 ， 终 止 显 色 反应 ;450nm处 读 取 光 密 度 0D值 （ 或 者 吸 光 度 A值 ）13. 绘 制 标 准 曲 线 ， 分 析 数 据 2021/6/16 39 n定性实验 显 色 反 应 后 ， 如 液 体 颜 色 变 成 蓝 色 则 为 阳 性 ； 仍 为 无色 液 体 ， 则 待 测 样 品 为 阴 性 20

30、21/6/16 40 n定量实验 1. 标 准 品 和 待 测 样 品 的 OD450值 减 去 空 白 孔 的 OD450值 2. 绘 制 标 准 曲 线 ， 计 算 出 待 测 样 品 浓 度 根 据 绘 制 的 标 准 曲 线 以 及 待 测 样 品 的 OD450值 可 计 算 出待 测 样 品 中 IFN-含 量 ；实 验 报 告 结 果 分 析 要 求 ：绘 制 标 准 曲 线 ， 计 算 出 待 测 样 品 浓 度 ？ ？标 准 品 （ 原 液 ） 浓 度 为 2000pg/ml 2021/6/16 41 读 板 结 果 我 通 过 EXCELL上 传 到 公 用 邮 箱 ， 请

31、 大家 记 住 自 己 的 样 本 所 在 的 编 号 ， 以 方 便 查 询 2021/6/16 42 注 意 事 项u加 样 ： 悬 空 加 样 ， Tips不 可 以 接 触 酶 标 板 ， 及 时 更 换Tips;将 所 加 物 加 在 ELISA板 孔 的 底 部 ， 并 注 意 不 可 溅 出 ，不 可 产 生 气 泡 。u洗 板 ： 每 次 洗 液 加 入 后 ， 应 静 置 3分 min使 清 洗 更 加 彻底 。 末 次 洗 板 尽 量 将 水 甩 干 。u液 体 全 部 加 完 后 ， 可 将 酶 标 板 在 桌 子 上 平 行 轻 轻 晃 动30秒 ， 混 匀 液 体 。u底 物 有 毒 性 ， 终 止 液 对 皮 肤 有 腐 蚀 性 ， 尽 量 避 免 接 触 。 2021/6/16 43 Thanks for your attention! 若 有 不 当 之 处 ， 请 指 正 ， 谢 谢 ！