《微阵列分析导论》PPT课件

《《微阵列分析导论》PPT课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《《微阵列分析导论》PPT课件（41页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、生 物 芯 片 原 理 与 技 术 课 程 学 时 安 排u学 时 ： 50学 时u安 排 ： 讲 课 34学 时 ， 实 验 16学 时u学 分 ： 3分u成 绩 ： 考 试 占 70 ， 实 验 和 出 勤 占 30 生 物 芯 片 相 关 书 籍 et al. 2005 在 许 多 情 况 下 ， 生 物学 问 题 最 终 的 解 决 都源 于 技 术 上 的 突 破 。 Mark Schena 本 书 共 分 为 十 六 章 ， 分 届 于 三 大 部分 ， 第 一 部 分 为 基 础 知 识 ， 包 括 概 述 、微 阵 列 基 因 芯 片 制 备 和 检 测 技 术 以 及 统计

2、学 基 础 ； 第 二 部 分 内 容 是 数 据 处 理 方法 ， 包 括 实 验 设 计 、 图 像 的 获 得 和 数 据的 前 处 理 、 数 据 的 须 处 理 和 归 一 化 、 差异 表 达 基 因 分 析 、 芯 片 数 据 的 可 靠 性 分析 、 聚 类 分 析 和 可 视 化 以 及 微 阵 列 实 验中 的 分 类 方 法 ； 第 三 部 分 主 要 是 与 数 据挖 掘 和 应 用 相 关 的 内 容 ， 包 括 微 阵 列 技术 的 标 难 化 、 基 因 芯 片 数 据 的 基 因 注 释和 功 能 分 析 、 系 统 生 物 学 及 基 因 调 控 网 络 、

3、基 因 芯 片 技 术 的 应 用 从 基 因 筛选 到 临 床 诊 断 、 主 要 数 据 分 析 软 件 的 介绍 和 展 望 。 芯 片 打 印 仪 芯 片 杂 交 仪 芯 片 扫 描 仪 生 物 芯 片 技 术 简 介u 每 个 组 织 和 细 胞 中 包 含 各 种 生 物 大 分 子 ， 如 蛋 白 质 、 DNA和 RNA， 为 了 解 生 物 大 分 子 与 生 命 现 象 的 关 系 ， 需 要 研 究 生 物 中 所 有 不 同种 类 蛋 白 质 和 核 酸 的 功 能 ， 而 传 统 检 测 方 法 一 次 只 能 检 测 一 个 生 物大 分 子 ， 生 物 芯 片 技

4、 术 提 供 了 高 通 量 检 测 生 物 大 分 子 的 方 法 。u 生 物 芯 片 ： 把 生 物 活 性 大 分 子 （ 如 蛋 白 质 和 核 酸 ） 或 细 胞 等 ， 密 集排 列 在 固 定 的 固 相 载 体 上 ， 形 成 微 型 的 检 测 器 件 ， 固 相 载 体 通 常 是硅 片 、 玻 片 、 聚 丙 烯 或 尼 龙 膜 等 。u 狭 义 ： 微 阵 列 芯 片 ， 主 要 包 括 cDNA微 阵 列 、 寡 核 苷 酸 微 阵 列、 蛋 白 质 微 阵 列 和 小 分 子 化 合 物 微 阵 列 等 u 广 义 ： 能 对 生 物 成 分 或 生 物 分 子

5、进 行 快 速 并 行 处 理 和 分 析 的 厘米 见 方 的 固 体 薄 型 器 件 ， 主 要 还 包 括 微 流 体 芯 片 和 “ 芯 片 实 验 室 ”。 生 物 芯 片 主 要 特 点u 微 型 化u 自 动 化u 网 络 化 生 物 芯 片 类 型u基 因 芯 片 gene chipu蛋 白 质 芯 片 protein chipu组 织 芯 片 tissue microarrayu微 流 体 芯 片 和 缩 微 芯 片 实 验 室 微 阵 列 (microarray):是 一 种 平 面 的 基 质 载 体 ， 它上 面 规 则 地 、 特 异 性 地 吸 附 着 基 因 或

6、基 因 产 物 。细 胞 什 么 是 微 阵 列 ？ 微 阵 列 芯 片 基 因 表 达 资 料mRNA 对 mRNA进 行 标 记杂 交 定 量 H ow? 靶 标 标 记 探 针genemRNA 微 阵 列 分 析u 微 阵 列 分 析 （ microarray analysis):利 用 微 阵 列 芯 片通 过 一 些 实 验 步 骤 来 研 究 生 物 、 化 学 及 物 理 方 面 的 问 题 。u在 微 阵 列 分 析 中 ， 从 细 胞 中 抽 提 得 到 mRNA， 把 mRNA进行 荧 光 标 记 ， 然 后 和 含 有 基 因 序 列 的 玻 璃 芯 片 进 行 杂 交

7、。芯 片 上 每 个 点 能 和 杂 交 液 中 的 荧 光 标 记 的 特 异 性 cDNA杂交 ， 使 得 每 个 点 的 荧 光 信 号 和 基 因 表 达 的 丰 度 成 正 相 关 。u能 够 在 基 因 组 规 模 上 对 基 因 表 达 谱 、 患 者 基 因 型 、 药 物 代谢 、 疾 病 的 发 生 和 进 展 过 程 进 行 快 速 和 定 量 的 分 析 。 u应 用 领 域 ： 医 学 、 农 业 、 食 品 微 阵 列 的 起 源u生 物 芯 片 是 随 人 类 基 因 组 计 划 启 动 和 实 施 应 运 而 生 ；u1991年 Fodor等 人 首 先 提 出

8、 DNA芯 片 的 概 念 ；u1991年 Affymetrix率 先 生 产 世 界 上 第 一 块 基 因 芯 片 ；u1995年 第 一 块 以 玻 璃 为 载 体 的 基 因 芯 片 在 美 国 斯 坦 福 大学 P.O.Brown实 验 室 诞 生 ， 由 Schena及 其 同 事 研 究 出来 的 。 目 的 是 研 究 拟 南 芥 的 转 录 因 子 ， 从 而 快 速 而 准 确 的研 究 植 物 的 基 因 表 达 过 程 ， 标 志 着 生 物 芯 片 技 术 步 入 广 泛研 究 和 应 用 时 期 ；u生 物 芯 片 技 术 已 成 为 功 能 基 因 组 研 究 中

9、 最 基 本 的 实 验 手 段 基 因 芯 片 技 术 的 产 生 和 发 展uDNA体 外 聚 合u重 组 DNA技 术uPCR（ 聚 合 酶 链 反 应 ） 技 术uDNA杂 交 技 术 核 酸 分 子 固 相 杂 交 方 法u菌 落 原 位 杂 交 （ Colony in situ hybridization）uSouthern印 迹 杂 交 （ Southern blot）uNorthern印 迹 杂 交 （ Northern blot）u斑 点 杂 交 （ Dot blot）u组 织 原 位 杂 交 （ Tissue in situ hybridization）u反 向 杂 交 ，

10、 基 因 芯 片 的 前 身 探 针u探 针 标 记 放 射 性 同 位 素 标 记 ， 125I、 32P、 33P和 35Su非 放 射 性 标 记 荧 光 法 ， 化 学 发 光 法 ， 电 化 学 发 光 法 ， 生 物 发光 ， 显 色 法u探 针 种 类 （ Probe type） 基 因 组 探 针 cDNA探 针 寡 聚 核 苷 酸 探 针 （ Oligo） 探 针 的 来 源uDNA探 针 根 据 其 来 源 有 3种 ：u一 种 来 自 基 因 组 中 有 关 的 基 因 本 身 ， 称 为 基 因 组 探 针 （genomic probe） ；u另 一 种 是 从 相 应

11、 的 基 因 转 录 获 得 了 mRNA， 再 通 过 逆 转录 得 到 的 探 针 ， 称 为 cDNA 探 针 （ cDNA probe） 。 与基 因 组 探 针 不 同 的 是 ， cDNA探 针 不 含 有 内 含 子 序 列 。u此 外 ， 还 可 在 体 外 人 工 合 成 碱 基 数 不 多 的 与 基 因 序 列 互 补的 DNA片 段 ， 称 为 寡 核 苷 酸 探 针 。 微 阵 列 是 如 何 定 义 的 ？u 微 阵 列 必 须 符 合 ： 有 规 则 的 ； 显 微 尺 度 的 ； 平 面 的 ； 特 异 性 的 。 吸 附 在 玻 璃 基 片 上 的 靶 标 D

12、NA分 子 。 单 链 的 靶 标 DNA分 子 和 溶 液 中荧 光 素 标 记 的 探 针 发 生 杂 交 结 合 ， 使 得 芯 片 上 的 点 呈 现 出 荧 光 信 号 ， 信号 的 强 度 和 对 应 的 基 因 表 达 水 平 成 正 相 关 ， 荧 光 信 号 的 强 度 按 照 彩 色 模式 来 赋 予 不 同 的 颜 色 ， 基 因 的 表 达 情 况 能 够 通 过 检 测 芯 片 上 不 同 位 置 的荧 光 信 号 来 定 量 。 规 则 的 微 阵 列 规 则 的 阵 列 是 指 阵 列 上 待 分 析 的 单 元 按 照 行 和 列 的 方 式 进 行 排 列 的

13、 集 合 微 阵 列 上 的 点 按 照 行 和 列 规 则 地 排 列 而 非 无 规 则 排 列 ； 点 的 大 小 和 点 间距 均 一 而 非 不 均 一 ； 点 的 位 置 明 确 而 非 模 棱 两 可 。 微阵列定义 显 微 尺 度 的 点u显 微 尺 度 （ microscopic):是 一 个 物 体 若 没 有 显 微 镜 的帮 助 ， 不 能 清 楚 地 被 看 见 。 一 般 以 小 于 1mm为 界 。u微 阵 列 ： 光 引 导 原 位 合 成 的 点 ： 15 30m 点 制 的 点 ： 50 350m 组 织 芯 片 的 点 ： 200 600m微阵列定义 平

14、面 基 片u平 面 基 片 是 像 玻 璃 、 塑 料 、 硅 片 一 样 平 行 不 能 弯 曲 的 基质 载 体 。 玻 片 是 微 阵 列 中 用 得 最 为 广 泛 的 基 质 载 体 。u非 平 面 基 片 ： 尼 龙 膜 、 硝 酸 纤 维 素 膜 等 。u平 坦 的 表 面 优 点 ： 适 合 大 规 模 自 动 化 生 产 ； 为 光 掩 膜 、接 触 式 针 点 样 、 喷 墨 式 非 接 触 点 样 和 其 它 制 备 工 序 提 供 了精 密 的 距 离 ， 确 保 制 备 微 阵 列 的 高 质 量 ； 使 扫 描 和 成 像 变得 容 易 。微阵列定义 特 异 性 吸

15、 附u 微 阵 列 上 的 每 一 个 点 能 与 标 记 好 的 探 针 混 合 物 中 的 一 种分 子 发 生 吸 附 ， 才 能 对 此 基 因 或 基 因 产 物 进 行 精 确 的 检 测微阵列定义 u探 针 混 合 物 中 一 种 标 记 好 的 探 针 分 子 能 和 cDNA微 阵 列 芯片 上 唯 一 的 一 个 cDNA靶 标 进 行 杂 交 ， 或 者 与 寡 聚 核 昔 酸微 阵 列 芯 片 上 的 一 组 相 应 的 寡 聚 核 苷 酸 进 行 杂 交 。 含 有 短的 寡 聚 核 苷 酸 阵 列 上 的 靶 标 和 单 一 的 探 针 分 子 杂 交 时 常 会产

16、 生 不 能 分 辨 的 多 个 杂 交 信 号 。 微 阵 列 的 类 别 实 验 设 计 每 次 微 阵 列 分 析 实 验 应 该 包 括 阳 性 对 照 、 阴 性 对 照 和实 验 对 象u阳 性 对 照 是 指 在 微 阵 列 上 的 点 ， 不 管 实 验 对 象 得 到 的 是 什么 样 的 结 果 ， 这 些 点 都 能 产 生 可 按 识 别 的 信 号 。 阳 性 对 照产 生 的 可 识 别 信 号 极 大 地 改 善 了 评 估 实 验 数 据 的 能 力 ， 特别 在 实 验 对 象 得 到 阴 性 结 果 时 尤 显 突 出 。 阳 性 对 照 得 到 了强 烈

17、信 号 后 ， 就 能 排 除 对 实 验 失 败 的 错 误 解 释 ， 例 如 可 排除 问 题 出 在 杂 交 、 清 洗 、 扫 描 或 数 据 分 析 的 步 骤 上 。 只 有阳 性 对 照 中 也 末 产 生 可 识 别 的 信 号 ， 才 能 对 微 阵 列 分 析 的阴 性 结 果 下 一 个 确 切 的 结 论 。 u 阴 性 对 照 是 指 在 微 阵 列 上 的 点 ， 不 管 实 验 对 象 得到 的 是 什 么 样 的 结 果 ， 这 些 点 都 不 能 产 生 信 号 。阴 性 对 照 能 排 除 或 减 小 非 特 异 性 反 应 (如 染 色 和 交叉 杂 交

18、 )带 来 的 信 号 而 增 加 实 验 数 据 的 可 信 度 。 若分 析 时 没 有 阴 性 对 照 做 参 考 而 对 微 阵 列 分 析 实 验下 结 论 是 一 件 很 冒 险 的 事 。u实 验 对 象 是 指 在 实 验 中 要 寻 找 的 新 信 息 。 这 些 信息 包 括 基 因 表 达 谱 、 基 因 型 、 其 他 生 物 过 程 或 途径 。 Expression profiling with DNA microarrayscDNA “A”Cy5 labeled cDNA “B”Cy3 labeledHybridization ScanningLaser 1 La

19、ser 2+ Analysis Image Capture A yellow spot a gene that hybridized to both green and red cDNA: expressed both in healthy cells and cancer cells! 实 验 设 计 生 物 学 问 题“ 根 和 叶 的 基 因表 达 有 和 不 同 ？ ” 样 品 制 备mRNA分 离 、 探 针 标 记 、PCR、 微 阵 列 点 制生 化 反 应 杂 交 、 基 片 处 理 、 封 闭 、 清 洗检 测选 择 荧 光 通 道 、 激 光设 置 、 生 成 图 像数 据

20、 分 析 和 建 立 模 型数 据 定 量 、 计 算 比 率 、聚 类 分 析 微阵列分析的五个步骤 基 因 芯 片 的 数 据 挖 掘 微 阵 列 分 析 的 一 些 应 用u发 育u人 类 疾 病u药 物 研 发u遗 传 筛 选 和 诊 断 微 阵 列 分 析 能 用 于 检 测 不 同 组 织 中 的 基 因 表 达 谱 。基 因 表 达 的 信 号 强 度 按 照 彩 虹 图 模 式 来 显 示 ， 高 水 平 表达 用 红 色 表 示 ， 低 水 平 用 黑 色 表 示 。微阵列分析应用发 育 微阵列分析应用人 类 疾 病 正 常 人 和 阿 尔 茨 海 默 症 患 者 的 脑 组

21、 织 样 品 用 微 阵 列技 术 进 行 定 量 分 析 后 显 示 了 一 个 在 患 者 脑 组 织 中 表 达上 调 的 基 因 。 这 个 基 因 可 能 与 疾 病 的 发 生 有 关 。 微阵列分析应用药 物 研 发 疾 病 发 生 伴 随 着 一 个 基 因 被 激 活 和 两 个 基 因 受 抑 制 。 用A药 物 处 理 后 ， 变 化 异 常 的 基 因 回 复 到 正 常 水 平 。 用 B药 物处 理 后 ， 原 来 变 化 异 常 的 基 因 表 达 也 回 复 到 正 常 水 平 ， 但 又 两 个 新 的 基 因 受 到 抑 制 ， 预 示 B药 物 可 能 存

22、 在 副 作 用 总 结u微 阵 列 分 析 是 20世 纪 90年 代 早 期 发 展 的 一 项 革 命 性 新 技术 。 该 技 术 使 用 了 微 型 化 （ 微 阵 列 芯 片 ） 来 对 基 因 和 基 因产 物 做 定 量 的 分 析 。 有 较 高 的 分 析 速 度 和 较 好 的 分 析 精 度， 可 一 次 分 析 人 的 整 个 基 因 组 ， 在 10min内 定 量 获 得 3万多 个 基 因 的 表 达 情 况 。u其 发 展 历 史 可 追 溯 到 20世 纪 50年 代 ， 期 间 包 括 发 现 DNA聚 合 酶 、 重 组 DNA技 术 和 PCR技 术

23、。u具 有 网 络 化 、 微 型 化 和 自 动 化 特 点 。u主 要 包 括 五 个 步 骤 。 u可 用 于 发 育 、 人 类 疾 病 、 药 物 发 现 、 诊 断 等 研 究 。 CGH比 较 基 因 组 杂 交 技 术u是 一 种 将 消 减 杂 交 、 荧 光 染 色 体 原 位 杂 交 （fluorescence in situ hybridization FISH） 相 结 合， 用 于 检 测 待 测 组 织 DNA顺 序 拷 贝 数 目 的 变 化 （ 缺 失 、 扩增 、 复 制 ） ， 并 将 这 些 异 常 在 染 色 体 上 定 位 的 方 法 。 将 不同

24、基 因 组 DNA分 别 用 不 同 颜 色 （ 绿 、 红 ） 的 荧 光 标 记 后 ，等 比 例 一 同 与 染 色 体 杂 交 ， 扫 描 不 同 染 色 体 上 两 种 颜 色 的比 率 变 化 ， 来 判 断 该 处 存 在 缺 失 或 扩 增 。 CGH法 是 消 减 杂交 策 略 各 方 法 中 唯 一 不 能 直 接 获 得 基 因 片 段 的 方 法 ， 其 优点 是 CGH在 一 次 实 验 中 即 可 对 整 个 基 因 组 进 行 检 测 ， 节 省了 操 作 步 骤 ， 并 能 将 检 测 出 的 异 常 DNA序 列 在 染 色 体 上 定位 ， 便 于 进 一 步 筛 选 相 关 基 因 。 其 缺 点 是 不 能 显 示 染 色 体易 位 、 倒 位 及 其 他 不 改 变 DNA拷 贝 数 目 的 异 常 ， 并 且 该 法的 稳 定 性 和 重 复 性 有 待 于 提 高 。