霍奇金淋巴瘤实验设计 ppt课件

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1、Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,,,‹#›,研究背景,,霍奇金淋巴瘤（,Hodgkin’s lymphoma,，,HL,，,Hodgkin’s disease,，）是,恶性淋巴瘤,的一个独特类型。,,研究背景,其特点为：①临床上病变往往从一个或一组淋巴结开始，逐渐由邻近的淋巴结向远处扩散。原发于结外淋巴组织的少见。,研究背景,②,瘤组织成分多样，但,HL,特异性的病理改变为,——,大量反应性增生的

2、背景淋巴细胞中可见少于,1%Reed-Sternberg,细胞（,R-S,细胞）。,,,,,这种特殊的瘤巨细胞来源于,B,淋巴细胞,(,镜影细胞,),研究背景,p53,和,bcl-2,基因突变,,,,,EB,病毒感染,但证据均不足，,HL,的发病机制,尚未明确,肿瘤细胞,,,,研究背景,有研究发现,NF-κB (RelA/P50),的组成性激活是霍奇金淋巴瘤细胞的特点。,[1],IκBα,作为重要的,NF-κB,通路,抑制因子，在多种瘤细胞中表达量均减少。,,,研究背景,将对,IκBα,激酶 （,IκBα kinase, IKK,）无反应的,IκBα,突变体导入,HRS,细胞中可阻断,NF-κ

3、B,的活化，导致细胞凋亡，说明,IκBα,在,HL,发病机制中有重要作用。,[2],,,研究背景,Emmerich,等人的研究表明,HRS,细胞中,IκBα mRNA,高表达，但在蛋白水平检测的阳性强度弱，可能与,HL,中泛素化降解活性增强有关，也可能由,IκBα,蛋白结构改变导致。,[3],,研究目的,本实验意在：,①了解,IκBα,基因在,HL,中突变的情况；,②分析经典型,HL HRS,中,IκBα,突变的特点、可能造成的蛋白结构异常；,③以及这些异常的病理意义，即其与,HL,发病的相关性。,实验材料与试剂,霍奇金淋巴瘤组织样本,CD30,单抗,（,Dako,公司，克隆号,Ber,—,H

4、2,，效价,1,：,20,）,Leica ASLMD,激光显微,系统,PCR,引物,（,北京赛百胜公司,）,PCR,仪（包括反应体系）,DNA,测序仪,,实验流程,CD30,免疫组化,,激光显微切割和,DNA,提取,,IκBα,基因扩增,,PCR,产物检测,,待测基因外含子,测序,,,CD30,免疫组化,,采用,EnVision,两步法,。,将冰冻组织切成,6,μ,m,厚连续切片，贴于,Leica PEN,膜空白切片上，用含,0,．,05,％,NP40,的丙酮,(v,／,v),固定,10 min,，室温下自然干燥；,,CD30,免疫组化,6,％,H2O2-,甲醇，,37,℃,10 min,，消

5、除内源性过氧化物酶；,,加,1,：,20,稀释的一抗；,,加相应的二抗，,DAB,显色，苏木精复染，盐酸乙醇分化，充分水洗。,,,激光显微切割和,DNA,提取,用,Leica ASLMD,系统逐个切割组织切片上的,CD30,阳性细胞,（,切割参数：激光强度,37,，波长,377,，速度,5,，光束直径,8,）,。,,将目的细胞从切片上分离，在光压强作用下被收集到离心管盖内，每例标本,3,～,6,组，每组约,25,～,70,个细胞。,,切割周围的正常淋巴细胞每例,2,管，,每管约,50,个细胞。,,,,,扩增目的基因，上游引物：,5,’,-CACACTGTGCCCATCTACG-3,’，下游引物

6、：,5,’一,GGTc1-ITI,’,GCGGATGTCCAC,一,3,’,。,,（缓冲体系：,10X,反应缓冲液,2,．,5,μ,l,，,MgCL,2,(25 mmol,／,L)1,．,5,μ,l,，,dNTP(10 mmoL,／,L)1,．,0,μ,l,，上游引物,(10~,μ,moL,／,L)0,．,5,μ,l,，下游引物,(10,μ,mol,／,L)0,．,5,μ,l,，,Taq,酶,(5 U,／ μ,L)0,．,3,μ,l,，,,模板,2,．,0,μ,l,，总体积,25,μ,l,。反应条件：,94,℃预变性,5 min,，,94,℃变性,1 min,，,55,％退火,1 min,，,

7、72oC,延伸,1 min,，共,40,个循环，,72,℃延伸,7min,，至,4,℃结束。,,以双蒸水代替,DNA,模板作为阴性对照。）,,IκBα,基因扩增,对,HRS,细胞、背景中反应性增生细胞的,IκBα,6,个外显子进行半巢式,PCR,扩增。,,用已知,IκBα,外显子,PCR,扩增阳性的标本为模板作阳性对照，用双蒸水作为阴性对照。,,,,,,,,,这种特殊的瘤巨细胞来源于B淋巴细胞 (镜影细胞),IκBα基因没有参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化,对HRS细胞、背景中反应性增生细胞的IκBα 6个外显子进行半巢式PCR扩增。,J Clin Invest, 1997, 100 (12):

8、2961-9.,将目的细胞从切片上分离，在光压强作用下被收集到离心管盖内，每例标本3～6组，每组约25～70个细胞。,6％ H2O2-甲醇，37℃ 10 min，消除内源性过氧化物酶；,Oncogene, 1999, 18(16):2567-77.,Overexpression of I kappa B alpha without inhibition of NF-kappaB activity and mutations in the I kappaB alpha gene in Reed-Sternberg cells [J].,取5 μ l PCR产物，用2％琼脂糖凝胶电泳分析，稳流12

9、0 mA，20 min。,如果在800-1600之间，那么就要同时进行正反向测序才能测出你的片段（因为一个方向上的测序结果最好也只能保证800bp以内是可信的）,切割周围的正常淋巴细胞每例2管，,PCR仪（包括反应体系）,用Leica ASLMD系统逐个切割组织切片上的CD30阳性细胞（切割参数：激光强度37，波长377，速度5，光束直径8）。,反应条件：预变性95℃ ，5min，继而95℃变性50 s，65℃退火30 s，72℃延伸90 S，共35个循环，最后72℃延伸10 min。,有研究发现NF-κB (RelA/P50)的组成性激活是霍奇金淋巴瘤细胞的特点。,加相应的二抗，DAB显色，

10、苏木精复染，盐酸乙醇分化，充分水洗。,反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，55％退火1 min，72oC延伸1 min，共40个循环，72℃延伸7min，至4℃结束。,每管DNA样品都要扩增2次，使用上海博亚公司ABI377DNA测序仪对PCR阳性产物进行直接测序。,在这种技术中，首先用一对外引物进行第1轮PCR，然后再使用第1对引物扩增的DNA序列内部的一对引物再次扩增，所以称为巢式PCR。,激光显微切割和DNA 提取,PCR,扩增反应体系,扩增,IκBα,第一和第二外显子反应体系：,10 X PCR,缓冲液,5,．,0,μ,1,，,MgC1,：,(25mmoi,／,L)

11、5,．,0,μ,Ixl,，,dNTPs(10 mmol,／ μ,L)2,．,0,μ,l,，,DMSO2,．,0,μ,l,，,Taq DNA,聚合酶,(5 U,／,pJ)1,．,0,μ,l,，,DNA,模板,(0,．,5 g,／,IL1)2,．,0,μ,l,，扩增第一外显子时加引物,1,μ,Ixl,；扩增第二外显子时加引物,0,．,3,μ,l,，补所需,ddH2O,使反应体系达到,50,μ,I,。反应条件：预变性,95,℃ ，,5min,，继而,95,℃变性,50 s,，,65,℃退火,30 s,，,72,℃延伸,90 S,，共,35,个循环，最后,72,℃延伸,10 min,。第二轮，反应体系

12、,50,μ,l,，扩增第一和第二外显子时加引物,1,．,25,μ,l,。扩增第一外显子时另加,2,μ,l DMSO(,扩增第二外显子时不加,DMSO),。反应条件同第一轮。,,扩增,IκBα,第三到第六外显子反应体系,：,,第一轮，,l0,×,PCR,缓冲液,5,．,0,μ,Ixl,，,MgCL,2,(25 mmol,／,L)4,．,0 l,，,dNTPs(10 mmol,／,L)2,．,0 l,，,Taq DNA,聚合酶,(5 U,／ μ,L)1,．,0,μ,l,，,DNA,模板,(0,．,5,μ,g,／,,μ,L)2,．,0,μ,l,，引物,1,μ,l,。反应条件同扩增一、二外显子者，但退

13、火温度为,63,℃。第二轮，反应体系同第一轮，但扩增引物为,1,．,25,μ,L,。反应条件为预变性,95,℃ ，,5 min,，继而,95,℃变性,50 S,，,65,℃退火,30 S,，,72 oC,延伸,90 S,，共,35,个循环，最后,72,℃延伸,10 min,。）,,PCR,产物检测,取,5,μ,l PCR,产物，用,2,％琼脂糖凝胶电泳分析，稳流,120 mA,，,20 min,。,,紫外灯下观察。,,IκBα,的,6,个外显子阳性扩增产物大小分别为,exon1(476bp),、,exon2(433bp),、,exon3(399bp),、,exon4(184bp),、,exon

14、5(381bp),和,exon6(441bp),。,,,,,预期结果,——,电泳,电泳条带不在同一水平线上,——,基因明显突变。,,预期结果,——,电泳,电泳条带在同一水平线上。,没有突变,点突变或分子量很小的碱基序列突变,,待测基因外含子,测序,,每管,DNA,样品都要扩增,2,次，使用上海博亚公司,ABI377DNA,测序仪对,PCR,阳性产物进行直接测序。,,预期结果,——,测序,碱基序列出现改变,图,A-,箭头处为,T-A,突变（,TGA,为终止密码）,图,B-,反向测序证实,（蓝色,-C,,红色,-T,，绿色,-A,，黑色,-G,）,预期结果,碱基序列没有突变,C,、,D,分别为没有

15、突变的正、反向测序,预期结果,肿瘤细胞,I,κ,B,α,基因突变率高，而反应性增生的淋巴细胞,I,κ,B,α,基因没有突变。,,肿瘤细胞和反应性增生的淋巴细胞的,I,κ,B,α,基因都没有突变。,,肿瘤细胞和反应性增生的淋巴细胞的,I,κ,B,α,的突变率都增加,,IκBα,基因参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化有关,,IκBα,基因没有参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化,,,,,,,,估计不会发生这种情况，如若发生则需要进一步研究,,参考文献,[1] Bargou R.C,,et al,. Constitutive nuclear factor-kappaB-RelA activation is req

16、uired for proliferation and survival of Hodgkin’s disease tumor cells [J].,J Clin Invest,, 1997, 100 (12): 2961-9.,[2] Dejardin E,,et al,. Regulation of NF-kappaB activity by IkappaB-related proteins in adenocarcinoma cells [J].,Oncogene,, 1999, 18(16):2567-77.,[3] Emmerich F,,et al,. Overexpression

17、 of I kappa B alpha without inhibition of NF-kappaB activity and mutations in the I kappaB alpha gene in Reed-Sternberg cells [J].,Blood,, 1999, 94(9): 3129-34.,……,Thank you,！,,J Clin Invest, 1997, 100 (12): 2961-9.,肿瘤细胞和反应性增生的淋巴细胞的IκBα的突变率都增加,Regulation of NF-kappaB activity by IkappaB-related prot

18、eins in adenocarcinoma cells [J].,IκBα基因没有参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化,采用EnVision两步法。,激光显微切割和DNA 提取,每管DNA样品都要扩增2次，使用上海博亚公司ABI377DNA测序仪对PCR阳性产物进行直接测序。,电泳条带在同一水平线上。,EnVision两步法,IκBα基因没有参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化,IκBα基因没有参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化,C、D分别为没有突变的正、反向测序,Regulation of NF-kappaB activity by IkappaB-related proteins in adenocarcin

19、oma cells [J].,[1] Bargou R.,Overexpression of I kappa B alpha without inhibition of NF-kappaB activity and mutations in the I kappaB alpha gene in Reed-Sternberg cells [J].,第二轮，反应体系50 μ l，扩增第一和第二外显子时加引物1．25 μ l。,电泳条带在同一水平线上。,激光显微切割和DNA 提取,这种特殊的瘤巨细胞来源于B淋巴细胞 (镜影细胞),点突变或分子量很小的碱基序列突变,巢式,PCR,巢式聚合酶链反应,(n

20、ested polymearse chain reaction, nPCR),也称套式,PCR,。,在这种技术中，首先用一对外引物进行第,1,轮,PCR,，然后再使用第,1,对引物扩增的,DNA,序列内部的一对引物再次扩增，所以称为巢式,PCR,。为了经济节约，可在第,2,轮扩增时采用,半巢式，,设计单条引物，另一条引物与第,1,轮扩增共用，。,反向测序,一个是,正向引物（上游引物），,用它来测序就是正向测序,(,从上游往下测序,),，也就是,5',到,3',另外一个就是,反向引物（下游引物,），用它来测序就是反向测序（从下游往上测序），也就是,3',到,5',如果片段在,800,以内，那么随

21、便进行一个方向就能测出你全部的序列了,如果在,800-1600,之间，那么就要同时进行正反向测序才能测出你的片段（因为一个方向上的测序结果最好也只能保证,800bp,以内是可信的）,,EnVision,两步法,,DAKO EnVision,显色系统是将二抗和酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体（即,EnVision,）直接放大信号,40-50,倍，把传统的二抗、三抗分别孵育合为一次孵育。特点：敏感、省时、方便、背景低（避免了内源性生物素干扰）。,,CD30,免疫组化,,采用,EnVision,两步法,。,将冰冻组织切成,6,μ,m,厚连续切片，贴于,Leica PEN,膜空白切片上，用含,

22、0,．,05,％,NP40,的丙酮,(v,／,v),固定,10 min,，室温下自然干燥；,,CD30,免疫组化,6,％,H2O2-,甲醇，,37,℃,10 min,，消除内源性过氧化物酶；,,加,1,：,20,稀释的一抗；,,加相应的二抗，,DAB,显色，苏木精复染，盐酸乙醇分化，充分水洗。,,,预期结果,——,电泳,电泳条带在同一水平线上。,没有突变,点突变或分子量很小的碱基序列突变,,参考文献,[1] Bargou R.C,,et al,. Constitutive nuclear factor-kappaB-RelA activation is required for prolife

23、ration and survival of Hodgkin’s disease tumor cells [J].,J Clin Invest,, 1997, 100 (12): 2961-9.,[2] Dejardin E,,et al,. Regulation of NF-kappaB activity by IkappaB-related proteins in adenocarcinoma cells [J].,Oncogene,, 1999, 18(16):2567-77.,[3] Emmerich F,,et al,. Overexpression of I kappa B alp

24、ha without inhibition of NF-kappaB activity and mutations in the I kappaB alpha gene in Reed-Sternberg cells [J].,Blood,, 1999, 94(9): 3129-34.,……,Thank you,！,,Oncogene, 1999, 18(16):2567-77.,PCR仪（包括反应体系）,[1] Bargou R.,扩增第一外显子时另加2 μ l DMSO(扩增第二外显子时不加DMSO)。,点突变或分子量很小的碱基序列突变,[3] Emmerich F, et al.,扩增I

25、κBα第一和第二外显子反应体系：,第二轮，反应体系50 μ l，扩增第一和第二外显子时加引物1．25 μ l。,切割周围的正常淋巴细胞每例2管，,PCR仪（包括反应体系）,（缓冲体系：10X反应缓冲液2．5 μ l，MgCL2(25 mmol／L)1．5 μ l，dNTP(10 mmoL／L)1．0 μ l，上游引物(10~ μ moL／ L)0．5 μ l，下游引物(10 μ mol／L)0．5 μ l，Taq酶(5 U／ μL)0．3 μ l，,对HRS细胞、背景中反应性增生细胞的IκBα 6个外显子进行半巢式PCR扩增。,（缓冲体系：10X反应缓冲液2．5 μ l，MgCL2(25 mm

26、ol／L)1．5 μ l，dNTP(10 mmoL／L)1．0 μ l，上游引物(10~ μ moL／ L)0．5 μ l，下游引物(10 μ mol／L)0．5 μ l，Taq酶(5 U／ μL)0．3 μ l，,IκBα的6个外显子阳性扩增产物大小分别为exon1(476bp)、 exon2(433bp)、 exon3(399bp)、 exon4(184bp)、 exon5(381bp)和 exon6(441bp)。,取5 μ l PCR产物，用2％琼脂糖凝胶电泳分析，稳流120 mA，20 min。,取5 μ l PCR产物，用2％琼脂糖凝胶电泳分析，稳流120 mA，20 min。,反

27、应条件为预变性95℃ ，5 min，继而95℃变性50 S，65℃退火30 S，72 oC延伸90 S，共35个循环，最后72℃延伸10 min。,反应条件：预变性95℃ ，5min，继而95℃变性50 s，65℃退火30 s，72℃延伸90 S，共35个循环，最后72℃延伸10 min。,C、D分别为没有突变的正、反向测序,C、D分别为没有突变的正、反向测序,点突变或分子量很小的碱基序列突变,②分析经典型HL HRS中IκBα突变的特点、可能造成的蛋白结构异常；,对HRS细胞、背景中反应性增生细胞的IκBα 6个外显子进行半巢式PCR扩增。,如果在800-1600之间，那么就要同时进行正反向

28、测序才能测出你的片段（因为一个方向上的测序结果最好也只能保证800bp以内是可信的）,DAKO EnVision显色系统是将二抗和酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体（即EnVision）直接放大信号40-50倍，把传统的二抗、三抗分别孵育合为一次孵育。,PCR仪（包括反应体系）,取5 μ l PCR产物，用2％琼脂糖凝胶电泳分析，稳流120 mA，20 min。,Overexpression of I kappa B alpha without inhibition of NF-kappaB activity and mutations in the I kappaB alpha ge

29、ne in Reed-Sternberg cells [J].,一个是正向引物（上游引物），用它来测序就是正向测序(从上游往下测序)，也就是5'到3',点突变或分子量很小的碱基序列突变,第一轮，l0×PCR缓冲液5．0 μ Ixl，MgCL2(25 mmol／L)4．0 l，dNTPs(10 mmol／L)2．0 l，Taq DNA聚合酶(5 U／ μL)1．0 μ l，DNA模板(0．5 μ g／ μL)2．0 μ l，引物1 μ l。,有研究发现NF-κB (RelA/P50)的组成性激活是霍奇金淋巴瘤细胞的特点。,采用EnVision两步法。,EnVision两步法,EnVision两步

30、法,CD30单抗（Dako公司，克隆号Ber—H2，效价1：20）,反应条件：预变性95℃ ，5min，继而95℃变性50 s，65℃退火30 s，72℃延伸90 S，共35个循环，最后72℃延伸10 min。,第二轮，反应体系同第一轮，但扩增引物为1．25 μ L。,PCR仪（包括反应体系）,反应条件：预变性95℃ ，5min，继而95℃变性50 s，65℃退火30 s，72℃延伸90 S，共35个循环，最后72℃延伸10 min。,加1：20稀释的一抗；,采用EnVision两步法。,切割周围的正常淋巴细胞每例2管，,用Leica ASLMD系统逐个切割组织切片上的CD30阳性细胞（切割参

31、数：激光强度37，波长377，速度5，光束直径8）。,Regulation of NF-kappaB activity by IkappaB-related proteins in adenocarcinoma cells [J].,如果在800-1600之间，那么就要同时进行正反向测序才能测出你的片段（因为一个方向上的测序结果最好也只能保证800bp以内是可信的）,肿瘤细胞IκBα基因突变率高，而反应性增生的淋巴细胞IκBα基因没有突变。,[3] Emmerich F, et al.,（缓冲体系：10X反应缓冲液2．5 μ l，MgCL2(25 mmol／L)1．5 μ l，dNTP(10

32、mmoL／L)1．0 μ l，上游引物(10~ μ moL／ L)0．5 μ l，下游引物(10 μ mol／L)0．5 μ l，Taq酶(5 U／ μL)0．3 μ l，,第二轮，反应体系50 μ l，扩增第一和第二外显子时加引物1．25 μ l。,EnVision两步法,采用EnVision两步法。,Regulation of NF-kappaB activity by IkappaB-related proteins in adenocarcinoma cells [J].,Leica ASLMD激光显微系统,将冰冻组织切成6μm厚连续切片，贴于Leica PEN膜空白切片上，用含0．0

33、5％ NP40的丙酮(v／v)固定10 min，室温下自然干燥；,Emmerich等人的研究表明HRS细胞中IκBα mRNA高表达，但在蛋白水平检测的阳性强度弱，可能与HL中泛素化降解活性增强有关，也可能由IκBα蛋白结构改变导致。,（蓝色-C,红色-T，绿色-A，黑色-G）,这种特殊的瘤巨细胞来源于B淋巴细胞 (镜影细胞),巢式聚合酶链反应(nested polymearse chain reaction, nPCR)也称套式PCR。,反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，55％退火1 min，72oC延伸1 min，共40个循环，72℃延伸7min，至4℃结束。,反应条

34、件：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，55％退火1 min，72oC延伸1 min，共40个循环，72℃延伸7min，至4℃结束。,肿瘤细胞和反应性增生的淋巴细胞的IκBα的突变率都增加,每管DNA样品都要扩增2次，使用上海博亚公司ABI377DNA测序仪对PCR阳性产物进行直接测序。,切割周围的正常淋巴细胞每例2管，,点突变或分子量很小的碱基序列突变,电泳条带不在同一水平线上——基因明显突变。,Constitutive nuclear factor-kappaB-RelA activation is required for proliferation and survival

35、of Hodgkin’s disease tumor cells [J].,用Leica ASLMD系统逐个切割组织切片上的CD30阳性细胞（切割参数：激光强度37，波长377，速度5，光束直径8）。,IκBα基因没有参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化,有研究发现NF-κB (RelA/P50)的组成性激活是霍奇金淋巴瘤细胞的特点。,IκBα基因没有参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化,Leica ASLMD激光显微系统,Constitutive nuclear factor-kappaB-RelA activation is required for proliferation and survival

36、of Hodgkin’s disease tumor cells [J].,第二轮，反应体系50 μ l，扩增第一和第二外显子时加引物1．25 μ l。,肿瘤细胞IκBα基因突变率高，而反应性增生的淋巴细胞IκBα基因没有突变。,肿瘤细胞和反应性增生的淋巴细胞的IκBα的突变率都增加,EnVision两步法,点突变或分子量很小的碱基序列突变,[1] Bargou R.,第二轮，反应体系同第一轮，但扩增引物为1．25 μ L。,,EnVision,两步法,,DAKO EnVision,显色系统是将二抗和酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体（即,EnVision,）直接放大信号,40-50,倍，把传统的二抗、三抗分别孵育合为一次孵育。特点：敏感、省时、方便、背景低（避免了内源性生物素干扰）。,,