5核酸印迹与分子杂交课件

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1、分子生物学技术分子生物学技术 高高 颖颖gaoying822hotmail核酸印迹技术与分子杂交核酸印迹技术与分子杂交Nucleic Acid Blotting and Molecular Hybridization 核酸分子杂交核酸分子杂交 （nucleotide molecular hybridization）以以DNADNA的的变性变性、复性复性为理论基础；为理论基础；指具有一定同源序列的两条核酸单链指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNADNA或或RNARNA），在一定条件下按碱基互），在一定条件下按碱基互补配对原则经过复性处理后，形成补配对原则经过复性处理后，形成异源异源双链双链的过

2、程。的过程。Southern印迹印迹（Southern blot）基本操作过程基本操作过程待测待测DNADNA样品样品制备制备、基因探针基因探针标记；标记；待测待测DNADNA样品的电泳分离；样品的电泳分离；电泳分离的电泳分离的DNADNA经变性、转移、固定到合适的经变性、转移、固定到合适的固相支持物；固相支持物；特异性核酸探针与膜上特异性核酸探针与膜上DNADNA片段杂交，放射自片段杂交，放射自显影或显色检测目的显影或显色检测目的DNADNA的存在。的存在。Southern blot基本流程基本流程电泳电泳 转移转移 杂交，显影杂交，显影酶切酶切DNADNA样品上样样品上样 DNA DNA印

3、迹印迹重物Southern blot关键步骤关键步骤 待测待测DNADNA样品的酶切消化样品的酶切消化 基因组基因组DNADNA进行消化，才能在电泳过程进行消化，才能在电泳过程 中将不同长短的中将不同长短的DNADNA片段分离开。片段分离开。基因探针的标记基因探针的标记 探针序列和探针信号的选择探针序列和探针信号的选择。要考虑。要考虑 特定基因的重复性特定基因的重复性、保守性和稳定性。保守性和稳定性。可用同位素和非同位素标记。可用同位素和非同位素标记。Northern 印迹（印迹（Northern blot）是是将将RNARNA从从凝凝胶胶中中转转印印到到硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜上，定性分析上

4、，定性分析mRNAmRNA的常用方法。的常用方法。注意事项：注意事项：RNARNA易被酶降解。易被酶降解。可用于分析可用于分析基因转录基因转录水平的变化水平的变化。Western blot （蛋白免疫印迹）技术（蛋白免疫印迹）技术 是将是将蛋白质蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶中转印从聚丙烯酰胺凝胶中转印到到化学合成膜的支撑物上化学合成膜的支撑物上，利用特异性，利用特异性抗体抗体进行反应，定性分析蛋白质。进行反应，定性分析蛋白质。用于分析用于分析基因表达基因表达(蛋白水平）蛋白水平）的变化。的变化。原位分子杂交技术原位分子杂交技术 利用分子杂交技术来进行基因及其表达利用分子杂交技术来进行基因及其表达产物

5、产物定位分析定位分析的一种技术。的一种技术。组织、细胞或染色体的固定；组织、细胞或染色体的固定；探针；探针；与探针结合的标记物；与探针结合的标记物；可用于基因及其可用于基因及其表达产物的定位分析表达产物的定位分析。聚合酶链式反应聚合酶链式反应Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）是一种在是一种在体外特异地扩增已知基因体外特异地扩增已知基因的方的方法；法；由由K.Mullis于于19831983年建立年建立；20192019年获诺年获诺贝尔化学奖。贝尔化学奖。可用于分析基因及其产物的水平变化；

6、可用于分析基因及其产物的水平变化；可进行实时、定量分析可进行实时、定量分析；PCR PCR 体系体系模板模板引物引物耐热耐热DNADNA聚合酶聚合酶dNTPsdNTPs含含MgMg2+2+的缓冲液的缓冲液PCRPCR的过程的过程变性变性(Denaturing)95DNA 95DNA模板变性成为单链，引物自身和模板变性成为单链，引物自身和引物间的局部双链消除引物间的局部双链消除退火退火(Annealing)引物与模板引物与模板DNADNA杂交，杂交，Tm值减值减5延伸延伸(Extension)DNA DNA聚合酶在聚合酶在7272催化催化DNADNA的合成的合成ingPCR技术的工作原理技术的工

7、作原理17PCRPCR技术技术 PCRPCR分析已知基因；分析已知基因；反反转转录录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）是是将将RNARNA的的反反转转录录和和PCRPCR联联合合应应用用的一种技术。的一种技术。RT-PCRRT-PCR是是从从组组织织或或细细胞胞中中获获得得目目的的基基因因及及对对已已知知序序列列的的RNARNA进进行行定定性性及及半半定定量量分分析析的有效方法。的有效方法。RT-PCRRT-PCR与与PCRPCR区别区别 模板为模板为mRNAmRNA 需逆转录酶需逆转录酶 产物为产物为cDNAcDNA19mRNA 5 AAAAAA(n)

8、3 mRNA 5 AAAAAA(n)3 TTTTTT(n)5 mRNA 5 cDNA 3 AAAAAA(n)3 TTTTTT(n)5 AAAAAA(n)3 TTTTTT(n)5 oligo(dT)12-18反转录酶反转录酶RNase HDNA 聚合酶聚合酶S1 核酸酶核酸酶3 cDNATTTTTT(n)5 AAAAAA(n)3 TTTTTT(n)5 反转录合成反转录合成cDNAcDNA 实时、定量实时、定量PCRPCR技术技术 在在PCRPCR反应体系中加入反应体系中加入荧光基团荧光基团，利用荧，利用荧光信号积累实时检测整个光信号积累实时检测整个PCRPCR进程。通过标准进程。通过标准曲线对样

9、品中的曲线对样品中的DNADNA的起始浓度进行定量的方的起始浓度进行定量的方法。法。特点：对特点：对DNA/RNADNA/RNA模板定量，灵敏度强，模板定量，灵敏度强，特异性高。特异性高。21实时、定量实时、定量PCRPCR技术技术QR3355上游上游引物引物下游下游引物引物荧光标记引物荧光标记引物RQ 3355DNADNA序列测定序列测定DNA SequencingDNADNA序列分析方法序列分析方法双脱氧链终止法双脱氧链终止法 利用利用2，3-双脱氧核苷酸掺入中，双脱氧核苷酸掺入中，终止化学反应终止化学反应化学裂解法化学裂解法 利用化学试剂裂解修饰碱基终止聚合反应利用化学试剂裂解修饰碱基终

10、止聚合反应 戊戊 糖糖（RNA）12345核糖核糖(ribose)（DNA）脱氧核糖脱氧核糖(deoxyribose)DNADNA的序列测定的序列测定55端端3端端CGA26双脱氧链终止法双脱氧链终止法dADNA自动测序自动测序用用不不同同荧荧光光分分子子标标记记四四种种双双脱脱氧氧核核苷苷酸酸，然然后后进进行行SangerSanger测测序序反反应应，反反应应产产物物经经电电泳泳分分离离后后，通通过过四四种种激激光光激激发发不不同同大大小小DNADNA片片段段上上的的荧荧光光分分子子使使之之发发射射出出四四种种不不同同波波长长荧荧光光，检检测测器器采采集集荧荧光光信信号号，并并依依此此确确定

11、定DNADNA碱基的排列顺序。碱基的排列顺序。DNADNA序列自动分析序列自动分析ddG红红ddTddA绿绿ddC蓝蓝橙橙毛细管电泳毛细管电泳荧光标记荧光标记DNA合成合成测序结果展示测序结果展示DNA自动测序结果举例DNADNA序列分析可以揭示基因和序列分析可以揭示基因和基因组基因组一级结构一级结构变化变化通过通过DNADNA序列分析可以鉴定基因和基因组的序列分析可以鉴定基因和基因组的变异变异通过通过DNADNA序列测定分析人工重组的基因序列测定分析人工重组的基因通过通过DNADNA序列测定对定点突变进行确认序列测定对定点突变进行确认 DNADNA芯片技术芯片技术DNA Chip Techn

12、ologies DNA DNA芯片芯片（DNA chip）也称也称DNADNA微阵列微阵列(DNA microarray)在固相支持物上有序固化寡核苷酸或在固相支持物上有序固化寡核苷酸或DNADNA探针，与待测荧光标记样品进行杂交；探针，与待测荧光标记样品进行杂交；通过对杂交信号的检测、比较和分析，得通过对杂交信号的检测、比较和分析，得出样品的遗传信息；出样品的遗传信息；包括包括cDNAcDNA芯片和寡核苷酸微阵列芯片和寡核苷酸微阵列基因芯片工作流程基因芯片工作流程DNADNA芯片技术芯片技术cDNAcDNA芯片芯片 探探针针是是cDNAcDNA片片段段，可可以以同同任任何何具具有有同同源源序

13、序列列的的样品形成杂交体，同时定量监测大量基因的表达。样品形成杂交体，同时定量监测大量基因的表达。寡核苷酸芯片寡核苷酸芯片 基基因因特特异异的的寡寡核核苷苷酸酸片片段段为为探探针针，对对低低丰丰度度基基因表达水平变化的检测具有高度灵敏性。因表达水平变化的检测具有高度灵敏性。可进行高通量基因转录活性的分析可进行高通量基因转录活性的分析DNADNA芯片技术的特点芯片技术的特点 快速快速、高效高效、敏感敏感、平行化平行化、自动化。自动化。通过芯片技术筛选得到的表达信息还要用通过芯片技术筛选得到的表达信息还要用N Northern blot或定量或定量RT-PCR进行验证进行验证DNADNA芯片技术的

14、应用芯片技术的应用 肿瘤基因表达谱的差异研究；肿瘤基因表达谱的差异研究；基因多态性分析；基因多态性分析；微生物筛选鉴定；微生物筛选鉴定；遗传病产前诊断等遗传病产前诊断等 蛋白质芯片和组织芯片蛋白质芯片和组织芯片蛋白质芯片蛋白质芯片 蛋白质检测芯片蛋白质检测芯片 蛋白质功能芯片蛋白质功能芯片 组织芯片组织芯片 是是以以形形态态学学为为基基础础进进行行高高通通量量检检测测基基因因表达信息的芯片技术表达信息的芯片技术蛋白质芯片技术优势蛋白质芯片技术优势 在蛋白质结构在蛋白质结构、功能和相互作用，以及功能和相互作用，以及疾病发展过程中蛋白表达谱差异研究等方疾病发展过程中蛋白表达谱差异研究等方面。面。在临床医学研究中，利用蛋白质芯片技在临床医学研究中，利用蛋白质芯片技术寻找新的术寻找新的肿瘤标记物肿瘤标记物，各种，各种肿瘤标记物肿瘤标记物的筛选的筛选，用于，用于早期诊断早期诊断和治疗效果的监测。和治疗效果的监测。组织芯片组织芯片 将将组组织织标标本本集集成成在在一一张张固固相相载载体体上上形形成成微微缩缩组组织织切切片片，在在组组织织切切片片上上高高通通量量获获取取基因的表达信息。基因的表达信息。应应用用：肿肿瘤瘤病病理理学学（病病因因、诊诊断断、肿肿瘤瘤标标记物筛选记物筛选、治疗等）治疗等）END