免疫学检测技术解读课件

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1、第二十二章第二十二章 免疫学检测技术免疫学检测技术 p1931第二十二章第二十二章 免疫学免疫学检测检测技技术术 第一第一节体外抗原抗体体外抗原抗体结合合反反应的特点及影响因素的特点及影响因素2第一第一节节 体外抗原抗体体外抗原抗体结结合反合反应应的特点及影响因素的特点及影响因素2一一.体外抗原抗体反体外抗原抗体反应的特征的特征 高度特异性：高度特异性：抗原的表位与抗体的抗原抗原的表位与抗体的抗原结合合点点结构互构互补。表面化学基表面化学基团之之间的可逆性的可逆性结合合适宜的抗原抗体适宜的抗原抗体浓度和比例度和比例抗原抗体反抗原抗体反应的两个的两个阶段段3一一.体外抗原抗体反体外抗原抗体反应应

2、的特征的特征3高度专一性的结合高度专一性的结合4高度高度专专一性的一性的结结合合4可逆性可逆性结合合Equivalence Lattice formation5可逆性可逆性结结合合Equivalence Lattice for抗原抗体比例对反应现象抗原抗体比例对反应现象的影响的影响6抗原抗体比例抗原抗体比例对对反反应现应现象的影响象的影响6抗原抗体反抗原抗体反应的影响因素的影响因素电解解质：可促：可促进抗原与抗体的抗原与抗体的结合。合。常用生理常用生理盐水。水。温度：最适温度温度：最适温度为37。酸碱度：最适酸碱度：最适p pH=6-8。77第二第二节检测抗原或抗体抗原或抗体的体外的体外试验8

3、第二第二节节 检测检测抗原或抗体的体外抗原或抗体的体外试验试验8（一）凝集反（一）凝集反应 颗粒性抗原（粒性抗原（RBCRBC、细菌等）与相菌等）与相应抗体抗体 结合形成肉眼可合形成肉眼可见凝集物的凝集物的现象或反象或反应。1 1直接凝集直接凝集试验玻片凝集玻片凝集试验：用于：用于定性定性测抗原抗原。如。如ABOABO血型血型鉴定，定，细菌的菌的鉴定、分型等。定、分型等。试管凝集管凝集试验：用于：用于定量定量测抗体抗体，如肥达氏反如肥达氏反应。2 2间接凝集接凝集试验 如如类风湿因子的湿因子的测定等。定等。9（一）凝集反（一）凝集反应应91010（二）二）沉淀反沉淀反应 可溶性抗原（可溶性抗原

4、（血清蛋白、血清蛋白、组织浸液等）与浸液等）与相相应抗体抗体结合而形成可合而形成可见沉淀物的反沉淀物的反应。因因该类反反应多在半固体多在半固体琼脂凝胶中脂凝胶中进行，故行，故又称又称为琼脂脂扩散散试验或免疫或免疫扩散散。11（二）沉淀反（二）沉淀反应应11琼脂凝胶脂凝胶12琼琼脂凝胶脂凝胶121单向免疫扩散单向免疫扩散 用于用于定量测抗原定量测抗原。如检测血清免疫球蛋白、如检测血清免疫球蛋白、C3等含量。等含量。131单单向免疫向免疫扩扩散散 用于定量用于定量测测抗原。抗原。132 2双向免疫扩散双向免疫扩散 主要用于主要用于定性检测抗原或抗体，抗原组成及两定性检测抗原或抗体，抗原组成及两 种

5、抗原相关性分析种抗原相关性分析142双向免疫双向免疫扩扩散散143 3免疫免疫电泳泳 其方法是其方法是先先电泳、后泳、后扩散。主要用于散。主要用于抗原成分的分析抗原成分的分析，亦可，亦可用于用于诊断如骨髓瘤、性断如骨髓瘤、性联低丙种球蛋白血症等的低丙种球蛋白血症等的诊断断153免疫免疫电电泳泳15（三）免疫标记技术（三）免疫标记技术免疫标记技术免疫标记技术=抗原抗体反应抗原抗体反应示踪物标记示踪物标记灵敏性灵敏性特异性特异性标记免疫技术的主要特点：标记免疫技术的主要特点：高特异性高特异性、高灵敏性高灵敏性免疫技术免疫技术+标记技术标记技术16（三）免疫（三）免疫标记标记技技术术免疫免疫标记标记

6、技技术术=抗原抗体反抗原抗体反应应示踪物示踪物标记标记灵敏灵敏常用的标记物常用的标记物p酶、荧光素、放射性核素、化学发光物质酶、荧光素、放射性核素、化学发光物质酶、荧光素、放射性核素、化学发光物质酶、荧光素、放射性核素、化学发光物质及胶体金及胶体金及胶体金及胶体金p优点：优点：优点：优点：极大的提高了反应的灵敏度，可以极大的提高了反应的灵敏度，可以极大的提高了反应的灵敏度，可以极大的提高了反应的灵敏度，可以对微量物质进行定量、定性对微量物质进行定量、定性对微量物质进行定量、定性对微量物质进行定量、定性 或定位检测。或定位检测。或定位检测。或定位检测。免疫标记技术主要类型：免疫标记技术主要类型：

7、免疫标记技术主要类型：免疫标记技术主要类型：p免疫酶技术免疫酶技术免疫酶技术免疫酶技术p免疫荧光技术免疫荧光技术免疫荧光技术免疫荧光技术p 放射免疫测定法放射免疫测定法放射免疫测定法放射免疫测定法p发光免疫分析发光免疫分析发光免疫分析发光免疫分析p免疫胶体金技术免疫胶体金技术免疫胶体金技术免疫胶体金技术17常用的常用的标记标记物物171)免疫免疫酶测定法定法（Enzyme Immunoassay,EIAEIA）利用酶标记一抗或二抗检测特异性抗原利用酶标记一抗或二抗检测特异性抗原或抗体的方法或抗体的方法特点：利用抗原特点：利用抗原-抗体反应的高度特异性，抗体反应的高度特异性，以及酶催化底物反应的

8、生物放大作用以及酶催化底物反应的生物放大作用,最后用酶标仪测定光密度值（最后用酶标仪测定光密度值（ODOD），评），评定抗原定抗原-抗体的含量。抗体的含量。181)免疫免疫酶酶测测定法定法（Enzyme Immunoassay,常用酶及其底物常用酶及其底物辣根辣根过氧化物氧化物酶（HRPHRP）碱性磷酸碱性磷酸酶（APAP）19常用常用酶酶及其底物及其底物19分类20分分类类20双抗体双抗体夹心法心法在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如例如HBsAg、HBeAg、AFP、HCG等等 21双抗体双抗体夹夹心法在心法在临临床床

9、检验检验中，此法适用于中，此法适用于检验检验各种蛋白各种蛋白质质等大分子抗等大分子抗特点：特点：非竞争结合反应非竞争结合反应常用于抗原的检测常用于抗原的检测适用于分子中具有至少两个抗原决定簇适用于分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测的检测所用两种抗体分别针对同一个抗原分子所用两种抗体分别针对同一个抗原分子的不同抗原决定簇的不同抗原决定簇22特点：特点：22间接法接法ELISAELISA乙肝标志物中乙肝标志物中抗抗HBs的检测的检测常采用本法常采用本法 23间间接法接法ELISA乙肝乙肝标标志物中抗志物中抗HBs的的检测检测常采用

10、本法常采用本法 232)免疫荧光技术免疫荧光技术 (Immunofluorescence Technique)用荧光素标记一抗或二抗，检测特异性抗原用荧光素标记一抗或二抗，检测特异性抗原用荧光素标记一抗或二抗，检测特异性抗原用荧光素标记一抗或二抗，检测特异性抗原或抗体的方法或抗体的方法或抗体的方法或抗体的方法 242)免疫免疫荧荧光技光技术术24常用荧光素常用荧光素 异硫氰酸荧光素（异硫氰酸荧光素（FITC），），显黄绿色。显黄绿色。藻红蛋白（藻红蛋白（PE），显红色。），显红色。用途：细胞表面用途：细胞表面CD分子分子 抗核抗体抗核抗体 25常用常用荧荧光素光素252626272728283

11、)放射免疫测定法（放射免疫测定法（RIA）用放射性核素用放射性核素用放射性核素用放射性核素标记标记一抗或二抗，一抗或二抗，一抗或二抗，一抗或二抗，检测检测特异性抗原或抗体特异性抗原或抗体特异性抗原或抗体特异性抗原或抗体的方法的方法的方法的方法敏感度可达敏感度可达pgpg水平，水平，其其标记物物为125125I I、131131I I等。等。常用于常用于微量物微量物质的的检测，如激素、，如激素、IgEIgE等。等。293)放射免疫放射免疫测测定法（定法（RIA）294)发光免疫分析发光免疫分析 (luminescence immunoassay LIA)u将发光分析系统和免疫测定相结合而建立的一

12、种新的超微量将发光分析系统和免疫测定相结合而建立的一种新的超微量免疫分析技术。免疫分析技术。u优点：该方法既具有免疫反应的高度特异性又有发光分析的优点：该方法既具有免疫反应的高度特异性又有发光分析的高灵敏度。高灵敏度。304)发发光免疫分析光免疫分析 (luminescp化学发光免疫测定化学发光免疫测定吖啶酯、鲁米诺吖啶酯、鲁米诺p生物发光免疫测定生物发光免疫测定萤火虫、发光水母萤火虫、发光水母p化学发光酶免疫测定化学发光酶免疫测定辣根过氧化物酶（辣根过氧化物酶（HRPHRP）碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（APAP）p电化学发光免疫测定电化学发光免疫测定31化学化学发发光免疫光免疫测测定定315)免

13、疫胶体金技免疫胶体金技术 用胶体金标记一抗或二抗，检测特异性抗原或抗用胶体金标记一抗或二抗，检测特异性抗原或抗用胶体金标记一抗或二抗，检测特异性抗原或抗用胶体金标记一抗或二抗，检测特异性抗原或抗体的方法体的方法体的方法体的方法325)免疫胶体金技免疫胶体金技术术 用胶体金用胶体金标记标记一抗或二抗，一抗或二抗，检测检测特特6)免疫印迹法免疫印迹法（Western blottingWestern blotting）该法是将凝胶电泳与固相免疫相接合的检测该法是将凝胶电泳与固相免疫相接合的检测技术，即将电泳分区的蛋白质转移到固相载体，技术，即将电泳分区的蛋白质转移到固相载体，再用酶免疫、放射免疫技术

14、测定。再用酶免疫、放射免疫技术测定。常用于常用于检测多种蛋白质检测多种蛋白质336)免疫印迹法（免疫印迹法（Western blotting）33免免 疫疫 印印 迹迹 法法 示示 意意 图图34免免 疫疫 印印 迹迹 法法 示示 意意 图图3435354.蛋白质芯片技术：蛋白质芯片技术：又称蛋白质微阵列又称蛋白质微阵列是一种高通量的蛋白功能分析技术，可用于蛋白质表达谱是一种高通量的蛋白功能分析技术，可用于蛋白质表达谱分析，研究蛋白质与蛋白质的相互作用，甚至分析，研究蛋白质与蛋白质的相互作用，甚至DNA蛋白蛋白质、质、RNA蛋白质的相互作用，筛选药物作用的蛋白靶点蛋白质的相互作用，筛选药物作用

15、的蛋白靶点等。等。364.蛋白蛋白质质芯片技芯片技术术：又称蛋白：又称蛋白质质微微阵阵列列36原理：原理：是将各种是将各种蛋白质蛋白质有序地固定于载玻片等各种介质有序地固定于载玻片等各种介质载体上成为检测的芯片，然后，用标记了有特定荧光物质的载体上成为检测的芯片，然后，用标记了有特定荧光物质的抗体与芯片作用，与芯片上的蛋白质相匹配的抗体将与其对抗体与芯片作用，与芯片上的蛋白质相匹配的抗体将与其对应的蛋白质结合，抗体上的荧光将指示对应的蛋白质及其表应的蛋白质结合，抗体上的荧光将指示对应的蛋白质及其表达数量。达数量。37原理：是将各种蛋白原理：是将各种蛋白质质有序地固定于有序地固定于载载玻片等各种

16、介玻片等各种介质载质载体上成体上成为检为检第三节第三节 免疫细胞功能的检测免疫细胞功能的检测 38第三第三节节 免疫免疫细细胞功能的胞功能的检测检测 383939免疫细胞的分离免疫细胞的分离 外周血单个核细胞分离外周血单个核细胞分离 淋巴细胞的分离淋巴细胞的分离 T T细胞和细胞和B B细胞的分离细胞的分离 T T细胞亚群的分离细胞亚群的分离40免疫免疫细细胞的分离胞的分离 外周血外周血单单个核个核细细胞分离胞分离 40(一一)外周血单个核细胞分离外周血单个核细胞分离 外周血单个核细胞外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）包括淋巴细

17、胞和包括淋巴细胞和单核细胞（单核细胞（monocyte）。）。Ficoll分离液法主要用于分离外周血中的单个核细分离液法主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。41(一一)外周血外周血单单个核个核细细胞分离胞分离 外周血外周血单单个核个核细细胞（胞（periphe细胞分离基本原理细胞分离基本原理不同细胞密度不同不同细胞密度不同不同细胞表面生物学特性不同不同细胞表面生物学特性不同不同细胞表面分化抗原不同不同细胞表面分化抗原不同42细细胞分离基本原理不同胞分离基本原理不同细细胞密度不同胞密度不同42不同细胞密度不同不同细胞密度不

18、同人的红细胞密度为人的红细胞密度为1.093 粒细胞密度为粒细胞密度为1.092 单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为1.075-1.090 43不同不同细细胞密度不同人的胞密度不同人的红细红细胞密度胞密度为为1.093 43用用1.0770.001的分层液可将细胞分离的分层液可将细胞分离 44用用1.0770.001 的分的分层层液可将液可将细细胞分离胞分离 44密度梯度离心密度梯度离心(Ficoll)离心离心45密度梯度离心密度梯度离心(Ficoll)离心离心45（二）淋巴细胞及其亚群的分离和分析（二）淋巴细胞及其亚群的分离和分析免疫吸附分离法免

19、疫吸附分离法 免疫磁珠法免疫磁珠法 荧光激活细胞分离仪分离法（荧光激活细胞分离仪分离法（(Fluorescence Activated Cell Sorting)，FACS）抗原肽抗原肽-MHC-MHC分子四聚体技术分析分子四聚体技术分析CTLCTL 46（二）淋巴（二）淋巴细细胞及其胞及其亚亚群的分离和分析免疫吸附分离法群的分离和分析免疫吸附分离法 462.免免疫疫磁磁珠珠细细胞胞分分离离472.474848免疫磁珠法细胞分选过程免疫磁珠法细胞分选过程49免疫磁珠法免疫磁珠法细细胞分胞分选过选过程程493.荧光激活细胞分离仪分离法荧光激活细胞分离仪分离法 流式细胞术流式细胞术(flow cy

20、tometry,FCM)503.荧荧光激活光激活细细胞分离胞分离仪仪分离法分离法50全自动细胞分选系统全自动细胞分选系统51全自全自动细动细胞分胞分选选系系统统51流式细胞分析仪流式细胞分析仪52流式流式细细胞分析胞分析仪仪52流式细胞仪的工作原理和基本结构流式细胞仪的工作原理和基本结构待待测细胞胞以以单个个细胞胞的的悬液液，经特特异异性性荧光光染染料料染染色色，放放入入样品管，吸入流品管，吸入流动室。室。流流动室室充充满IsoFlow，作作用用：约束束样品品在在喷嘴嘴中中心心，防防止止样品品靠靠近近喷孔孔壁壁堵堵塞塞喷孔孔。细胞胞排排成成单列列由由喷嘴嘴中中心心喷出出，形成形成细胞液柱。胞液

21、柱。液柱与激光束相交，液柱与激光束相交，细胞上的胞上的荧光染料被激光染料被激发产生生荧光。光。荧光信号光信号变成成电信号信号输出到出到计算机，算机，软件分析。件分析。53流式流式细细胞胞仪仪的工作原理和基本的工作原理和基本结结构待构待测细测细胞以胞以单单个个细细胞的胞的悬悬液，液，经经特特4.4.抗原肽抗原肽-MHC-MHC分子分子四聚体四聚体 是一种是一种药品药品的名字，可应用于免疫学研究和检测、的名字，可应用于免疫学研究和检测、特异性免疫治疗以及疫苗疗效监测等多个方面特异性免疫治疗以及疫苗疗效监测等多个方面544.抗原抗原肽肽-MHC分子四聚体分子四聚体54抗原肽抗原肽-MHC-MHC分子

22、四聚体分子四聚体技术分析技术分析CTLCTL55抗原抗原肽肽-MHC分子四聚体技分子四聚体技术术分析分析CTL55二二 细胞免疫功能检测细胞免疫功能检测T细胞功能测定B细胞功能测定56二二 细细胞免疫功能胞免疫功能检测检测T细细胞功能胞功能测测定定56（1 1）T T淋巴细胞增殖试验淋巴细胞增殖试验原理：原理：淋巴细胞淋巴细胞DNA合成合成分化分化母细胞母细胞刺激物刺激物细胞变大细胞变大细胞浆扩大细胞浆扩大空泡空泡核仁明显核仁明显核染色质疏松核染色质疏松57（1）T淋巴淋巴细细胞增殖胞增殖试验试验原理：淋巴原理：淋巴细细胞胞DNA合成分化母合成分化母细细胞刺胞刺1 1）形态学检查法）形态学检查

23、法581）形）形态态学学检查检查法法582 2）3H-TdR3H-TdR掺入法掺入法优点：优点：3H-TdR3H-TdR掺入法敏感性高，客观性掺入法敏感性高，客观性强，重复性好。强，重复性好。缺点：但需一定设备条件，同时还存在缺点：但需一定设备条件，同时还存在放射性核素污染问题。放射性核素污染问题。592）3H-TdR 掺掺入法入法优优点：点：3H-TdR 掺掺入法敏感性高，客入法敏感性高，客观观3H-TdR或或125I-UdR掺入法掺入法603H-TdR 或或125I-UdR掺掺入法入法603）MTT比色法比色法613）MTT比色法比色法61(2)迟发型超敏反应检测62(2)迟发迟发型超敏反

24、型超敏反应检测应检测622.B细胞功能胞功能测定定单扩 ELISA 速率比速率比浊法法测定各定各类免疫球蛋白含量免疫球蛋白含量抗体形成抗体形成细胞胞测定定632.B细细胞功能胞功能测测定定单扩单扩 ELISA 速率比速率比浊浊法法测测定各定各类类免疫球免疫球（2 2）溶血空斑试验）溶血空斑试验原理：原理：64（2）溶血空斑）溶血空斑试验试验原理：原理：64临床应用与评价临床应用与评价溶血空斑试验主要用于测定药物和溶血空斑试验主要用于测定药物和手术等因素对体液免疫功能的影响手术等因素对体液免疫功能的影响评价免疫治疗或免疫重建后机体产评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的能力。生抗体的能力。65临

25、临床床应应用与用与评评价溶血空斑价溶血空斑试验试验主要用于主要用于测测定定药药物和手物和手术术等因素等因素对对体液体液 B B细胞抗体形成功能的检测细胞抗体形成功能的检测 酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法原理：原理：66 B细细胞抗体形成功能的胞抗体形成功能的检测检测 酶酶联联免疫斑点法原免疫斑点法原应用与方法学评价：应用与方法学评价：该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检测抗体分泌量。测抗体分泌量。优点：优点：稳定、特异、抗原用量少；稳定、特异、抗原用量少；可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可检测组织切片

26、中分泌抗体的单个细胞。可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。67应应用与方法学用与方法学评评价：价：该该方法既可方法既可检测检测抗体分泌抗体分泌细细胞，又可胞，又可检测检测抗体分抗体分ELISPOT技术简介技术简介 酶联免疫斑点试验酶联免疫斑点试验(Enzyme linked immunospot assay)(Enzyme linked immunospot assay)80 80 年代，国外的科研工作者根据年代，国外的科研工作者根据 ELISA ELISA 技术的基本技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和 CK CK 分泌细胞分泌细胞的固相

27、酶联免疫斑点技术（的固相酶联免疫斑点技术（ELISPOTELISPOT）。因其具有较高的特异）。因其具有较高的特异性和敏感性，目前正被国内外广泛应用，对探索自身免疫系性和敏感性，目前正被国内外广泛应用，对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。统疾病发病机制具有重要意义。68ELISPOT技技术简术简介介 酶酶联联免疫斑点免疫斑点试验试验(Enzyme lELISPOTELISPOT的基本原理的基本原理的基本原理的基本原理 细胞受到刺激后局部产生细胞细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，被捕获的细体捕获。细胞分解后，被捕获的

28、细胞因子与生物素标记的二抗结合，胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与酶标记（例如其后再与酶标记（例如碱性磷酸酶碱性磷酸酶）的亲和素结合。底物（的亲和素结合。底物（BCIP/NBT，产物为蓝紫色）孵育后，产物为蓝紫色）孵育后，PVDF 孔板出现孔板出现“紫色紫色”的斑点表明细胞的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过产生了细胞因子，通过 酶联斑点分酶联斑点分析系统对斑点分析后得出结果。析系统对斑点分析后得出结果。69ELISPOT的基本原理的基本原理 细细胞受到刺激后局部胞受到刺激后局部产产p稳定、特异，且抗原用量少p可同时检测不同抗原诱导的抗体分泌，并可定量检测p可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞

29、ELISPOT检测抗体分泌检测抗体分泌70稳稳定、特异，且抗原用量少定、特异，且抗原用量少ELISPOT检测检测抗体分泌抗体分泌70ELISPOTELISPOT分析系统分析系统分析系统分析系统酶联斑点读板仪酶联斑点读板仪71ELISPOT分析系分析系统统酶酶联联斑点斑点读读板板仪仪713.3.细胞毒试验细胞毒试验原理：原理：靶细胞抗原靶细胞抗原T细胞细胞观察杀伤活力观察杀伤活力致敏致敏CTL靶细胞靶细胞723.细细胞毒胞毒试验试验原理：靶原理：靶细细胞抗原胞抗原T细细胞胞观观察察杀伤杀伤活力致敏活力致敏CTL靶靶 淋巴细胞（淋巴细胞（CTLCTL）+含含5151Cr Cr 的肿瘤细胞的肿瘤细胞

30、 肿瘤细胞破坏肿瘤细胞破坏 5151Cr Cr 释放释放 测定测定射线射线意义：意义：肿瘤患者肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力杀伤肿瘤细胞的能力 （1）5151CrCr释放法释放法73 淋巴淋巴细细胞（胞（CTL）+含含51Cr 的的肿肿瘤瘤细细胞意胞意义义：（：（7474（2）乳酸脱氢酶释放法75（2）乳酸脱）乳酸脱氢氢酶酶释释放法放法757676（3）细胞染色法77（3）细细胞染色法胞染色法777878(4)凋亡凋亡细胞胞检测法法细胞凋亡细胞凋亡生理性凋亡病理性凋亡由遗传控制，受既定程序（或由遗传控制，受既定程序（或基因）调控的，是程序性的细基因）调控的，是程序性的细胞死亡（胞死亡（pro

31、grammed cell programmed cell death,PCDdeath,PCD）非遗传控制的的意外的细胞坏死（accidental cell death）定义：凋亡定义：凋亡定义：细胞坏死定义：细胞坏死79(4)凋亡凋亡细细胞胞检测检测法法细细胞凋亡生理性凋亡病理性凋亡由胞凋亡生理性凋亡病理性凋亡由遗传遗传控制控制细胞坏死细胞坏死细胞坏死细胞坏死（细胞被动性死亡）（细胞被动性死亡）（细胞被动性死亡）（细胞被动性死亡）细细胞胞受受到到急急性性强强力力伤伤害害时时，立立即即出出现现的的早早期期反反应应。是是是是病病病病理理理理条条条条件下细胞死亡的过程。件下细胞死亡的过程。件下细胞

32、死亡的过程。件下细胞死亡的过程。细胞肿胀，线粒体和内质网肿胀细胞肿胀，线粒体和内质网肿胀细胞肿胀，线粒体和内质网肿胀细胞肿胀，线粒体和内质网肿胀核核核核染染染染色色色色质质质质随随随随机机机机降降降降解解解解呈呈呈呈絮絮絮絮状状状状,蛋蛋蛋蛋白白白白合成减少。合成减少。合成减少。合成减少。细细细细胞胞胞胞膜膜膜膜、溶溶溶溶酶酶酶酶体体体体破破破破裂裂裂裂,细细细细胞胞胞胞内内内内容容容容物流出物流出物流出物流出,引起引起引起引起周围炎症周围炎症细胞凋亡细胞凋亡细胞凋亡细胞凋亡（细胞主动性死亡）（细胞主动性死亡）（细胞主动性死亡）（细胞主动性死亡）多细胞有机体为调控机体发育、多细胞有机体为调控机

33、体发育、维持内环境稳定，由基维持内环境稳定，由基因控制的细胞主动性死亡过程。因控制的细胞主动性死亡过程。又称程序性细胞死亡又称程序性细胞死亡又称程序性细胞死亡又称程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD).从严格的词学意义上来说，从严格的词学意义上来说，PCD与凋亡是有很大区别的与凋亡是有很大区别的80细细胞坏死胞坏死80细胞坏死细胞坏死细胞凋亡细胞凋亡81细细胞坏死胞坏死细细胞凋亡胞凋亡81细胞凋亡胞凋亡检测方方形态学方法电泳法原位缺口末端标记法流式细胞术测定法82细细胞凋亡胞凋亡检测检测方形方形态态学方法学方法电电泳法原位缺口末端泳法原位缺口末端标记标记法流式法流

34、式细细胞胞术测术测形形态学方法学方法细胞坏死细胞坏死细胞凋亡细胞凋亡83形形态态学方法学方法 细细胞坏死胞坏死细细胞凋亡胞凋亡83电泳法泳法在在在在细细胞凋亡胞凋亡胞凋亡胞凋亡时时，内源性，内源性，内源性，内源性mg2mg2+、ca2ca2+依依依依赖赖性核算性核算性核算性核算内切内切内切内切酶酶被激活，被激活，被激活，被激活，对对DNADNA的切割有的切割有的切割有的切割有3 3种形式。即种形式。即种形式。即种形式。即核小核小核小核小体体体体间间DNADNA链链的断裂、大分子的断裂、大分子的断裂、大分子的断裂、大分子DNADNA链链的断裂以及的断裂以及的断裂以及的断裂以及DNADNA单链单链

35、的断裂的断裂的断裂的断裂。琼琼脂糖凝胶脂糖凝胶脂糖凝胶脂糖凝胶电电泳泳泳泳时时，可，可，可，可观观察到察到察到察到特征的特征的特征的特征的梯状梯状梯状梯状（ladderladder）DNADNA条条条条带带84电电泳法在泳法在细细胞凋亡胞凋亡时时，内源性，内源性mg2+、ca2+依依赖赖性核算内切性核算内切酶酶T Td dT T-mme ed di ia at te ed d d dU UT TP P-b bi io ot ti in n n ni ic ck k e en nd d l la ab be el li in ng g (T TU UN NE EL L)细细胞胞胞胞凋凋凋凋亡亡亡

36、亡有有有有一一一一项项重重重重要要要要的的的的特特特特征征征征为为细细胞胞胞胞内内内内的的的的D DN NA A碎碎碎碎裂裂裂裂成成成成片片片片段段段段(D DN NA A f fr ra ag gmme en nt ta at ti io on n),T TU UN NE EL L可可可可以以以以有有有有效效效效的的的的去去去去探探探探测测D DN NA A片片片片段段段段的的的的产产生生生生,所所所所以以以以可可可可以以以以传传达达达达细细胞胞胞胞凋凋凋凋亡亡亡亡的的的的讯讯息息息息.原原原原位位位位末末末末端端端端标标记记技技技技术术可可可可以以以以检检测测到到到到形形形形态态改改改改变

37、变之之之之前前前前的的的的凋凋凋凋亡亡亡亡细细胞胞胞胞，敏敏敏敏感感感感性性性性高高高高，特特特特异异异异性性性性强强，为为凋凋凋凋亡亡亡亡细细胞胞胞胞计计数数数数提提提提供供供供了了了了基基基基础础原位缺口末端原位缺口末端标记法法85TdT-mediated dUTP-biotin nick 流式流式细胞胞术测定法定法p细胞凋亡时，细胞凋亡时，Annexin V（一种分子量在（一种分子量在35-36kD的钙离的钙离子依赖性磷脂结合子依赖性磷脂结合蛋白蛋白）能与细胞凋亡过程翻转到膜外的）能与细胞凋亡过程翻转到膜外的磷磷脂酰丝氨酸脂酰丝氨酸高亲和力特异性结合。以标记高亲和力特异性结合。以标记FI

38、TC的的Annexin V作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。发生。PI(Propidium iodide)是一种核酸染料，它不能透过完整的是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过而使能够透过而使细胞核染成红色。将细胞核染成红色。将Annexin V 与与PI匹配使用，可以将凋亡匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞分开。早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞分开。86流式流式细细胞胞术测术测定法定法细细胞凋亡胞凋亡时时，Annexi

39、n V（一种分子量（一种分子量散点图散点图 密度图密度图二维等高图二维等高图直方图直方图87 散点散点图图4.吞噬功能吞噬功能测定定（1）四）四唑氮氮蓝还原原试验（NBT试验）主要主要检测了解中性粒了解中性粒细胞的胞内胞的胞内杀菌能菌能力。正常力。正常NBT阳性阳性细胞在胞在5%10%，免疫，免疫缺陷缺陷时其其值下降，如慢性肉芽下降，如慢性肉芽肿常常5%.884.吞噬功能吞噬功能测测定（定（1）四）四唑唑氮氮蓝还蓝还原原试验试验（NBT试验试验）88（2）巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验89（2）巨噬）巨噬细细胞吞噬胞吞噬鸡红细鸡红细胞胞实验实验 895.细胞因子检测生物活性生物活性检测法法免疫学免疫学检测法：法：ELISA ELISAPOT 蛋白芯片蛋白芯片分子生物学分子生物学检测法：法：PCR905.细细胞因子胞因子检测检测生物活性生物活性检测检测法法90谢谢91 谢谢 谢谢9192929393