肽的人工合成

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1、 第 六 章 肽 的 人 工 合 成 前 言 20世 纪 初 ， fischer 创 立 蛋 白 质 的 多 肽 结 构 学 说 1932年 ， Bergmann采 用 苄 氧 羰 酰 基 作 为 氨 基 保 护 基 同 时 期 Curtius创 立 酰 氯 法 ， 叠 氮 法 活 化 羧 基 的 肽 键 生 成 法 50年 代 初 ， Wieland等 发 展 了 活 化 酯 法 和 混 合 酸 酐 法 1953年 ， Vigneaud首 次 化 学 合 成 了 多 肽 激 素 催 产 素 1963年 ， Schwyzer合 成 24aa的 促 肾 上 腺 皮 质 激 素 (ACTH) 19

2、65年 ， 我 国 合 成 51aa的 牛 胰 岛 素 1979年 ， 矢 岛 治 明 液 相 法 合 成 牛 胰 RNaseA(124aa) 80年 代 ， Merrifield提 出 固 相 合 成 法 ； 多 肽 合 成 仪 不 断 发 展 第 一 节 肽 化 学 合 成 原 理 和 液 相 合 成基 本 步 骤 ： 1. -氨 基 和 -羧 基 以 及 侧 链 的 保 护 2. 羧 基 的 活 化 和 肽 键 的 形 成 3. 脱 除 保 护 基 和 纯 化 Z2 Z1 Z2 Z1XNHCHCOOH + H2NCHCOOY H2O XNHCHCO-NHCHCOOY Z3 Z2 Z1 脱

3、 保 护 XNHCHCOOH + H2NCHCO-NHCHCOOY Z3 Z2 Z1 缩 合 XNHCHCO-NHCHCO-NHCHCOOY 保 护 基 全 脱 除 三 肽 一 氨 基 酸 保 护 基 为 了 使 肽 键 生 成 反 应 能 够 定 向 进 行 ， 需 要 对 氨 基 酸 的 各种 官 能 团 进 行 保 护（ 一 ） -氨 基 保 护 基 ： 常 用 ： 烷 氧 羰 基 、 酰 基 和 烷 基基 团 结 构 名 称 脱 除 条 件苄 氧 羰 酰 基（ z） 钯 炭 催 化 氢 化 法 (H2/Pd) Na/液 氨 , HF法 等(CH 3)3-CO-CO- 叔 丁 氧 羰 基

4、(Boc) 弱 酸芴 甲 氧 羰 基(Fmoc) 碱 脱 除 : 20%呱 啶 /CH2Cl2-CH2O-CO- H CH2O-CO- （ 二 ） -羧 基 保 护 基 保 护 基 种 类 相 对 较 少 -羧 基 保 护 基 种 类 ： 盐 ： 钾 盐 、 钠 盐 、 三 乙 胺 盐 、 三 丁 胺 盐 等 盐 是 对 羧 基 的 临 时 性 保 护 酯 ： 甲 酯 和 乙 酯 、 苄 酯 、 叔 丁 酯 (最 常 用 ）（ 三 ） 侧 链 的 保 护 ： 20种 aa中 有 13种 侧 链 需 要 保 护 Lys-NH 2 和 侧 链 羧 基 :选 择 与 -氨 基 和 羧 基 不 同 的

5、 保 护 基 Cys-SH: 甲 基 苄 基 、 对 氧 苄 基 等 （ 三 氟 乙 酸 铊 / TFA脱 除 ) 羟 基 aa(Ser,Thr,Tyr)： 苄 基 、 叔 丁 基 酰 胺 基 保 护 ： 2,4,6-三 甲 氧 苄 基 等 （ 可 用 TFA脱 除 ） 二 肽 键 生 成 法 基 本 思 路 ： 使 -羧 基 活 化 为 RCOX形 式 ， 加 强 羰 基 碳原 子 的 正 电 性 ， 便 于 -氨 基 进 行 亲 和 攻 击 而 成 肽（ 一 ） 活 化 酯 法 ： 方 法 ： 采 用 巯 基 、 烷 基 、 酚 基 和 N-羟 胺 类 物 质 （ 最 常 用 ：N,N -

6、二 环 乙 基 碳 二 亚 胺 ， DCC)与 N-保 护 aa作 用 ， 使 -羧 基 活化 为 酯 的 形 式 ， 然 后 进 行 成 肽 反 应 。 优 点 ： 中 间 产 物 可 以 分 离 、 结 晶 、 保 存 ， 便 于 去 除 副 产 物 氨 基 组 分 的 末 端 羧 基 可 以 不 保 护 对 酰 胺 基 活 化 特 别 有 效 （ 二 ） 缩 合 剂 法 ： 重 要 的 缩 合 剂 ： DCC, DIC(二 异 丙 基 DCC） 等 DCC接 肽 反 应 机 理 ：-N=C=N- R-COOH -NH-C=N- OCOR -NH-CO-NH-N,N-二 环 己 基 脲（

7、DCU）RCO-NH-R +H2N-RR-COOH+ (R-CO)2O 对 称 酸 酐 O-酰 基 脲H2N-RDCC-NH-CO-NH- （ 三 ） 叠 氮 法 ： 是 最 古 老 的 经 典 肽 键 生 成 法 (1902年 ） ， 该 法 最 少 引 起 消 旋 O O O R-C-OCH3 H2NNH2 R-C-NHNH2 R NO2 R-C-N3 （ 酰 化 氨 基 酸 酰 肼 ） （ 酰 化 氨 基 酸 叠 氮 ） O H2N-R R-C-NH-R + 碱 HN3 碱 （ 四 ） 混 合 酸 酐 法 ： 50年 代 提 出 ， 简 单 、 反 应 快 、 纯 度 好 ， 尤 其 适

8、 合 小肽 合 成 R1 R1 Z-NH-CH-COOH 叔 胺 (Et3N) Z-NH-CH-COO- Et3+NH R1 O O RO-COCl Z-NH-CH-C-O-C-OR H2N-R2 成 肽 （ 存 在 副 反 应 ） 三 脱 保 护 基 及 纯 化（ 一 ） TFA法 ： 方 法 ： 将 产 物 置 于 三 氟 乙 酸 (TFA)中 处 理 ， 以 脱 除 保 护 基 优 点 ： 用 于 脱 除 一 些 不 耐 酸 的 保 护 基 ， 温 和 ， 副 反 应 少 ， 尤其 适 合 于 固 相 合 成 法 。 曾 用 于 胰 高 血 糖 素 合 成 。 缺 点 ： TFA用 量

9、较 大 ， 需 保 护 的 氨 基 酸 种 类 较 多 等（ 二 ） HF法 ： 方 法 ： 以 无 水 氟 化 氢 (HF) 在 0 20C处 理 3060min 优 点 ： 可 脱 除 其 他 方 法 难 以 脱 除 的 保 护 基 ， 比 TFA法 有 效 缺 点 ： HF腐 蚀 性 强 ， 脱 除 时 副 反 应 较 多（ 三 ） 含 硅 试 剂 法 、 有 机 磺 酸 法 等 四 二 硫 键 的 生 成 是 蛋 白 质 合 成 中 最 困 难 的 工 作 经 典 方 法 ： 空 气 氧 化 法 、 碘 氧 化 法 ， 收 率 低 ， 副 反 应 严 重 目 前 : 三 氟 乙 酸 铊

10、 （ (CF3COO)3Tl ） 法 ： 可 先 裂 解 Cys的 各 种 保 护 基 ， 然 后 金 属 铊 作 为 弱 氧 化 剂 催化 二 硫 键 的 生 成 ， 效 率 是 碘 氧 化 法 的 2倍 亚 砜 介 导 法 （ sulfoxid-directed): Cys亚 砜 和 CysR 在 酸 处 理 下 ， 生 成 的 SH作 用 于 亚 砜 的 S原子 ， 在 亚 砜 位 置 处 生 成 二 硫 键 。 用 不 同 的 Cys亚 砜 和 酸 处 理 ，可 在 需 要 的 位 置 定 点 生 成 二 硫 键 。 五 合 成 肽 的 纯 化 和 纯 度 鉴 定 纯 化 ： 凝 胶

11、过 滤 、 离 子 交 换 层 析 、 反 向 HPLC等 鉴 定 ： 薄 层 层 析 、 等 电 点 聚 焦 、 分 析 HPLC、 质谱 法 等 六 肽 的 液 相 法 合 成 策 略 与 示 例 ： 小 肽 合 成 ： 逐 步 延 长 法 (stepwise elongation)， 从 C-端 开 始 逐 一 合 成 ， 使 肽 链 向 N末 端 延 长 的 方 法 大 肽 合 成 ： 片 段 缩 合 法 (fragment condensation) ， 先 分 段 合 成 小 肽 再 缩 合 成 大 肽 段 ， 缩 合 时 常 用 不 易 消 旋 的 叠 氮 法 片 段 缩 合 法

12、 策 略 ： 划 分 肽 段 ： 长 度 一 般 不 超 过 10个 aa残 基 尽 可 能 以 不 易 消 旋 的 Gly、 Pro等 为 肽 的 C-端 aa和 保 护 基 性 质 对 肽 段 纯 化 难 异 的 影 响 构 象 因 素 影 响 选 择 接 肽 顺 序 ： 小 片 段 分 头 缩 和 大 片 段 肽 (有 时 很 难 或 不 能 进 行 ) 小 片 段 逐 一 缩 合 (反 应 步 骤 多 但 产 率 高 ) 较 大 片 段 逐 一 缩 合 （ 常 用 ) 示 例 ： 牛 胰 RNase A（ 124aa） 的 合 成 将 RNase A分 成 长 短 不 一 30个 片

13、段 ， 分 别 以 逐 步 延 长 法 合 成 从 肽 的 C-端 开 始 ， 用 叠 氮 法 小 片 段 依 次 接 肽 ， 得 到 保 护 的RNase A（ N-端 为 Z(苄 氧 酰 基 )； C-端 ， OBzl(苄 氧 基 )） Cys(对 甲 氧 苄 基 ， Mbzl) 和 Met亚 砜 的 还 原 ， 得 到 还 原 型 保 护的 RNase A 1mol/L三 氟 甲 磺 酸 /TFA脱 保 护 ； 巯 基 乙 醇 + 二 硫 苏 糖 醇 ； 过 Sephadex G-25层 析 柱 ， 得 到 去 保 护 基 的 RNase A 在 谷 胱 苷 肽 存 在 下 空 气 氧

14、化 形 成 二 硫 键 ， Sephadex G-25， 得 到 合 成 的 RNase A 粗 品 (活 力 18.9%) 经 过 亲 和 层 析 ， 产 物 活 力 81.3% CM-纤 维 素 层 析 ， 得 到 离 子 交 换 层 析 纯 产 物 95%乙 醇 处 理 ， 得 到 牛 胰 RNase A结 晶 ， 酶 活 力 100% 第 二 节 固 相 肽 合 成一 、 合 成 原 理 ： 1963年 ， Merrifield将 aa的 C-端 固 定 在 不 溶 性 树 脂 上 ， 然 后在 其 上 依 次 进 行 氨 基 酸 缩 合 ， 延 长 肽 链 。 克 服 了 液 相 合

15、 成法 中 每 一 步 产 物 纯 化 的 困 难 ， 奠 定 了 自 动 化 肽 合 成 的 基 础 ， 为 此 ， Merrifield于 1984年 获 得 Nobel化 学 奖 固 相 法 合 成 较 之 液 相 法 简 单 、 快 速 ， 不 需 每 步 纯 化 中 间 物 固 相 法 适 合 1030aa的 小 肽 ， 不 流 失 但 固 相 法 合 成 肽 的 纯 度 差 ， 大 肽 或 高 纯 、 大 量 小 肽 合 成 采用 液 相 法（ 一 ） Boc固 相 法 （ 经 典 Merrifield法 ): 因 氨 基 保 护 基 采 用 可 用 TFA脱 除 的 Boc而 得

16、 名 ; 侧 链 用 苄 醇 类 保 护 ； 树 脂 为 氯 甲 基 化 或 羟 甲 基 化 聚 苯 乙 烯 ,对 乙 酰 氨 基 苄 酯 树 脂 方 法 ： Boc-NH-CHR1-COO- + Cl- CH2-树 脂 C-末 端 aa与 树 脂 结 合 ： Boc-NH-CHR1-COO-CH2-树 脂 用 TFA法 脱 除 N-Boc CF3COO- - +NH3-CHR1-COO-CH2-树 脂 三 乙 胺 中 和 、 洗 涤 NH2-CHR1-COO-CH2-树 脂 在 DCC存 在 下 与 Boc-aa耦 联 ， 洗 涤 Boc-NH-CHR 2-CO-NH-CHR1-COO-CH

17、2-树 脂 脱 保 护 、 重 复 接 肽 Boc-NH-CHRn-CO- -NH-CHR1-COO-CH2-树 脂 全 部 保 护 基 脱 除 ， HF法 等 目 的 肽 （ 二 ） Fmoc固 相 合 成 法 ： Fmoc固 相 合 成 法 的 步 骤 与 Boc固 相 合 成 法 类 似 不 同 之 处 ： 氨 基 保 护 基 为 ： 可 用 碱 (20%呱 啶 )脱 除 的 芴 甲 氧 羰 基 (Fmoc), 侧 链 保 护 基 为 ： 可 以 用 TFA脱 除 的 叔 丁 基 树 脂 ： 采 用 90% TFA可 切 断 的 烷 氧 苄 醇 型 或 1% TFA可 切 断 的 二 烷

18、 氧 苄 醇 型 优 点 ： 避 免 最 终 的 强 酸 处 理二 、 自 动 肽 合 成 仪 ： 1966年 ， Merrifield等 报 道 了 最 初 的 自 动 肽 合 成 仪 一 般 以 Boc或 Fmoc固 相 合 成 法 为 基 础 ， 将 肽 合 成 自 动 化 监 测 ： Fmoc有 明 显 的 紫 外 吸 收 第 三 节 酶 促 肽 合 成 和 半 合 成一 、 基 本 原 理 ： 利 用 蛋 白 水 解 酶 催 化 肽 键 的 形 成 优 点 ： 反 应 条 件 温 和 ； 不 引 起 aa消 旋 ； 不 要 求 aa侧 链 保 护 ； 副 产 物 少 ， 后 处 理

19、较 简 单1. 酶 促 合 成 多 肽 的 酶 类 ： 主 要 有 四 类 ： Ser蛋 白 水 解 酶 ； HS-蛋 白 水 解 酶 ； 羧 肽 酶 ； 金 属 蛋 白 酶 类2. 对 aa成 分 的 选 择 ： 为 使 反 应 向 肽 键 生 成 方 向 进 行 二 酶 合 成 反 应 的 几 个 系 统 ： 为 了 使 反 应 定 向 进 行 ， 将 参 与 反 应 的 氨 基 组 分 的 羧 基 端 和 羧基 组 分 的 氨 基 端 保 护 为 提 高 合 成 反 应 效 率 ， 防 止 二 次 水 解 ， 创 建 一 些 特 定 的 反 应系 统 ， 如 ：1. 沉 淀 系 统 ：

20、降 低 产 物 溶 解 度 ， 使 其 沉 淀 ， 防 止 水 解 如 ： Z-Phe-COOH + Z-Leu-NH2 Z-Phe-Leu-NH2 在 凝 乳 酶 (200mol/L)催 化 下 ， PH7反 应 20hr， 收 率 为 70 80%。随 反 应 进 行 溶 液 逐 步 变 褐 色 ， 黏 稠 化 、 最 终 完 全 固 化2. 二 相 系 统 ： 将 缓 冲 液 与 有 机 溶 剂 搅 拌 成 乳 浊 液 （ 二 相 系 统 ，水 相 一 般 占 25%） ， 底 物 和 酶 在 水 的 悬 滴 中 反 应 ， 但 生 成 的产 物 为 脂 溶 性 的 。 随 着 反 应

21、地 进 行 ， 产 物 自 动 转 移 至 有 机 相中 ， 不 再 与 酶 接 触 。 如 ： Z-Glu-COOH + Ala-ODPM Z-Glu- Ala-ODPM(二 苯 甲 酯 ) 三 酶 促 半 合 成 ： 对 于 无 保 护 的 大 肽 段 的 之 间 的 定 向 衔 接 ， 无 法 用 化 学 法 完 成 ，但 用 蛋 白 水 解 酶 的 特 异 性 可 能 取 得 成 功 如 ： 以 枯 草 杆 菌 蛋 白 酶 为 催 化 剂 ， 把 化 学 合 成 的 RNAase A小 片 段 S-肽 与 天 然 水 解 大 片 段 S-蛋 白 转 化 成 半 合 成 RNAase A

22、取 得 成 功 酶 促 半 合 成 胰 岛 素 ： 猪 胰 岛 素 羧 肽 酶 A 去 Ala胰 岛 素 胰 蛋 白 酶 切 除 B链 Ala30 在 B30处 接 上 叔 丁 氧 基 -Thr 酶 促 半 合 成 人 胰 岛 素 （ 产 率 90%） 小 结肽 合 成 方 法 ： 液 相 法 固 相 法 （ 肽 合 成 仪 ） 酶 促 合 成 （ 半 合 成 ） 法原 理 ： 基 团 保 护 ， 肽 键 合 成 ， 接 肽 ， 脱 保 护 蛋 白 质 部 分 复 习 题 简 述 蛋 白 质 的 结 构 层 次 以 及 各 层 次 主 要 的 特 点和 存 在 类 型 。 蛋 白 质 一 级 结 构 测 定 的 基 本 步 骤 和 方 法 。 研 究 蛋 白 质 空 间 结 构 的 主 要 方 法 有 哪 些 ？ 简 述其 原 理 。 举 例 说 明 各 种 膜 蛋 白 及 纤 维 蛋 白 的 结 构 特 点 。 试 述 细 胞 内 各 种 蛋 白 质 跨 膜 运 输 的 机 理 和 途 径 。 试 述 肌 肉 收 缩 的 分 子 机 理 。 简 述 肽 人 工 合 成 的 思 路 和 常 用 方 法 。