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H1N1 SIV(猪流感病毒)HA蛋白的生物信息学分析、高效
可溶表达及鉴别诊断SIV的夹心ELISA方法的建立
作者:谢易恒 李栋 苏培穗 陈成果 周科 黄慧雄
指导老师:谢青梅 副教授
作者单位:华南农业大学动物科学学院,广州,510642
摘要:猪是流感病毒传播的中间宿主,猪感染猪流感病毒(SIV)后会导致其他疾病如蓝耳病、圆环病毒病、胸膜肺炎等疾病的发生,给畜牧业造成巨大的经济损失,对人类健康造成了严重威胁。快速诊断和及时监测是控制流感的首要步骤。H1N1亚型猪流感病毒(SIV)的血凝素(HA)基因在流感病毒传染的过程中与识别靶细胞表面受体在穿膜过程中起重要作用,刺激机体产生的中和抗体可以抵抗病毒感染。本论文采用RT-PCR方法扩增了H1N1亚型猪流感病毒(SIV)广东株的血凝素(HA)基因,测序后对HA 基因进行生物信息学分析,分析结果表明HA蛋白具有良好的免疫原性,可以作为诊断试剂。然后将HA基因克隆到高效可溶表达载体pBCX上,成功构建重组表达质粒pBCX-HA。将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中表达,SDS-PAGE可检测到分子量约为94.0ku的融合蛋白,通过薄层凝胶扫描分析表明表达产物占菌体总蛋白的29.5%。经蛋白可溶性分析看出,融合蛋白90%以上是以可溶形式表达的。Western-blot证实,可溶表达的融合蛋白与H1N1亚型猪流感病毒阳性血清具有良好的免疫反应性。纯化表达的HA融合蛋白作包被抗原用于猪流感病毒单克隆抗体的筛选,筛选到2株猪流感病毒针对HA蛋白表位的单克隆抗体;用制备的SIV单克隆抗体,建立了高特异性的检测H1N1亚型SIV的间接ELISA方法,为猪流感的防控奠定基础。
关键词:H1N1亚型猪流感病毒 血凝素(HA) 生物信息学
高效可溶表达 单克隆抗体 ELISA方法
Biological information analysis and high soluble expression of HA protein of H1N1 subtype Swine Influenza Virus along with establishment of an ELISA assay to diagnose SIV
Author :Xie Yi-heng,Li Dong,Su Pei-sui,Chen Chen-guo,Zhou Ke,Huang Hui-xiong
Director teacher: Xie Qing-mei associate professor
College of Animal Science,South China Agric.Univ.,Guangzhou 510642,China
Abstract:Swine is an intermediate of spreading influenza virus, swines infected influenza virus will bring on other diseases such as PRRS, PCV, APP ,causing economic loses in the stockbreeding and intimidating the health of human so that fast diagnosis and timely analysis are the first step to control the influenza virus. The HA gene of H1N1 subtype influenza virus isolated from Guangdong Province was successfully amplified by RT-PCR,then analyzed biological information after translating DNA suquences. And the HA fragment was inserted into plasmid pBCX to obtain recombinant plasimd in which HA gene was fused into. The pMBX-HA was transformd into E.coli BL-21(DE3) to induce HA gene fusion expression. The fusion protein band with relative molecular mass of 94000 was detected on the SDS-PAGE gel, and the soluble expression products accounted for 29.5% of the total E.coli proteins. The soluble form of the expression products was up to 90% the fusion protein. From western-blot analysis of recombinant protein HA, the expression fusion protein and positive blood serum of H1N1 SIV have favorable immunogenicity. Expressed protein HA is used for coating antigen to sublimate monoclonal antibody of swine influenza virus. The preparations of monoclonal antibody of swine influenza virus are used for establishing an indirect ELISA assay to diagnose SIV in order to prevent and control the swine influenza virus .
Key words:H1N1 subtype Swine Influenza Virus haemagglutinin
bioinformatics high soluble expression monoclonal antibody
method of ELISA
猪流感是由猪流感病毒引起的一种急性、热性、高度接触性的呼吸道传染病。1975年以前,H1N1猪流感病毒以地方流行性存在于欧美大陆,其他地方少有报道;70年代末,H1N1猪流感传入了我国台湾,香港和大陆等地,并在亚洲广泛盛行。有研究表明我国H1N1抗体阳性率有不断上升的趋势。猪流感病毒具有感染人的潜力。据报道1976年,美国新泽西州的一名新兵感染猪源H1N1而死于肺炎。作为流感病毒的“混合器”,猪流感病毒在禽-猪-人的种间传播中起到非常重要的作用。另外人类流感和猪流感爆发的平行性和相关性,赋予了猪流感非常重要的公共卫生意义。
生物信息学是一门新兴的交叉学科,是采用计算机技术和信息论方法究蛋白质及核酸序列等各种生物信息的采集、存储、传递、检索、分析和解读的科学。具体的说,生物信息学是把基因组DNA序列信息分析作为源头,破译隐藏在DNA序列中的遗传语言,特别是非编码区的实质;同时在发现了新基因信息之后进行蛋白质空间结构模拟和预测。应用生物信息学分析H1N1亚型猪流感病毒HA基因及其氨基酸序列,打破传统的实验模式,开创了“理论-实验-理论”的新模式。
DNA重组技术又称基因工程技术,为大量获得蛋白质/多肽(以下所称“蛋白质”和“多肽”通用)提供了技术支持。已有不少蛋白质类药物、疫苗、诊断试剂采用基因工程方法生产。本研究选用pBCX高效可溶表达载体高效表达H1N1 SIV 的HA蛋白。用msyB基因作为融合伴侣,使HA融合蛋白高效可溶表达,突破了传统大肠杆菌表达系统包涵体表达外源蛋白(多肽)的技术瓶颈。msyB基因编码蛋白是大肠杆菌本身的蛋白,是一种高可溶性多肽,本身在大肠杆菌中表达量很高,其作为载体蛋白具有稳定性、可溶性和表达水平高的特性。当被诱导表达时,msyB多肽作为载体可与同外源蛋白一道分泌到大肠杆菌的胞质中表达,大大增加了外源蛋白的可溶性,且表达的外源蛋白能够产生正确折叠。对那些在胞内表达且表达产物对细菌有毒性的外源基因来说,可以减弱其毒性,提高表达量,提高融合蛋白的稳定性。因此选用大肠杆菌msyB多肽基因是构建高效可溶表达载体的最优融合伴侣基因之一。近年来,融合蛋白被广泛应用于生物研究,因其具有双方蛋白的活性,可被用于蛋白的表达、检测、识别和纯化。特别是在免疫治疗和免疫分析以及寻求高效、新型重组药物方面显示了其特有的优势。融合蛋白使昂贵的细胞因子在兽医上的应用成为可能,由融合蛋白构建的“生物导弹”更是提高了药物的效力,因此融合蛋白表达技术是极具发展前景的一门技术。
本研究对猪流感病毒HA基因的进行了生物信息学分析和高效可溶表达,纯化表达的HA融合蛋白作包被抗原用于猪流感病毒单克隆抗体的筛选,筛选到2株猪流感病毒针对HA蛋白表位的单克隆抗体;用制备的SIV单克隆抗体,建立了检测H1N1亚型SIV的夹心ELISA方法,为防治猪流感和研制猪流感基因工程疫苗提供科学依据,对生产实践具有一定的指导意义。
1 材料
1.1 病毒
猪流感病毒毒株:A/swine/Guangdong/2/01(H1N1)。
1.2 菌种
基因工程宿主菌E.coli DH5α、表达菌E.coli BL-21(DE3)。
pGEM-T Easy载体质粒(图1)系统为Promega公司产品; pBCX质粒(图2)本实验室保存。
图1 质粒pGEM-T Easy的结构示意图
Fig.1 Sketch map of the plasmid pGEM-T Easy
图2 pBCX载体的结构示意图
Fig.2 Sketch map of the plasmid Pbxc Easy
1.3 常用培养基以及试剂
LB液体培养基、LB固体培养基、LA固体培养基(含氨苄青霉素100µg/mL)、氨苄青霉素100mg/mL、无RNA酶的DEPC水、AMV反转录酶(5U/µL)、HRP RNA酶抑制剂(40U/µL)、小牛碱性磷酸酶(CIAP)、T4 DNA连接酶及相应缓冲液,Ex Taq DNA聚合酶(5u/µL)、dNTPs(2.5mM each)、DL2000 DNA Marker、DEPC、IPTG、Amp、溴化乙锭(EB)、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶、丙烯酰胺、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、TEMED、6xHis-Tag 融合蛋白亲和层析Ni-NTA 凝胶、DNA片段快速纯化/回收试剂盒、质粒DNA抽提试剂盒。
1.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)缓冲液
Tris-甘氨酸电泳缓冲液(pH8.3)、5×SDS-PAGE上样缓冲液、考马斯亮蓝染色液、脱色液、分离胶缓冲液(pH8.8)、浓缩胶缓冲液(pH6.8)。
1.5 Western blot试剂
转移缓冲液:25mM Tris,192mmol/L甘氨酸,20%(v/v)甲醇,0.037%(v/v)SDS,用HCl调pH至8.3。
TBS缓冲液:150mmol/LNaCl,10mmol/L Tris-Cl(pH7.5)。
封闭液:5%脱脂奶粉,用TBS缓冲液配制,4℃保存。
抗体稀释液:1%脱脂奶粉/TBS,用于稀释抗体,4℃保存。
显色液:在9mlL0.01mol/L Tris-Cl(pH7.6)缓冲液中溶解6mg二氨基联苯胺,加入1mL 0.3%的氯化钴,最后加入10µL 30%的双氧水,混匀后立即使用。
1.6 蛋白纯化试剂
Lysis buffer (pH 8.0)、Wash buffer (pH 8.0)、Elution buffer (pH8.0)
1.7 抗体
猪禽流感H1N1标准阳性血清由广东省兽医防疫站惠赠,辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪IgG(二抗)购自广州博理生物技术公司。
1.8 主要仪器及设备
PCR Express Gradient PCR仪、BIO-ID凝胶成像及分析系统、JY92-11超声波细胞粉碎机、EC570-90蛋白质电泳仪、冷冻高速离心机、超低温冰箱、空气摇床、WD-9504型生化摇摆平台、DYY-6B型稳压稳流电泳仪、AIR-TECH医用超净工作台
1.9免疫试剂
弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂、PEG(WM400)、IgG抗体亚类试剂盒、HRP-羊抗鼠、IgG酶标二抗、DMEM培养基、胎牛血清、100倍HAT储存液、100倍HT储存液、75%乙醇溶液;碘酊溶液。
1.10细胞培养基
基础培养液:IMDM培养基,补加0.37¥的NaHCO3、0.25%的葡萄糖,用1mol/LHCL调节PH至6.8-7.0,过滤除菌。
完全培养液:含10%胎牛血清的基础培养液,补加青霉素100IU/ml、链霉素100μg/ml及L-谷氨酰胺1mmol/ml。
HAT选择培养液:含1%HAT储存液的完全培养液。
HT选择培养液:含1%HT储存液的完全培养液。
1.11 ELISA方法试剂
包被液(500ml):将1.59g的Na2CO3和2.93g的NaHCO3溶于450ml的高压过的蒸馏水中,用5mol/L的氢氧化钠溶液调节dpHD值到9.6。再补加蒸馏水至500ml,存放在4℃冰箱中,备用。
PBS溶液的配制(20倍,500ml):分别将15.4Na2HPO4·12H2O、2gKH2PO4、80gNaCL、2gHCL融入500ml的蒸馏水中完全溶解后,放入高压锅中高压备用。
洗涤缓冲液(500ml):向1倍的PBS溶液中加入吐温-20,制成含吐温-20为0.05%的1倍的PBS溶液。
封闭液的制备:含5%脱脂奶粉的PBS溶液。现配现用。
底物显色液的配制:
A液:四甲基联苯胺(TMB):无水乙醇=1:100;
B液:0.2mol/L的pH为6.0的醋酸钠溶液,用醋酸调节pH值;
C液:0.03%H2O2的溶液;
按配方A液:B液:C液=1:4:5的比例配制。
终止液的配制:1mol/L的H2SO4溶液。
1.12实验动物与细胞
本实验所使用的九日龄鸡胚购于广州农科院畜牧研究所;8周龄Balb/c小白鼠由中山大学实验动物中心提供;骨髓瘤细胞SP2/0由本实验室保存并传代。
2 方法
2.1引物设计与合成
应用DNAStar(4.0)软件,参照GenBank中注册的H1N1猪流感病毒血凝素基因(HA)序列,设计引物HAup1/HAdn1用于扩增H1N1亚型猪流感的HA基因,引物理论跨幅分别为1701bp。引物由上海博亚生物工程公司合成。合成后的引物用三蒸水稀释成25mmol/L溶液,-20℃保存。引物序列如下:
HAup1:5'- ttatgaaggcaatactagtgttc-3'
HAdn1:5'-tttcagatgcatattctgcactg-3'
2.2 病毒RNA的提取
按GibcoBRL公司TRIzol LS Reagent RNA提取试剂盒的使用说明书进行,经DEPC处理的无RNA酶的三蒸水溶解沉淀,直接用于RT-PCR或-80℃保存。
2.3 HA基因RT-PCR反应和cDNA的扩增
2.3.1 HA基因cDNA第一链的合成
在20µL反应体系中分别加入规定组分,混匀后,室温放置10min,42℃保温1h,冰浴2min,RT产物直接用于PCR扩增,或-20℃保存(RNA 3 µL、5×buffer 4 µL、dNTPs 4 µL、RNA酶抑制剂0.5 µL、HAup1 1 µL、HAdn1 1 µL、AMV 2 µL、DEPC水3.5 µL)
2.3.2 HA基因cDNA的PCR扩增
PCR反应体系为:10×buffer 10µL、dNTPs 4µL、HAup1 1µL、HAdn1 1µL、cDNA 5µL、Ex Taq 1µL、ddH2O 78µL,将上述反应物混匀,在PCR Express Gradient PCR仪上按下列反应条件进行扩增。PCR产物用1%琼脂糖电泳检测。
2.3.3 PCR产物的凝胶回收与纯化
将PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上电泳,在紫外透射仪上,用手术刀片切下含目的条带的凝胶,以3倍体积的溶胶缓冲液,65℃水浴使之完全溶化,加入离子交换柱,12,000r/m离心1min,弃去滤液,用含酒精的洗脱液清洗2次,10,000r/m离心1min甩干残液,将适量双蒸水加入交换柱,于50-60℃保温数分钟,10,000r/m离心1min,收集滤液,用琼脂糖电泳检测回收效果。回收的PCR产物在Ex Taq作用下加尾,可直接用于连接。
2.4 T-HA重组质粒的构建
2.4.1 PCR产物与pGEM-T Easy载体的连接
连接反应体系为:2×buffer 5μL、加尾的PCR产物3μL、pGEM-T Easy 1μL、T4DNA连接酶1μL。混匀后稍离心后,于4℃条件下连接过夜。连接产物直接用于转化。
2.4.2 DH5α感受态细胞的制备
参照金东雁等(1996)的《分子生物学常用实验方法》,用CaCl2法制备感受态细胞。
2.4.3 连接产物转化感受态细胞
取上述制备的感受态细胞50µL,加入2.4.1中制备的连接产物5µL,混匀后冰浴30min,42℃热休克90sec,迅速转移到冰浴中冷却2min,加入200µL不含抗生素的LB液体培养基,于37℃摇床中以160r/m振摇培养45min;取100µL菌液涂布于含Amp的LB平板中,37℃培养过夜。
2.4.4 转化子的筛选、鉴定
从上述过夜培养的平板中挑取单个菌落,接种于3mL含Amp的LB液体培养基中,37℃振摇培养过夜,分别用PCR和酶切反应进行鉴定。
2.4.5 转化子的PCR筛选
直接以菌液作为模板进行PCR鉴定。反应体系、PCR反应程序同2.3.2。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。经PCR鉴定为阳性的重组质粒,命名为T-HA。
2.4.6 HA基因的序列测定
将阳性的重组质粒的菌液送交上海博亚生物技术有限公司进行核苷酸序列测定。
2.5 HA基因的碱基序列分析
用DNAstar软件对HA基因进行序列分析,包括同源性分析、系统进化树等。
2.6 HA基因及其氨基酸序列的生物信息学分析
2.6.1 HA基因稀有密码子预测
采用RACC服务器http://nihserver.mbi.ucla.edu/RACC/ ,将HA基因的氨基酸序列输入工作区进行稀有密码子预测;
2.6.2 HA蛋白信号肽预测
采用SignalP服务器http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ ,将HA基因的氨基酸序列输入工作区进行HA蛋白的信号肽预测;
2.6.3 HA蛋白的跨膜区预测
采用TMHMM服务器http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/, 将HA基因的氨基酸序列输入工作区进行HA蛋白的跨膜区预测;
2.6.4 HA蛋白的疏水性分析
采用Bioedit7.0软件,将HA基因的氨基酸序列输入工作区进行HA蛋白的疏水性分析;
2.6.5 HA蛋白的二级结构预测(SOPMA服务器)
http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html ,将HA基因的氨基酸序列输入工作区进行HA蛋白的二级结构预测;
2.6.6 HA蛋白抗原位点的预测(antigenic.pl服务器)
http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/antigenic.pl,将HA基因的氨基酸序列输入工作区进行HA蛋白抗原位点的预测;
2.6.7 HA蛋白的磷酸化位点预测
将研究的HA基因的氨基酸序列提交到丹麦技术大学生物序列分析中心(CBS)网站http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/ 进行HA蛋白的磷酸化位点预测;
2.6.8 HA蛋白的N-糖基化位点预测
将研究的HA基因的氨基酸序列提交到丹麦技术大学生物序列分析中心(CBS)网站http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/ 进行HA蛋白的N-糖基化位点预测。
2.7 pBCX对H1N1亚型猪流感HA基因在大肠杆菌中高效可溶表达
2.7.1 引物的设计与合成
根据测定的H1N1亚型猪流感HA基因序列设计1对引物,即HAup/HAdn,该片段理论跨度为1701bp,编码566个氨基酸,在HAup5’端加上BamHI酶切位点 (斜体) 和保护碱基,在HAdn加上SalI酶切位点(斜体)和终止密码。引物由上海博亚生物工程公司合成。合成后的引物用三蒸水稀释成25mmol/L溶液,-20℃保存。引物序列如下:
HAup:5'-ATGGATCCGACACAATATGTATA-3'
HAdn:5'- ATGTCGACGATGCATATTCTGCACT-3'
2.7.2 HA基因的PCR扩增
用HAup/HAdn引物对从T-HA重组质粒上扩增HA基因片段。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL的溴化乙锭)电泳检测。
2.7.3 PCR产物纯化
按TaKaRa公司凝胶纯化试剂盒说明书进行,方法同2.3.3。
2.7.4 PCR产物的酶切
将纯化的HA基因片段的PCR扩增产物用适量ddH2O溶解,在100µL反应体系中加入下列反应物,于37℃消化4h。
2.7.5 酶切产物的凝胶回收
方法同2.3.3。
2.7.6 质粒载体pBCX的制备与消化
在LA平板上划线培养含有pBCX质粒的E.coli DH5α,37℃温箱中培养16h。挑取单菌落接种于3 mL LA培养基中,37℃、200 r/m振摇培养16-20h。将3mL菌液分装2只1.5mL离心管中,4℃、3500r/m离心10min,沉淀细菌。
按照E.Z.N.A.® Plasmid Minipreps Kit质粒DNA抽提试剂盒说明书抽提质粒,质粒DNA溶解于50µL ddH2O中。取2µL进行琼脂糖凝胶电泳,检测质粒的纯度,用紫外吸收法测定质粒DNA含量。
在100µL pBCX质粒的酶切反应体系中加入反应物(10×buffer 10µL、BamHI 5µL、SalI 5µL、CIAP 1µL、pBCX 25µL、dd H2O 54µL)于37℃酶切消化4h。
2.7.7 质粒酶切产物的回收
方法同2.3.3。
2.7.8 HA基因片段pBCX质粒的连接
将经酶切消化、凝胶纯化后的HA基因片段与质粒酶切产物按T4 DNA连接酶连接过夜。在10µL的连接反应体系中加入反应物(10 ×连接缓冲液1µL、HA基因片段3.5µL、pBCX 1.5µL、T4 DNA连接酶1µL、Dd H2O 3µL),连接产物直接用于转化DH5α。
2.7.9 连接产物转化E.coli DH5α受体菌
取2.7.8中的连接产物5µL加入到50 µL E.coli DH5α感受态细胞中,混匀,冰浴30 min;42℃热休克90sec,而后迅速转移到冰浴2min;加入200µL LB液体培养基,于37℃以160r/m振摇培养45min。然后取200µL菌液涂布于LA固体琼脂培养基,37℃培养18h。
2.7.10 转化子的PCR鉴定
以菌液为模板,以特异性的HAup/HAdn引物对进行PCR鉴定。
2.7.11 重组质粒的限制性内切酶酶切鉴定
抽提含有HA基因的重组质粒命名为pBCX-HA,用BamHI和SalI进行酶切鉴定。
2.7.12 HA基因在大肠杆菌BL21中的表达和SDS-PAGE检测
将阳性的转化菌pBCX-HA-BL21划线培养;挑取单菌落接种于3mL LA液体培养基中,37℃,220r/m的空气摇床中培养10h,取出菌液,置4℃冰箱过夜;按1%比例将上述菌液接种于3mL LA液体培养基,37℃,220r/m振摇培养;当OD600为0.4~0.6时,加入终浓度为1mmol/L IPTG进行诱导表达,取0~5h菌液,12 000rpm离心2min,去上清,细菌沉淀中加100μL 1×SDS上样缓冲液,-80℃冻融三次,沸水中煮3~5min,12000r/m离心2min,取上清进行SDS-PAGE电泳。同时,设pBCX空质粒作为对照。pBCX-HA-BL21表达的融合蛋白命名为msyB-HA。按金东雁等(1996)介绍的方法制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)。
2.7.13 HA蛋白的Western blot检测
按照《蛋白技术手册》中的方法进行(汪家政等,2000)。
用的一抗是猪的H1N1亚型SIV阳性血清,二抗是HRP标记的山羊抗猪IgG。
2.8 H1N1 SIV单克隆抗体的制备
2.8.1 免疫动物
选择8 周龄健康BALb/C小鼠,每只小鼠分别肌肉注射以弗氏完全佐剂乳化的疫苗,注射量为100μg(抗原含量)左右;2周后以弗氏不完全佐剂(FIA)乳化H1N1 SIV标准抗原腹腔注射;最后一次加强免疫时,直接腹腔注射100μg的H1N1 SIV标准抗原;融合前3~4d尾静脉注射50μg纯化的病H1N1 SIV标准抗原。
2.8.2 细胞融合
SP2/0细胞及免疫鼠脾细胞用洗液作适当稀释后计数,两种细胞按1∶5的比例混合,离心去上清,缓慢加入PEG-4000(pH8.0),再加入洗液20~30mL ,离心弃上清,加入HAT营养液混匀。在铺有饲养细胞的96孔板上每孔加入100μL融合细胞悬液,最后将融合细胞培养板放置37℃5%的CO2 培养箱中培养。
2.8.3 筛选及克隆
用间接ELISA 法筛选分泌阳性抗体的杂交瘤细胞,所用的包被抗原是纯化的H1N1 SIV HA蛋白。将筛选的阳性杂交瘤细胞进行克隆,将检出的阳性孔再次克隆和亚克隆,最后选择OD值高、细胞活力好、只有一株细胞的孔扩大培养。
2.8.4 腹水的制备
将0.5mL高压灭菌的石蜡油注射到小鼠腹腔,一周后注入适量的杂交瘤细胞于小鼠腹腔,待7~10d小鼠腹部极度膨胀时,抽取腹水,将收集好的腹水离心,上清于56℃灭活30min即可。
2.9 ELISA检测
以H1N1 SIV HA蛋白筛选的单克隆抗体倍比稀释后进行方阵滴定,探索最佳的抗原包被浓度和血清的最佳稀释度,并用最佳的抗原浓度包被酶标板,检测部分送检的血清。
3 结果与分析
3.1 HA基因的RT-PCR扩增
实验发现在约1 700bp出现特异性扩增带(图3),与预期的大小相符,初步表明用RT-PCR方法成功扩增了SIV HA基因。
图3 H1N1亚型SIV HA基因的RT-PCR扩增产物电泳结果
M:DL2000 DNA marker (bp), 1、 2、3、4为RT-PCR 扩增出的目的条带;
Fig.3 Electrophoretic analysis of RT-PCR amplification of H1N1 subtype SIV HA gene
M:DL2000 DNA marker(bp),1、2、3、4:RT-PCR products
3.2 HA基因的cDNA的克隆及鉴定
SIV HA cDNA的RT-PCR产物经纯化、加尾后,插入到pGEM-T Easy载体的外源基因插入位点,重组质粒转化E.coil DH5,以培养的菌液为模板进行PCR鉴定。阳性菌液经上海博亚生物工程公司测序,测序结果与GenBank中检索的SIV HA基因同源性达95.3%以上,而氨基酸同源性为96.0%以上。
图4 HA基因的cDNA的PCR鉴定
M:DL2000 DNA marker (bp), 1、 2、5、6、7为PCR鉴定阳性菌落;3、4、8为阴性菌落
Fig.4 Indentification of cDNA from HA gene by PCR
M:DL2000 DNA marker (bp), 1、 2、5、6、7:prositive velum ,3、4、8:negative velum
3.3 重组表达质粒的鉴定
PCR鉴定(图5)得到阳性克隆,抽提质粒。重组表达质粒双酶切产物电泳后(图6),得到一大一小两个片段,其中小片段与目的基因片段大小一致,表明重组质粒pMXB-HA已构建成功。
图5 重组质粒 PCR鉴定
M:DL2000 DNA marker (bp), 1、 2、3、4为PCR鉴定阳性菌落
Fig.5 Identification of recombibant plamisds by PCR
M:DL2000 DNA marker (bp), 1、 2、3、4:positive velum by PCR
图6 重组质粒的酶切鉴定
1 DNA marker DL 15 000(bp); 2 pMXB-HA重组质粒EcoRI/XhoI双酶切鉴定
Fig.6 Indentification of recombinant plamids by digestion with restriction endonucleases
1 DNA marker DL 15 000(bp);2 pMXB-HA digested by E.coRI/XhoI
3.3 HA基因的序列测定
序列测定后推导出相应的氨基酸序列,如图7(见附件)。结果表明其基因序列全长为1701bp,共编码566个氨基酸。
3.4 HA基因同源性分析和系统发育树分析
3.4.1 HA基因推导蛋白质的同源性分析
经过测序可以知道SIV H1N1 HA基因长是1701bp, 共编码566个氨基酸。用DNAstar软件对A/swine/Guangdong/2/01(H1N1)、A/Swine/Wisconsin/163/97(H1N1)、A/Swine/Wisconsin/166/97(H1N1)、A/Swine/Wisconsin/235/97(H1N1)进行同源性分析,发现其同源性高达95%以上,图8
图8 四种SIV H1N1 HA基因的同源性分析
Fig.8 congenetic analysis among four similar SIV H1N1 HA
3.4.2 系统进化树分析
根据http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi 的分析结果, Distance tree of results进行A/swine/Guangdong/2/01(H1N1)和其参考毒株的进化树分析,如图9(见附件)
3.5 HA基因及其氨基酸的生物信息学分析
3.5.1 HA基因稀有密码子预测
图10 HA基因的稀有密码子预测
Fig.10 rare code of analysis of HA gene
H1N1 HA 有54个稀有密码子,约占9.5%;分别有11个ATA编码异亮氨酸;20个AGA、2个AGG以及1个CGA编码精氨酸;4个CCC编码亮氨酸;16个CTA编码脯氨酸
3.5.2 HA蛋白的信号肽预测
(1)SignalP-NN result
图11 HA蛋白的信号肽预测(SignalP-NN)
Fig.11 signal P-NN prediction of deduced Amid Acids of SIV H1N1 HA
(2)SignalP-HMM result
图12 HA蛋白的信号肽预测(SignalP-HMM)
Fig.12 signal P-HMM prediction of deduced Amid Acids of SIV H1N1 HA
信号肽切割位点位于30和31位氨基酸残基之间
3.5.3 HA蛋白的跨膜区预测
图13 SIV H1N1 HA基因推导的氨基酸的跨膜区预测
Fig.13 Transmembrane helices prediction of deduced Amid Acids of SIV H1N1 HA
3.5.4 HA蛋白的疏水性分析
图14 SIV H1N1 HA 氨基酸序列的疏水性预测
Fig.14 Hydrophobicity prediction of deduced Amid Acids of SIV H1N1 HA
该氨基酸序列主要有12段疏水区,分别位于4-20位,60-95位,150-165位,190-198位,210-218位,250-290位,310-320位,340-360位,390-405位,435-450位,525-550位。与疏水区相比,亲水区占据了该肽链大部分区域。
3.5.5 HA蛋白的二级结构预测
图15 SIV H1N1 HA基因推导的蛋白质的二级结构预测
Fig.15 Prediction of secondary structure of the deduced proteins of SIV H1N1 HA
3.5.6 HA蛋白抗原位点的预测
图16 SIV H1N1 HA基因推导的蛋白质的抗原位点的预测(表格见附件)
Fig.16 location of Antigencity prediction of the deduced proteins of SIV H1N1 HA
3.5.7 HA蛋白的磷酸化位点预测
图17 SIV H1N1 HA基因推导的氨基酸的磷酸化位点预测
Fig.17 Prediction of Phosphorylation sites of deduced Amid Acids of SIV H1N1 HA
当取阈值为0.5的时候,在该序列中共有34个潜在的磷酸化位点。
3.5.8 HA蛋白的N-糖基化位点预测
图18 SIV H1N1 HA基因推导的氨基酸的N-糖基化位点预测
Fig.18 Prediction of N-Glycosylation potential sites of deduced Amid Acids of SIV H1N1 HA
当取阈值为0.5的时候,在该序列中共有6个潜在的糖基化位点。
3.6 HA基因在大肠杆菌中的诱导表达
用SDS-PAGE检测表达产物(如图19), 与诱导前相比,在相对分子质量约94.0Ku处出现明显的诱导蛋白条带,分子量大小与预期一致。用Ni-TNA树脂过柱纯化表达的融合蛋白,可以获得高纯度的目的蛋白(如图20)。
图19 HA融合蛋白的不同小时诱导SDS-PAGE 分析
M:蛋白质相对分子量标准,1、2为未加IPTG的细菌裂解产物,
3-7:分别为IPTG诱导0h、1h、3h、4h和5h的细菌裂解产物
Fig.19 SDS-PAGE analysis of the expressed fusion protein
M:Relative molecular mass of protein marker,1、2:BL-21(DE3) cell lysis without IPTG;3-7: BL-21(DE3) cell lysis after induction for 0,1,3,4 and 5h respectively
图20 HA融合蛋白的纯化
M:蛋白质分子量标准; 1、3:elution buffer洗脱产物即纯化的HA蛋白,2:表达的msyB-HA总蛋白
Fig.20 purification of the expressed fusion protein
M:Relative molecular mass of protein marker,1、3:HA protein of purification by elution buffer,2:total protein of the expression msyB-HA
3.7 表达产物的可溶性分析及免疫印迹(Western Blot)检测
经蛋白可溶性分析看出,融合蛋白90%以上是以可溶形式表达的,如图21。经SDS-PAGE电泳,然后转移硝酸纤维素膜,用特异性的猪流感阳性血清对HA融合蛋白进行免疫印迹分析(Western Blot),如图22。酸纤维素膜上具有一条活性带,大小与SDS-PAGE表达的蛋白大小一致。证实了用载体pMBX表达的融合蛋白HA具有免疫活性。
图21 HA基因表达产物的可溶性分析
M、蛋白质分子量标准(ku);
1、细菌裂解物上清的SDS-PAGE;
2、细菌裂解物沉淀的SDS-PAGE;
Fig.21 SDS-PAGE analysis of the expressed Production of SIV H1N1 HA gene
M:Relative molecular mass of protein marker,
1: SDS-PAGE of supernatant of HA protein lysis;
2: SDS-PAGE of sediment of HA protein lysis
图22 HA基因表达产物Westen blot分析
M、预染蛋白质分子量标准(ku)
1、H1N1 SIV HA融合蛋白的Westen blot;
Fig.22 western-blot analysis of recombinant protein HA;
M:Relative molecular mass of protein marker,
1: recombinant protein HA of H1N1 from SIV
3.8 H1N1 SIV HA单克隆抗体的制备与特异性试验
3.8.1 H1N1 SIV HA单克隆抗体的制备结果
经过细胞融合,阳性孔上清用ELISA(用纯化的HA蛋白作包被抗原)试验筛选,阳性细胞株经无限稀释法克隆,筛选到III F6A4C10、ID4A3F8两株能高效分泌HA蛋白特异性的单克隆抗体。III F6A4C10为IgG1亚类,K轻链;ID4A3F8为IgG2a亚类,κ轻链。
3.8.2 H1N1 SIV HA单克隆抗体特异性试验结果
用ELISA方法检测,两株单抗IIIF6A4C10、ID4A3F8中I D4A3F8与H1、H9、H5亚型流感病毒有交叉反应;仅III F6A4C10单抗与H5、H9亚型AIV不反应,仅与H1亚型流感病毒反应。证明III F6A4C10单抗有较好的特异性。
3.9 间接ELISA方法的建立
3.9.1抗原抗体最佳稀释度的确定
用点阵滴定法,将H1N1 SIV单克隆抗体和标准H1N1 SIV抗原做系列稀释,试验结果表明,当H1N1 SIV单克隆抗体分别以10ug/mL包被,标准H1N1 SIV抗原分别以11.4ug/mL包被,血清均以240倍稀释时P/N值最大,即为抗原抗体最佳稀释度。具体结果如图23所示。注:P/N值为标准阳性血清OD450 / 标准阴性血清OD450。
3.9.2 封闭液的选择
将抗原以最适浓度包被,各加入1份阳性和1份阴性对照血清反应,按ELISA步骤操作,分别用3%BSA和5%脱脂奶粉作为封闭液,以0.5% BSA和1% 脱脂奶粉作为样品稀释液,对同一样品进行反复三次测定OD450。对比ELISA试验结果,计算P/N值,结果表明以3% BSA/PBS封闭、0.5% BSA/PBS作为抗体稀释液时效果较好。
3.9.3 待测样品的检测
用纯化IIIF6A4C10单克隆抗体包被酶标板,用建立的ELISA方法,检测10个野外分离的待测病毒样品,结果从待检10份样品中能检测出4份阳性样品,与病毒分离结果相符。
4、讨论
研究表明,H1N1亚型SIV HA基因全长1 701 bp,共编码556个氨基酸,是病毒表面主要糖蛋白之一,在病毒吸附、穿膜以及决定病毒的宿主特异性和致病力方面均起着相当关键的作用,HA是SIV保护性免疫的主要抗原,它不仅可以诱导特异性中和抗体的产生,而且还可以刺激机体产生细胞毒性淋巴细胞(CTL)反应。所以,用重组SIV HA蛋白检测到的抗体代表了猪体保护性抗体水平的高低。国内外已对检测猪流感抗体的ELISA方法进行了不少研究,HA蛋白的原核表达多以包涵体形式存在,不利于蛋白的生物活性检测。不少学者尝试用真核表达系统表达HA蛋白,但蛋白的表达量不高,且表达过程远比原核表达繁琐。
本试验通过基因工程方法,利用表达载体pMXB成功地表达了H1N1亚型SIV的HA基因,表达产量占菌体蛋白的29.5%,且大部分以可溶的形式表达,这给目的蛋白纯化提供了方便。为进一步利用重组蛋白研制检测H1N1亚型SIV特异性抗体的血清学方法,以及研制针对H1N1亚型SIV HA蛋白的单克隆抗体提供了基础。Western Blot 检测结果表明,表达的HA 融合蛋白能够与H1N1亚型SIV 阳性血清发生特异性的反应,具有很好的反应原性,研究了将重组H1N1亚型SIV HA蛋白作为ELISA诊断抗原的可行性,为检测H1N1亚型SIV抗体的间接ELISA方法的建立奠定了基础。
在试验中,我们直接煮沸裂解的诱导表达H1N1亚型SIV HA融合蛋白的菌体进行SDS-PAGE,将特异性的猪流感阳性血清用经超声波破碎的大肠杆菌吸附后作为Western Blot分析的一抗。从Western Blot的结果来看,经吸附后的血清只与大肠杆菌中的重组蛋白反应,产生一条特异性条带,说明用破碎的大肠杆菌做抗原吸附免疫获得的阳性血清中的大肠杆菌抗体,可减少非特异性条带出现。
经过生物信息学分析得出,猪流感病毒 H1N1亚型血凝素(HA)蛋白主要位于病毒的衣壳表面,属于主要的保护性抗原。因此,在某种程度来说,HA基因的变异程度将直接影响对该病毒的防治。从
A/swine/Guangdong/2/01(H1N1)、A/swine/Wisconsin/163/97(H1N1)、A/Swine/Wisconsin/166/97(H1N1)、A/Swine/Wisconsin/235/97(H1N1)的同源性分析来看,不同地方SIV的H1N1 分离株编码HA基因的氨基酸的数目相同,但碱基和氨基酸的变化各有不同,其同源性的概率也不一样,但是其同源性也很高,达95%以上,碱基差异数也不大。这可能说明该基因的相对保守的。进化树分析表明SIV H1N1 HA的种类很多,各株的亲缘关系也不一样,详细见图8。
Bioedit软件的疏水性分析,基线上方+3.0代表疏水性,基线下方-3.0代表亲水性,由图14分析表明该蛋白是一种亲水性蛋白质,一般来说,疏水性程度高较高的肽段包含抗原决定簇的可能性较大,图13跨膜预测表明它是一种膜外蛋白,这些预测的结果都与事实相符。二级结构预测该蛋白各个部位出现无规则卷曲(Coil)、β-折叠(Strand)、 α-螺旋(Helix)的趋势,末端的氨基酸区域是α-螺旋结构,大部分氨基酸区域都是无规则卷曲,β-折叠结构分布于整个蛋白质的各个区域,而β-折叠对于蛋白的稳定有重要作用,这也可能是HA蛋白比较保守的原因之一。
对推测的氨基酸序列进行磷酸化位点和N-糖基化位点分析显示:它具有34个潜在的磷酸化位点,这对于该氨基酸作为转录因子行使功能具有非常重要的作用。分子结构中有6个糖基化位点,为别位于第28位(NSTD)、40位(NVTV)、104位(NGTC)、304位(NTSL)、498位(NGTY)、557位(NGSL),其功能尚未弄清。
据了解当前猪流感免疫疫苗主要时灭火疫苗及弱毒疫苗,因此对亚单位疫苗及基因疫苗的研究就显得有广阔的前景,从而有望成为灭火疫苗的有效补充。通过本次对H1N1亚型猪流感病毒血凝素(HA)基因的生物信息学分析和高效可溶表达的研究,从而为新型猪流感基因疫苗的研究奠定基础。
参考文献
[1] Dan E.Krane&Michael L.Raymer著. 孙啸等译. 生物信息学概论[M]. 北京:清华大学出版社,2004
[2] 蒋彦,王小行等. 基础生物信息学以及应用[M]. 北京:清华大学出版社,2003
[3] David W.Mount,Bioinformatics Sequence and Genome Analysis(影印版)[M]. 北京:科学出版社,2002
[4] 陈润生. 生物信息学[J]. 生物物理学报,1999,1000-6737
[5] 胡永浩,姚学萍,李海燕等. H1N1 猪流感广东株血凝素基因的克
隆与序列分析[J]. 畜牧兽医学报,2005,36(2):172-176
[6] Neumeier E,Meier-Ewert H.Nucleotide sequence analysis of the HA1 coding portion of the haemagglutinin gene of swine H1N1 influenza viruses[J]. Virus Res,1992,23:107-117
[7] SAMBROOK J,FRITSCH E F,MANIATIS. 分子克隆实验指导[M].第二版. 金东雁,黎孟枫译. 北京:科学出版社,1996:880-898
[8] Pensaert M,Ottis K,Vandeputte J,et al.Evidence of natural transm-
ission of influenza A virus from wild ducks to swine and its potential importance for man[J]. 1981,59:75-87
[9] Guan Y,Shortridge KF,Krauss S,et al.Emergence of avian H1N1
influenza viruses in pigs in China[J]. J Virol,1996,70:8041-8046.
[10] Deng M D,Coleman J R. Ethanol Synthesis by Genetic Enginee-
Ring in Cyanobacteria[M].Apply Environ Microbiol,1999
[11] 张惠展. 途径工程——第三代基因工程[M]. 北京:中国轻工业
出版社,2002
[12] Romanos M. Ad
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