喜树根器官培养和抗癌物质喜树碱生成的研究

喜树根器官培养和抗癌物质喜树碱生成的研究,喜树,器官,培养,抗癌,物质,喜树碱,生成,研究 喜树根器官培养和抗癌物质喜树碱生成的研究袁月姗 刘梓璇指导老师： 吴鸿（教授） 杨跃生（教授）(华南农业大学 生命科学学院 广州 510642)摘要:我国特有树种喜树产生的喜树碱是一种具有抗癌活性的物质，利用生物技术将有可能解决喜树资源匮乏的问题，生产出更多的喜树碱应用于临床治疗。本研究以离体根器官为材料，采用了固体和液体悬浮培养方法对喜树根在离体条件下的生长状况和特点进行了探讨。在此基础上，通过组织化学技术和薄层色谱技术（TLC）对离体培养的根中的喜树碱进行了定性和定量分析。实验结果表明，离体培养的根器官不仅具有生成喜树碱的能力，而且其能力还可能强于非离体的根。同时，试验还发现喜树离体根能够很好地适应液体培养的环境条件。离体根具有很好的对液体培养的适应性以及更强的合成喜树碱的能力是进行根培养工业化生产的非常有利的内因条件。这些研究结果为应用生物技术大量培养离体根生产喜树碱提供了重要的依据。关键词: 喜树 根器官培养 喜树碱 TLC含量测定喜树（Camptotheca acuminata Decne）为珙桐科（Nyssaceae）植物，我国南方特有树种。1966年，美国的Wall等人从喜树茎的提取物中分离得到了抗癌活性物质，将其命名为喜树碱（Comptothecin, CPT）。1985年，Hisang等人发现喜树碱作为一种拓扑异构酶（Topo）的抑制剂具有抗癌活性，因而为喜树碱的进一步临床应用提供了理论基础。经临床试验证明，喜树碱对30余种肿瘤均有明显疗效,且毒副作用小,具有极高的临床应用价值（崔岚和戈升荣，1999）。由于长期以来过度采伐、自然环境的破坏以及人工培育技术滞后等原因, 目前的喜树资源十分有限。1999年8月经国务院批准，喜树被列为第一批国家重点保护野生植物，保护级别为级。喜树以种子繁殖为主，但其种子发芽率低，加之扦插繁殖困难，在一定程度上限制了喜树资源的开发利用（张启香和方炎明，2005）。虽然目前利用植物组织培养方法已可获得喜树种苗（吕立堂等，2003；陈颖等，2004），然而，由于栽培周期过长及土地资源的日益紧缺，传统栽培方式在提供喜树原材料方面存在着难以解决的问题。因此，近年来用生物技术的方式生成喜树碱的工作得到了国内外研究人员的重视（张冬艳等，2002；邓冬青等，2004；Lorence等，2004；郭勇等，2005）。本研究采用喜树的根为离体培养的材料，并利用仪器和组织化学分析方法对根在离体培养条件下的喜树碱生成情况进行试验分析，旨在探讨离体根对培养条件的要求以及了解离体根器官的喜树碱合成能力，为应用生物技术生产喜树碱提供理论依据和技术资料。1 材料与方法1.1 材料原始材料采自华南农业大学校园内约20年树龄的喜树。于九月份从树上采集果实，剥取种子。先用洗涤剂与清水间隔冲洗各三次，再用79%乙醇泡洗三十秒，最后用0.7%次氯酸钠溶液对种子进行10分钟的表面灭菌。灭菌后用无菌水漂洗三次，在无菌操作台中将种壳和种皮剥去，取幼胚作为培养的出发材料。 1.2 方法1.2.1 植物组织培养 幼胚萌发培养：采用不添加激素的MS琼脂培养基，每个培养基接种3个幼胚。增殖培养：以幼胚萌发培养基为基础，添加蔗糖2%和BA 1.0mg/L，将萌发生长的小苗从茎上切开成带侧芽的小段，每段作为一个外植体，接种到培养基上。 生根培养：将带有4到5片幼叶的无根幼茎接种到含有2%蔗糖的大量无机元素减半的MS琼脂培养基上培养，诱导不定根产生。根器官琼脂培养基培养：采用大量无机元素减半的B5培养基配方，添加蔗糖2%，IBA 0.5mg/L，酵母浸出物800mg/L。从以上生根培养中得到的小苗上切取幼根作为培养材料。根器官液体悬浮培养：培养基成分和根器官的琼脂培养基相同，但不添加琼脂。以上各种培养，除了幼胚的萌发培养早期(7d)在黑暗的条件下进行外，都在光照条件下进行。每天光照12小时；光照度1500-2000Lx。温度为（252）；1.2.2 荧光显微法观察植株中喜树碱的分布在培养结束后对生长情况相似的3个样品进行徒手切片，以标准品溶液抹片为正对照，在紫外光显微镜下观察有无喜树碱的生成（喜树碱在紫外光下发蓝绿色荧光）以及喜树碱分布的部位。为进一步分析观察所得荧光是否属于喜树碱，将一幼根做成压片后观察荧光情况，照相；然后对其进行乙醇处理12小时以溶去喜树碱，再观察荧光情况并拍照。对比乙醇处理前后荧光亮度的变化。1.2.3 乙醇超声法提取喜树幼根中喜树碱准确称取新鲜喜树幼根1g，置于研钵中，加入适量无水乙醇，研磨成匀浆，超声提取50min，冷却至室温，离心。收集上清液。重复超声提取两次。合并上清液，用真空干燥器浓缩至5mL，备用。 1.2.4薄层色谱法TLC测定喜树碱含量1.2.4.1标准液的制备精密称取喜树碱标准品5.2mg于50mL容量瓶中，用无水乙醇为溶剂超声溶解并定容至刻度，作为对照品母液，备用。1.2.4.2色谱试验条件展开剂氯仿：甲醇=9：1，体积：10mL；检测波长：254nm;点样量：5L。1.2.4.3标准曲线的绘制精密吸取对照品溶液2mL并将其稀释至4mL，再以此为母液准确吸取2mL并将其稀释至4mL，如此类推进行逐级稀释共6次，最终得到浓度分别为1.625g/L、3.25g/L、6.5g/L、13g/L、26g/L以及52g/L的标准品溶液。按照上述色谱试验条件，分别取标准品及待测样品间隔点样，进行薄层色谱展开后分析，每样重复测定三次。 1.2.4.4喜树碱提取率的测定浓缩后的样品液在上述色谱条件下分析，计算喜树碱的浓度及含量。2 结果与分析2.1 幼胚培养经过培养，幼胚的萌发率达到95%。而污染率仅为3.5%。本结果表明，在9月份取材得到幼胚进行培养是合适的。试验过程中发现，过早取材，胚胎过小，难以操作并且在培养操作时容易造成对胚胎的损伤；过迟则由于种壳过硬，胚胎和种壳紧密接触，很难以从种壳中分离出来。幼胚经过培养，可以生长成为健康的小苗；将小苗从茎部切开取上部芽条培养，芽条的基部能够形成多数的不定根（图1,图2）。图1 幼胚萌发所得幼苗 图2 芽条诱导产生不定根2.2喜树小苗幼根的喜树碱定性分析结合徒手切片技术以及荧光显微技术，参照标准品的荧光特征，对组培小苗根中的喜树碱分布状况进行定性分析。结果表明，喜树幼根、幼茎及幼叶中均有喜树碱分布，与文献报道（刘文哲和王自芬，2004）结果一致（图36）。 图3 喜树碱标准品抹片 图4 喜树组培幼根压片 图5 喜树组培幼叶横切片 图6 喜树组培幼茎横切片对比乙醇处理前后的喜树幼根中相同部位的荧光强度，初步确定荧光显微镜下观察到的荧光为喜树幼根中结构性物质及喜树碱共同作用产生的荧光（图 7）。bba dc图7：乙醇处理前、后，喜树组培幼根压片示荧光强度a为处理前; b为处理后2.3喜树碱定量分析方法学验证本研究通过大量重复实验证明利用薄层层析（TLC）对喜树碱进行分离纯化，并通过紫外光灯的荧光显色作用，用平面色谱图像定量软件ImageQuan处理，通过样品与标准品荧光亮度的比较，能够可靠地测定样品中喜树碱的含量（龚苏晓，2003；张志信等，2003）。 由于拍摄条件光线等差异，每次点样进行薄层层析均要同时进行标准曲线的绘制，同一条标准曲线不能重复用于不同批次的数据分析。经反复验证，平面色谱图像定量软件ImageQuan法重复性好，精密度能达到较高水平。与高效液相色谱仪（HPLC）相比，是一种较为有效价廉的定量方法（图8）。图8：喜树碱紫外荧光斑点从左到右分别为：标准品1、样品1-1、样品1-2、标准品2、样品2-1、样品2-2、标准品3。用平面色谱图像定量软件ImageQuan处理得到标准曲线如图9。2.4液体悬浮培养的根的喜树碱定量分析在成功地对根进行离体增殖培养的基础上，分别测定组培小苗幼根与液体悬浮培养的根中的喜树碱的含量。根据薄层层析荧光显色结果分析，可得离体培养前后喜树根中喜树碱的变化情况（表1）。表1的实验数据说明，离体培养的喜树根具有合成喜树碱的能力，表现为单位重量的喜树幼根中喜树碱含量的增加。其中，培养时间为30天，1克喜树根平均增加喜树碱约3.3微克。离体培养的根中的喜树碱的浓度比组培小苗的根中的喜树碱浓度要高的情况，可能和组培苗的根所合成的部分喜树碱转移至茎叶中去有关，但还需进一步研究予以确认。表1离体培养前后喜树根中喜树碱的变化情况分析项目离体培养前（固体培养）离体培养后（液体培养）培养前后之差喜树碱浓度平均值(g/mL)0.7761.3750.599喜树碱含量平均值（g/L FWw）3.686.9653.2852.5 固体培养基与液体培养基的效果比较固体培养基培养是植物组织培养的主要方式，但液体培养方式则相对更有利于大规模的工业化生产（刘展眉等，2006）。固体培养基与液体培养基的培养效果的比较如表2所示。表2 固体培养基与液体培养基的培养效果比较培养方式根长度增量平均值(cm)喜树碱含量平均增量（g/g FWw）幼根形态固体培养基0.62.90短粗，颜色较黑，活力较差液体培养基0.83.28正常 从表2可看出，液体培养基从多方面培养效果均优于固体培养基。这说明，作为木本植物的喜树的离体根也能够很好地适应液体培养的环境条件。喜树根的这种生长特性为液体培养的大规模生产提供了方便。3 讨论和结论植物细胞工程在离体培养方面可以分为三个层次，即细胞水平、组织水平和器官水平。由于愈伤组织具有增殖相对较快的特点，是通常进行次生物质生成研究时采用的主要的组织类型。利用愈伤组织培养生产喜树碱的研究最早为Sakato等（1974）所报道，而近年来这方面的有关报道仍然不少（Hengel等，1992；Wiedenfeld等，1997，邓冬青等，2004；郭勇等，2005）。从结果看，这些研究都不够理想，主要是在愈伤组织中难以检测到喜树碱的存在，或仅有痕量的存在。例如，张冬艳等（2002）采用叶片诱导愈伤组织和进行增殖培养，发现愈伤组织仅能够产生相当于幼叶喜树碱浓度5%的痕量喜树碱。这些结果表明，作为次生代谢产物的喜树碱的生成可能需要特定的分化的器官组织，要调控没有分化的愈伤组织细胞生成喜树碱难度很大（顾青等，2006）。为了解决愈伤组织喜树碱生成能力低下的问题，Lorence等（2004）利用发根农杆菌转化喜树叶片得到了毛状根，并从这些毛状根中检测到浓度和正常根类似的喜树碱，但该方法尚存在毛状根的增殖速度和产物的安全性问题。次生代谢物质的合成场所的确定是研究这些合成代谢途径及其调控机理的基础。因此，关于特定代谢产物的合成场所一直以来都是植物学研究的一个重要课题。喜树碱在植物体内的合成场所的研究初见于1994年，该研究指出喜树的叶片不具有生成喜树碱的能力（Lopez-Meyer等，1994）；两年后由Liu 和Adams（1996）的研究结果显示喜树碱是在根中合成。此后，Yamazaki（2003）等利用生物化学方法对喜树碱合成相关酶的分布进行研究，进一步明确喜树碱的合成场所是在喜树的根部。不久前Liu（2004）采用组织学和组织化学方法对喜树碱在植物体内的合成部位进行研究，发现植物的茎和叶中的分泌道也有喜树碱分布，据此推测其喜树碱可能在根中合成，然后转移到茎和叶中，并在分泌道中积累。在本研究中，离体的喜树根中的喜树碱的浓度超过了非离体的根的喜树碱浓度。这个结果，为根作为喜树碱合成的主要场所提供了又一重要的证据。植物的根是能够进行无限生长的器官，又在多种情况下是合成某种特殊的次生代谢产物的重要场所甚至是唯一的场所，因此，根器官培养相对于其他培养在次生物质生产方面具有特殊的优势。在一般情况下，相对于草本植物，木本植物根器官的离体培养比较困难，因此，喜树根的离体培养至今未见报道。本研究对喜树根的离体培养特性以及离体培养的根的喜树碱的生成能力进行了试验。通过试验确认了离体培养的根器官不仅具有生成喜树碱的能力，而且其能力可能还强于非离体的根。同时，试验还发现喜树离体根能够很好地适应液体培养的环境条件。这些研究结果为应用生物技术大量培养离体根生产喜树碱提供了有力的事实依据。参考文献陈颖，曹富亮，李淑斓，谢寅峰。喜树不定芽的诱导及植株再生。植物生理学通讯，2004，40（5）：579崔岚，戈升荣。喜树抗癌作用的研究上海医院医学，1999,10(3): 8-12邓冬青，李跃春，张长弓，等。喜树愈伤组织培养及喜树碱的产生研究。医药导报，2004， 23（5）：287289龚苏晓（译）。喜树中喜树碱的快速痕量测定，国外医学中医中药分册，2003，25（1）：43-44顾青，宋达峰，张虹，等。Cu2对喜树愈伤细胞中喜树碱合成的影响。生物工程学报，2006，22（4）：624628郭勇，林桂芸，陈宏志，等。喜树愈伤组织的诱导及喜树碱含量研究。四川林勘设计，2005，2：1316刘文哲，王自芬。喜树幼枝的喜树碱积累及其组织内定位。植物生理与分子生物学报，2004，30（4）：405-412刘展眉，崔英德，宾淑英。喜树基喜树碱研究中的生物技术应用。广东化工，2006，6（33）：67-70 吕立堂，朱冬雪，赵德刚。喜树快速繁殖与再生体系建立。分子植物育种，2003，1：829830张冬艳，赵心清，于放，等。喜树愈伤组织诱导及喜树碱的产生。东北师大学报自然科学版，2002，34（1）：4548张启香，方炎明。喜树组织培养初步研究。江苏林业科技，2005，32（3）：1-3张志信，张仕秀，宋关斌。从喜树叶中提取喜树碱工艺研究。生物技术，2003，13（5）：24-25Hengel AJ, Harkes MP, Wichers HJ, et al. 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Phytochem, 2003.62:461-470 Studies on Root Organ Culture and the Production of Anticancer Compounds in Camptotheca acuminata DecneYuan Yueshan，Liu ZixuanAdvisors: Wu Hong (professor), Yang Yuesheng (professor)(College of Life Sciences, South China Agricultural University, Guangzhou 510642)Abstract: Camptotheca acuminata is one kind of trees located exclusively in China and comptothecin (CPT) having anticancer activity is produced by these trees. Application of biotechnology may solve the problem of resource deficiency of Camptotheca acuminata and produce more CPT to meet the demand in cancer treatment. The present research used isolated root organs as material and applied liquid suspension culture as well as solidified medium culture for the studies on the characteristics of growth of the roots. On the bases of the above experiments, the cultured roots were analyzed histochemically and by thin layer chromatography (TLC) for CPT. Results of the experiments indicated that not only could the isolated roots produce CPT, the CPT production ability was even stronger than that of the non-isolated ones. In the experiments it was also found that the isolated roots could well adapt to the liquid culture conditions. These results can be applied for the production of CPT by large-scale industrial means of culture of isolated Camptotheca acuminata roots.Key words: Camptotheca acuminata; root organ culture; comptothecin; TLC analysis