H1N1 SIV HA蛋白的生物信息学分析、高效可溶表达及鉴别诊断SIV的夹心ELISA方法的建立

H1N1 SIV HA蛋白的生物信息学分析、高效可溶表达及鉴别诊断SIV的夹心ELISA方法的建立,H1N1,SIV,HA蛋白的生物信息学分析、高效可溶表达及鉴别诊断SIV的夹心ELISA方法的建立,HA,蛋白,生物,信息学,分析,高效,可溶,表达,鉴别,诊断,夹心,ELISA,方法,建立 序号： 编码： 第十届“挑战杯”全国大学生课外学术科技作品竞赛 作品申报书 作品名称：H1N1 SIV HA蛋白的生物信息学分析、高效可溶表达及鉴别诊断SIV的夹心ELISA方法的建立 学校全称： 华 南 农 业 大 学 申报者姓名 （集体名称）： 谢易恒 李栋 苏培穗 陈成果 周科 黄慧雄 类别： √ 自然科学类学术论文 □哲学社会科学类社会调查报告和学术论文 □科技发明制作A类 □科技发明制作B类 报送方式： √ 省级报送作品 □高校直送作品 说 明 1．申报者应在认真阅读此说明各项内容后按要求详细填写。 2．申报者在填写申报作品情况时只需根据个人项目或集体项目填写A1或A2表，根据作品类别（自然科学类学术论文、哲学社会科学类社会调查报告和学术论文、科技发明制作）分别填写B1、B2或B3表。所有申报者可根据情况填写C表。 3．表内项目填写时一律用钢笔或打印，字迹要端正、清楚，此申报书可复制。 4．序号、编码由第十届“挑战杯”全国大学生课外学术科技作品竞赛全国组委会填写。 5．学术论文、社会调查报告及所附的有关材料必须是中文（若是外文，请附中文本），请以4号楷体打印在A4纸上，附于申报书后，字数在8000字左右（文章版面尺寸14.5×22cm）。 6．发起高校的三件直送作品和各省（区、市）通过初评的作品（数量参照“作品数额分配方案”）各一式四份分别按全国组委会规定的时间用特快专递寄至全国竞赛组委会办公室。 7．作品申报书须按要求由各省或各校竞赛组织协调机构统一寄送。 8．其他参赛事宜请向本校竞赛组织协调机构咨询。 9．寄送地址：南开大学团委第十届“挑战杯”全国大学生课外学术科技作品竞赛组委会办公室 联 系 人：韩旭 联系电话：（022）23508540 传 真：（022）23508540 邮政编码：300071 A2．申报者情况（集体项目） 说明：1.必须由申报者本人按要求填写； 2.申报者代表必须是作者中学历最高者，其余作者按学历高低排列； 3.本表中的学籍管理部门签章视为对申报者情况的确认。 申报者代表情况 姓名 谢易恒 性别 男 出生年月 1985.05 学校 华南农业大学 系别、专业、年级 动物科学（生物工程方向） 学历 本科生 学制 四年 入学时间 2004年9月 作品名称 H1N1 SIV HA蛋白的生物信息学分析、高效可溶表达及鉴别诊断SIV的夹心ELISA方法的建立 毕业论文题目 通讯地址 华南农业大学动物科学学院 邮政编码 510642 办公电话 常住地 通讯地址 华南农业大学五山学生公寓5幢307 邮政编码 510642 住宅电话 13450378036 其他作者情况 姓 名 性别 年龄 学历 所在单位 李 栋 男 21 本科 动物科学学院04级生物工程1班 苏培穗 男 24 本科 动物科学学院04级生物工程1班 陈成果 男 23 本科 动物科学学院04级生物工程1班 周 科 男 22 本科 动物科学学院04级生物工程1班 黄慧雄 男 24 本科 动物科学学院03级生物工程2班 资格认定 学校学籍管理部门意见 以上作者是否为2007年7月1日前正式注册在校的全日制非成人教育、非在职的高等学校中国籍专科生、本科生、硕士研究生或博士研究生。 √是 □否 （部门签章） 2007年6月11日 院、系负责人 或导师意见 本作品是否为课外学术科技或社会实践活动成果。 √是 □否 负责人签名： 2007年6月11日 B1．申报作品情况（自然科学类学术论文） 说明：1．必须由申报者本人填写； 2．本部分中的科研管理部门签章视为对申报者所填内容的确认； 3．作品分类请按作品的学术方向或所涉及的主要学科领域填写； 4．硕士研究生、博士研究生作品不在此列。 作品全称 H1N1 SIV HA蛋白的生物信息学分析、高效可溶表达及鉴别诊断SIV的夹心ELISA方法的建立 作 品 分 类 （D ）A．机械与控制（包括机械、仪器仪表、自动化控 制、工程、交通、建筑等） B．信息技术（包括计算机、电信、通讯、电子等） C．数理（包括数学、物理、地球与空间科学等） D．生命科学（包括生物、农学、药学、医学、健 康、卫生、食品等） E．能源化工（包括能源、材料、石油、化学、化 工、生态、环保等） 作品撰写的目的和基本思路 本研究的目的是开发猪流感基因工程疫苗和建立快速鉴别诊断猪流感病毒的方法，对猪流感的防控提供理论指导。 基本思路：对H1N1亚型猪流感病毒（SIV）血凝素基因(HA)进行生物信息学分析，同时高效可溶表达H1N1 SIV HA抗原蛋白，用猪流感病毒免疫小鼠制备SIV HA抗原特异的单克隆抗体，用获得的猪流感病毒HA抗原特异的单克隆抗体建立鉴别诊断猪流感的ELISA方法 作品的科学性、先进性及独特之处 本研究应用生物信息学的相关知识对SIV H1N1 HA基因及其氨基酸序列进行分析，在了解HA蛋白的结构和功能基础上，高效可溶表达HA蛋白；选用本研究室改造的pBCX高效可溶表达载体（正在申请专利）高效可溶表达H1N1 SIV 的HA蛋白。改造的载体选用msyB蛋白作为融合伴侣，使HA融合蛋白高效可溶表达，突破了传统大肠杆菌表达系统包涵体表达外源蛋白（多肽）的技术瓶颈。用纯化的HA蛋白做包被抗原，在制备猪流感病毒单克隆抗体时筛选针对SIV HA蛋白的单克隆抗体；用获得的猪流感病毒HA抗原特异的单克隆抗体建立了鉴别诊断猪流感的ELISA方法。 用纯化的HA蛋白做成猪流感基因工程疫苗进行动物免疫试验正在进行中。 本研究的独特之处：1、选用新改造的高效可溶表达载体表达HA抗原蛋白；2、制备了猪流感病毒HA蛋白特异性的单克隆抗体，建立了快速鉴别诊断猪流感病毒的ELISA方法。 作品的实际应用价值和现实意义 从HA基因的生物信息学分析、高效可溶表达、猪流感病毒单克隆抗体的制备和鉴别诊断猪流感病毒的间接ELISA方法四方面进行研究，研究了将重组H1N1亚型SIV HA蛋白作为ELISA诊断抗原的可行性，筛选到2株猪流感病毒单克隆抗体，建立检测H1N1亚型SIV的间接ELISA方法，为防治猪流感的打下了基础，为研制猪流感基因工程疫苗提供科学依据，对生产实践具有很好的指导意义。 学 术 论 文 文 摘 猪是流感病毒传播的中间宿主，猪感染猪流感病毒（SIV）后会导致其他疾病如蓝耳病、高热病、圆环病毒病、胸膜肺炎等疾病的发生，给畜牧业造成巨大的经济损失，对人类健康造成了严重威胁。快速诊断和及时监测是控制流感的首要步骤。H1N1亚型猪流感病毒的血凝素（HA)基因在流感病毒传染的过程中与识别靶细胞表面受体在穿膜过程中起重要作用，刺激机体产生的中和抗体可以抵抗病毒感染。本论文采用RT-PCR方法扩增了H1N1亚型猪流感病毒广东株的血凝素（HA）基因，测序后对HA 基因进行生物信息学分析，分析结果表明HA蛋白具有良好的免疫原性，可以作为诊断试剂。然后将HA基因克隆到高效可溶表达载体pBCX上，成功构建重组表达质粒pBCX-HA。将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中表达，SDS-PAGE可检测到分子量约为94.0ku的融合蛋白，通过薄层凝胶扫描分析表明表达产物占菌体总蛋白的29.5％。经蛋白可溶性分析看出，融合蛋白90％以上是以可溶形式表达的。Western-blot证实，可溶表达的融合蛋白与H1N1亚型猪流感病毒阳性血清具有良好的免疫反应性。纯化表达的HA融合蛋白作包被抗原用于猪流感病毒单克隆抗体的筛选，成功筛选到2株猪流感病毒针对HA蛋白抗原表位的单克隆抗体；用制备的SIV单克隆抗体，建立了高特异性的检测H1N1亚型SIV的ELISA方法，为猪流感病毒的快速检测提供有效的方法。 作品在何时、何地、何种机构举行的会议上或报刊上发表及所获奖励 作品在2007年第九届“挑战杯”广东大学生课外学术科技作品 竞赛二等奖。 作品的论文正在整理中。 鉴定结果 该研究成果正在组织材料进行成果鉴定。 请提供对于理解、审查、评价所申报作品具有参考价值的现有技术及技术文献的检索目录 SAMBROOK J,FRITSCH E F,MANIATIS.分子克隆实验指导[M].第二版.金东雁，黎孟枫译.北京：科学出版社，1996:880-898 David W.Mount，Bioinformatics Sequence and Genome Analysis（影 印版）[M].北京：科学出版社，2002 胡永浩，姚学萍，李海燕，等. H1N1 猪流感广东株血凝素基因 的克隆与序列分析[J].畜牧兽医学报，2005，36 (2) :1722176等。 申报材料清单（申报论文一篇，相关资料名称及数量） 申报论文1篇： H1N1 SIV HA蛋白的生物信息学分析、高效可溶表达及鉴别诊断SIV的ELISA方法的建立 科研管理 部门签章 2007年6月11日 C.当前国内外同类课题研究水平概述 说明：1.申报者可根据作品类别和情况填写； 2.填写此栏有助于评审。 猪流感（swine influenza，SI）是由猪流感病毒(属正粘病毒科流感病毒属A型流感病毒，它属于单股负链RNA病毒，基因组大约为13.6kb，由大小不等的8个基因片段组成）引起的一种急性、热性、高度接触性的呼吸道传染病，以突发、高热、流泪、鼻液增多、咳嗽、呼吸困难、衰竭为主要特征。该病一年四季均可发生,不同日龄，性别和品种的猪均可感染，此外也能使人发病。猪是流感病毒传播的中间宿主，猪感染猪流感病毒（SIV）后会导致其他疾病如蓝耳病、圆环病毒病、胸膜肺炎等疾病的发生，给畜牧业造成巨大的经济损失，对人类健康造成了严重威胁。早在1918年，猪流感就在美国大流行，此后每年都有发生，并很快蔓延到许多国家。自1930年shop首次从猪体中分离到猪流感病毒后，目前已证实猪流感已遍布世界各地。根据有关研究资料得知在猪体中广泛流行的猪流感病毒，主要是古典H1N1、类禽H1N1和类人H3N2三种亚型。1998年以前H1N1 猪流感在美国是主要流行。我国的情况更不容忽视，1979年郭元吉对我国不同地区的猪血清进行猪流感检测，H1的平均阳性率为3.8%；而1998年倪汉忠的血清学显示，广东省猪群中H1抗体阳性率为30.9%。张苏华等采用HI和ELISA的方法，于1999年到2002对上海市10区县的30个猪场进行了针对性的调查，结果表明：1999年抗体阳性率为31.6%，而2002年抗体阳性率上升为82.9%。由此说明H1N1流行有上升的趋势。猪流感病毒具有感染人的潜力。作为流感病毒的“混合器”，猪流感病毒在禽－猪－人的种间传播中起到非常重要的作用。另外人类流感和猪流感爆发的平行性和相关性，赋予了猪流感非常重要的公共卫生意义。 目前研究报道的SIV HA蛋白的原核表达几乎是不可溶的微量表达，很难用于基因工程疫苗制备和建立诊断方法；而本研究选用pBCX高效可溶表达载体（本研究室改造的载体，正在申请专利）高效表达H1N1 SIV 的HA蛋白。用msyB基因作为融合伴侣，使HA融合蛋白高效可溶表达，突破了传统大肠杆菌表达系统包涵体表达外源蛋白（多肽）的技术瓶颈。因此选用大肠杆菌msyB多肽基因是构建高效可溶表达载体的最优融合伴侣基因之一。近年来，融合蛋白被广泛应用于生物研究，因其具有双方蛋白的活性，可被用于蛋白的表达、检测、识别和纯化。特别是在免疫治疗和免疫分析以及寻求高效、新型重组药物方面显示了其特有的优势。 目前尚没有建立完善的用针对HA蛋白抗原表位的猪流感病毒单克隆抗体建立的鉴别诊断SIV的ELISA方法。用单克隆抗体进行猪流感的快速检测，具有特异性强，灵敏性高的特点，是其他血清学方法所不能及的。 H1N1亚型猪流感病毒（SIV）的血凝素（hemagglutinin,HA)基因在流感病毒传染的过程中与识别靶细胞表面受体在穿膜过程中起重要作用，刺激机体产生的中和抗体可以抵抗病毒感染。我们采用RT-PCR方法扩增了H1N1亚型猪流感病毒广东株的血凝素HA基因，测序后对HA 基因进行生物信息学分析，分析结果表明HA蛋白具有良好的免疫原性，可以作为诊断试剂。然后将HA基因克隆到高效可溶表达载体pBCX上，成功构建重组表达质粒pBCX-HA。本研究通过薄层凝胶扫描分析表明表达产物占菌体总蛋白的29.5％。经蛋白可溶性分析看出，融合蛋白90％以上是以可溶形式表达的。Western-blot证实，可溶表达的融合蛋白与H1N1亚型猪流感病毒阳性血清具有良好的免疫反应性。 用纯化的HA融合蛋白作包被抗原用于猪流感病毒单克隆抗体的筛选，成功筛选到2株针对HA蛋白表位的猪流感病毒单克隆抗体；用制备的SIV单克隆抗体，建立了高特异性的检测H1N1亚型SIV的ELISA方法，为猪流感病毒的诊断提供新的方法，对生产实践具有重要的指导意义。 D.推荐者情况及对作品的说明 说明：1．由推荐者本人填写； 2．推荐者必须具有高级专业技术职称，并是与申报作品 相同或相关领域的专家学者或专业技术人员（教研组 集体推荐亦可）； 3．推荐者填写此部分，即视为同意推荐； 4．推荐者所在单位签章仅被视为对推荐者身份的确认。 推荐者情况 姓 名 毕英佐 性别 男 年龄 62 职称 教授 工作单位 华南农业大学动物科学学院 通讯地址 广州天河五山483号 华南农业大学动物科学学院 邮政编码 510642 单位电话 020-85280283 住宅电话 推荐者所在 单位签章 毕英佐老师是我校博士生导师。 （签章） 2007年6月11日 请对申报者申报情况的真实性作出阐述 本作品是由谢易恒同学为主的五位同学共同完成，作品内容真实，数据可靠，结论正确。 请对作品的意义、技术水平、适用范围及推广前景作出您的评价 本作品在了解SIV抗原蛋白（HA）的基础上，高效可溶表达了HA蛋白，同时用纯化的HA蛋白做包被抗原，用于猪流感病毒单克隆抗体的筛选，得到2株猪流感病毒针对HA蛋白表位的单克隆抗体；用制备的SIV单克隆抗体，建立了检测H1N1亚型SIV的ELISA方法，为猪流感病毒的快速诊断提供新的方法，对生产实践具有重要的指导意义。当前猪流感免疫疫苗主要是灭活疫苗及弱毒疫苗，因此对亚单位疫苗及基因工程疫苗的研究就显得有广阔的前景，用纯化的HA蛋白做成基因工程疫苗进行动物免疫研究，有望成为灭活疫苗的有效补充。本作品技术水平高，有推广应用前景。 其它说明 推荐者情况 姓 名 曹永长 性别 男 年龄 41 职称 教授 工作单位 华南农业大学动物科学学院 通讯地址 广州天河五山483号 华南农业大学动物科学学院 邮编 510642 单位电话 020-85280283 住宅电话 37212563 推荐者所在 单位签章 曹永长老师是我校博士生导师。 签章日期 2007年6月11日 请对申报者申报情况的真实性作出阐述 本作品是华南农业大学本科课外科技创新论文，在动物科学学院基因工程实验室完成，利用了本实验室成熟的实验技术和已有研究材料，选题具有实践指导意义。谢易恒等五位同学利用课余时间积极参与本研究室的科研工作，熟悉和掌握了各项基因工程实验技术，特别是对基因的生物信息学分析，能熟练查找和应用分析软件，分析结果对基因表达和蛋白生物学活性的预测具有很好的参考价值。内容真实，数据可靠，结论正确。 请对作品的意义、技术水平、适用范围及推广前景作出您的评价 本作品选题具有实践指导意义，特别对现有猪流感的防治提供了很好的理论指导，为下一步的猪流感基因工程疫苗的制备和猪流感病毒的鉴别诊断打下了很好的基础。本作品选用pBCX高效可溶表达载体（本研究室改造的载体，正在申请专利），可溶表达的融合蛋白与H1N1亚型猪流感病毒阳性血清具有很好的免疫反应性。体现了五位同学具有一定的基因工程实验技能，能熟练应用分子生物学软件进行基因和蛋白的生物信息学分析，同时对免疫学技术如单抗的制备和筛选、ELISA方法的建立也有一定的掌握。本研究成果对生产实践具有很好的理论和实践指导作用，有推广应用前景。 其它说明 学校组织协调机构确认并盖章 同意参加“挑战杯”全国大学生课外学术科技作品竞赛。 （团委代章） 2007年6月11日 校主管领导或校主管部门确认盖章 情况属实，同意参赛。 2007年6月11日 各省（区、市）评审委员会初评意见 评委签名： 年 月 日 各省（区、市）组织协调委员会审定意见 团 委 科 协 教 育 厅 学 联 （签章） （签章） （签章） （签章） 年 月 日 E．大赛组织委员会秘书处资格和形式审查意见 组委会秘书处资格审查意见 审查人（签名） 年 月 日 组委会秘书处形式审查意见 审查人（签名） 年 月 日 组委会秘书处审查结果 □合格 □不合格 负责人（签名） 年 月 日 F．参赛作品打印处 H1N1 SIV（猪流感病毒）HA蛋白的生物信息学分析、高效 可溶表达及鉴别诊断SIV的夹心ELISA方法的建立 作者：谢易恒 李栋 苏培穗 陈成果 周科 黄慧雄 指导老师：谢青梅 副教授 作者单位：华南农业大学动物科学学院，广州，510642 摘要：猪是流感病毒传播的中间宿主，猪感染猪流感病毒（SIV）后会导致其他疾病如蓝耳病、圆环病毒病、胸膜肺炎等疾病的发生，给畜牧业造成巨大的经济损失，对人类健康造成了严重威胁。快速诊断和及时监测是控制流感的首要步骤。H1N1亚型猪流感病毒（SIV）的血凝素（HA)基因在流感病毒传染的过程中与识别靶细胞表面受体在穿膜过程中起重要作用，刺激机体产生的中和抗体可以抵抗病毒感染。本论文采用RT-PCR方法扩增了H1N1亚型猪流感病毒（SIV）广东株的血凝素（HA）基因，测序后对HA 基因进行生物信息学分析，分析结果表明HA蛋白具有良好的免疫原性，可以作为诊断试剂。然后将HA基因克隆到高效可溶表达载体pBCX上，成功构建重组表达质粒pBCX-HA。将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中表达，SDS-PAGE可检测到分子量约为94.0ku的融合蛋白，通过薄层凝胶扫描分析表明表达产物占菌体总蛋白的29.5％。经蛋白可溶性分析看出，融合蛋白90％以上是以可溶形式表达的。Western-blot证实，可溶表达的融合蛋白与H1N1亚型猪流感病毒阳性血清具有良好的免疫反应性。纯化表达的HA融合蛋白作包被抗原用于猪流感病毒单克隆抗体的筛选，筛选到2株猪流感病毒针对HA蛋白表位的单克隆抗体；用制备的SIV单克隆抗体，建立了高特异性的检测H1N1亚型SIV的间接ELISA方法，为猪流感的防控奠定基础。 关键词：H1N1亚型猪流感病毒 血凝素（HA） 生物信息学 高效可溶表达 单克隆抗体 ELISA方法 Biological information analysis and high soluble expression of HA protein of H1N1 subtype Swine Influenza Virus along with establishment of an ELISA assay to diagnose SIV Author ：Xie Yi-heng，Li Dong，Su Pei-sui，Chen Chen-guo，Zhou Ke，Huang Hui-xiong Director teacher: Xie Qing-mei associate professor College of Animal Science,South China Agric.Univ.，Guangzhou 510642,China Abstract：Swine is an intermediate of spreading influenza virus, swines infected influenza virus will bring on other diseases such as PRRS, PCV, APP ,causing economic loses in the stockbreeding and intimidating the health of human so that fast diagnosis and timely analysis are the first step to control the influenza virus. The HA gene of H1N1 subtype influenza virus isolated from Guangdong Province was successfully amplified by RT-PCR,then analyzed biological information after translating DNA suquences. And the HA fragment was inserted into plasmid pBCX to obtain recombinant plasimd in which HA gene was fused into. The pMBX-HA was transformd into E.coli BL-21(DE3) to induce HA gene fusion expression. The fusion protein band with relative molecular mass of 94000 was detected on the SDS-PAGE gel, and the soluble expression products accounted for 29.5% of the total E.coli proteins. The soluble form of the expression products was up to 90% the fusion protein. From western-blot analysis of recombinant protein HA, the expression fusion protein and positive blood serum of H1N1 SIV have favorable immunogenicity. Expressed protein HA is used for coating antigen to sublimate monoclonal antibody of swine influenza virus. The preparations of monoclonal antibody of swine influenza virus are used for establishing an indirect ELISA assay to diagnose SIV in order to prevent and control the swine influenza virus . Key words：H1N1 subtype Swine Influenza Virus haemagglutinin bioinformatics high soluble expression monoclonal antibody method of ELISA 猪流感是由猪流感病毒引起的一种急性、热性、高度接触性的呼吸道传染病。1975年以前，H1N1猪流感病毒以地方流行性存在于欧美大陆，其他地方少有报道；70年代末，H1N1猪流感传入了我国台湾，香港和大陆等地，并在亚洲广泛盛行。有研究表明我国H1N1抗体阳性率有不断上升的趋势。猪流感病毒具有感染人的潜力。据报道1976年，美国新泽西州的一名新兵感染猪源H1N1而死于肺炎。作为流感病毒的“混合器”，猪流感病毒在禽－猪－人的种间传播中起到非常重要的作用。另外人类流感和猪流感爆发的平行性和相关性,赋予了猪流感非常重要的公共卫生意义。 生物信息学是一门新兴的交叉学科，是采用计算机技术和信息论方法究蛋白质及核酸序列等各种生物信息的采集、存储、传递、检索、分析和解读的科学。具体的说，生物信息学是把基因组DNA序列信息分析作为源头，破译隐藏在DNA序列中的遗传语言，特别是非编码区的实质；同时在发现了新基因信息之后进行蛋白质空间结构模拟和预测。应用生物信息学分析H1N1亚型猪流感病毒HA基因及其氨基酸序列，打破传统的实验模式，开创了“理论－实验－理论”的新模式。 DNA重组技术又称基因工程技术，为大量获得蛋白质/多肽（以下所称“蛋白质”和“多肽”通用）提供了技术支持。已有不少蛋白质类药物、疫苗、诊断试剂采用基因工程方法生产。本研究选用pBCX高效可溶表达载体高效表达H1N1 SIV 的HA蛋白。用msyB基因作为融合伴侣，使HA融合蛋白高效可溶表达，突破了传统大肠杆菌表达系统包涵体表达外源蛋白（多肽）的技术瓶颈。msyB基因编码蛋白是大肠杆菌本身的蛋白，是一种高可溶性多肽，本身在大肠杆菌中表达量很高，其作为载体蛋白具有稳定性、可溶性和表达水平高的特性。当被诱导表达时，msyB多肽作为载体可与同外源蛋白一道分泌到大肠杆菌的胞质中表达，大大增加了外源蛋白的可溶性，且表达的外源蛋白能够产生正确折叠。对那些在胞内表达且表达产物对细菌有毒性的外源基因来说，可以减弱其毒性，提高表达量，提高融合蛋白的稳定性。因此选用大肠杆菌msyB多肽基因是构建高效可溶表达载体的最优融合伴侣基因之一。近年来，融合蛋白被广泛应用于生物研究，因其具有双方蛋白的活性，可被用于蛋白的表达、检测、识别和纯化。特别是在免疫治疗和免疫分析以及寻求高效、新型重组药物方面显示了其特有的优势。融合蛋白使昂贵的细胞因子在兽医上的应用成为可能，由融合蛋白构建的“生物导弹”更是提高了药物的效力，因此融合蛋白表达技术是极具发展前景的一门技术。 本研究对猪流感病毒HA基因的进行了生物信息学分析和高效可溶表达，纯化表达的HA融合蛋白作包被抗原用于猪流感病毒单克隆抗体的筛选，筛选到2株猪流感病毒针对HA蛋白表位的单克隆抗体；用制备的SIV单克隆抗体，建立了检测H1N1亚型SIV的夹心ELISA方法，为防治猪流感和研制猪流感基因工程疫苗提供科学依据，对生产实践具有一定的指导意义。 1 材料 1.1 病毒 猪流感病毒毒株：A/swine/Guangdong/2/01(H1N1)。 1.2 菌种 基因工程宿主菌E.coli DH5α、表达菌E.coli BL-21（DE3）。 pGEM-T Easy载体质粒（图1）系统为Promega公司产品; pBCX质粒（图2）本实验室保存。 图1 质粒pGEM-T Easy的结构示意图 Fig.1 Sketch map of the plasmid pGEM-T Easy 图2 pBCX载体的结构示意图 Fig.2 Sketch map of the plasmid Pbxc Easy 1.3 常用培养基以及试剂 LB液体培养基、LB固体培养基、LA固体培养基（含氨苄青霉素100µg/mL）、氨苄青霉素100mg/mL、无RNA酶的DEPC水、AMV反转录酶（5U/µL）、HRP RNA酶抑制剂（40U/µL）、小牛碱性磷酸酶（CIAP）、T4 DNA连接酶及相应缓冲液，Ex Taq DNA聚合酶（5u/µL）、dNTPs（2.5mM each）、DL2000 DNA Marker、DEPC、IPTG、Amp、溴化乙锭（EB）、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶、丙烯酰胺、N，N-亚甲基双丙烯酰胺、TEMED、6xHis-Tag 融合蛋白亲和层析Ni-NTA 凝胶、DNA片段快速纯化/回收试剂盒、质粒DNA抽提试剂盒。 1.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）缓冲液 Tris-甘氨酸电泳缓冲液（pH8.3）、5×SDS-PAGE上样缓冲液、考马斯亮蓝染色液、脱色液、分离胶缓冲液（pH8.8）、浓缩胶缓冲液（pH6.8）。 1.5 Western blot试剂 转移缓冲液：25mM Tris，192mmol/L甘氨酸，20%（v/v）甲醇，0.037%（v/v）SDS，用HCl调pH至8.3。 TBS缓冲液：150mmol/LNaCl，10mmol/L Tris-Cl（pH7.5）。 封闭液：5%脱脂奶粉，用TBS缓冲液配制，4℃保存。 抗体稀释液：1%脱脂奶粉/TBS，用于稀释抗体，4℃保存。 显色液：在9mlL0.01mol/L Tris-Cl（pH7.6）缓冲液中溶解6mg二氨基联苯胺，加入1mL 0.3%的氯化钴，最后加入10µL 30%的双氧水，混匀后立即使用。 1.6 蛋白纯化试剂 Lysis buffer (pH 8.0)、Wash buffer (pH 8.0)、Elution buffer (pH8.0) 1.7 抗体 猪禽流感H1N1标准阳性血清 由广东省兽医防疫站惠赠，辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪IgG(二抗)购自广州博理生物技术公司。 1.8 主要仪器及设备 PCR Express Gradient PCR仪、BIO-ID凝胶成像及分析系统、JY92-11超声波细胞粉碎机、EC570-90蛋白质电泳仪、冷冻高速离心机、超低温冰箱、空气摇床、WD-9504型生化摇摆平台、DYY-6B型稳压稳流电泳仪、AIR-TECH医用超净工作台 1.9免疫试剂 弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂、PEG（WM400）、IgG抗体亚类试剂盒、HRP-羊抗鼠、IgG酶标二抗、DMEM培养基、胎牛血清、100倍HAT储存液、100倍HT储存液、75%乙醇溶液；碘酊溶液。 1.10细胞培养基 基础培养液：IMDM培养基，补加0.37￥的NaHCO3、0.25%的葡萄糖，用1mol/LHCL调节PH至6.8-7.0，过滤除菌。 完全培养液：含10%胎牛血清的基础培养液，补加青霉素100IU/ml、链霉素100μg/ml及L-谷氨酰胺1mmol/ml。 HAT选择培养液：含1%HAT储存液的完全培养液。 HT选择培养液：含1%HT储存液的完全培养液。 1.11 ELISA方法试剂 包被液（500ml）：将1.59g的Na2CO3和2.93g的NaHCO3溶于450ml的高压过的蒸馏水中，用5mol/L的氢氧化钠溶液调节dpHD值到9.6。再补加蒸馏水至500ml，存放在4℃冰箱中，备用。 PBS溶液的配制（20倍，500ml）：分别将15.4Na2HPO4·12H2O、2gKH2PO4、80gNaCL、2gHCL融入500ml的蒸馏水中完全溶解后，放入高压锅中高压备用。 洗涤缓冲液（500ml）：向1倍的PBS溶液中加入吐温-20，制成含吐温-20为0.05%的1倍的PBS溶液。 封闭液的制备：含5%脱脂奶粉的PBS溶液。现配现用。 底物显色液的配制： A液：四甲基联苯胺（TMB）：无水乙醇=1：100； B液：0.2mol/L的pH为6.0的醋酸钠溶液，用醋酸调节pH值； C液：0.03%H2O2的溶液； 按配方A液：B液：C液=1：4：5的比例配制。 终止液的配制：1mol/L的H2SO4溶液。 1.12实验动物与细胞 本实验所使用的九日龄鸡胚购于广州农科院畜牧研究所；8周龄Balb/c小白鼠由中山大学实验动物中心提供；骨髓瘤细胞SP2/0由本实验室保存并传代。 2 方法 2.1引物设计与合成 应用DNAStar（4.0）软件，参照GenBank中注册的H1N1猪流感病毒血凝素基因（HA）序列，设计引物HAup1/HAdn1用于扩增H1N1亚型猪流感的HA基因，引物理论跨幅分别为1701bp。引物由上海博亚生物工程公司合成。合成后的引物用三蒸水稀释成25mmol/L溶液，-20℃保存。引物序列如下： HAup1：5'- ttatgaaggcaatactagtgttc-3' HAdn1：5'-tttcagatgcatattctgcactg-3' 2.2 病毒RNA的提取 按GibcoBRL公司TRIzol LS Reagent RNA提取试剂盒的使用说明书进行,经DEPC处理的无RNA酶的三蒸水溶解沉淀，直接用于RT-PCR或-80℃保存。 2.3 HA基因RT-PCR反应和cDNA的扩增 2.3.1 HA基因cDNA第一链的合成 在20µL反应体系中分别加入规定组分，混匀后，室温放置10min，42℃保温1h，冰浴2min，RT产物直接用于PCR扩增，或-20℃保存（RNA 3 µL、5×buffer 4 µL、dNTPs 4 µL、RNA酶抑制剂0.5 µL、HAup1 1 µL、HAdn1 1 µL、AMV 2 µL、DEPC水3.5 µL） 2.3.2 HA基因cDNA的PCR扩增 PCR反应体系为：10×buffer 10µL、dNTPs 4µL、HAup1 1µL、HAdn1 1µL、cDNA 5µL、Ex Taq 1µL、ddH2O 78µL，将上述反应物混匀，在PCR Express Gradient PCR仪上按下列反应条件进行扩增。PCR产物用1%琼脂糖电泳检测。 2.3.3 PCR产物的凝胶回收与纯化 将PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，在紫外透射仪上，用手术刀片切下含目的条带的凝胶，以3倍体积的溶胶缓冲液，65℃水浴使之完全溶化，加入离子交换柱，12,000r/m离心1min，弃去滤液，用含酒精的洗脱液清洗2次，10,000r/m离心1min甩干残液，将适量双蒸水加入交换柱，于50-60℃保温数分钟，10,000r/m离心1min，收集滤液，用琼脂糖电泳检测回收效果。回收的PCR产物在Ex Taq作用下加尾，可直接用于连接。 2.4 T-HA重组质粒的构建 2.4.1 PCR产物与pGEM-T Easy载体的连接 连接反应体系为：2×buffer 5μL、加尾的PCR产物3μL、pGEM-T Easy 1μL、T4DNA连接酶1μL。混匀后稍离心后，于4℃条件下连接过夜。连接产物直接用于转化。 2.4.2 DH5α感受态细胞的制备 参照金东雁等（1996）的《分子生物学常用实验方法》，用CaCl2法制备感受态细胞。 2.4.3 连接产物转化感受态细胞 取上述制备的感受态细胞50µL，加入2.4.1中制备的连接产物5µL，混匀后冰浴30min，42℃热休克90sec，迅速转移到冰浴中冷却2min，加入200µL不含抗生素的LB液体培养基，于37℃摇床中以160r/m振摇培养45min；取100µL菌液涂布于含Amp的LB平板中，37℃培养过夜。 2.4.4 转化子的筛选、鉴定 从上述过夜培养的平板中挑取单个菌落，接种于3mL含Amp的LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜，分别用PCR和酶切反应进行鉴定。 2.4.5 转化子的PCR筛选 直接以菌液作为模板进行PCR鉴定。反应体系、PCR反应程序同2.3.2。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。经PCR鉴定为阳性的重组质粒，命名为T-HA。 2.4.6 HA基因的序列测定 将阳性的重组质粒的菌液送交上海博亚生物技术有限公司进行核苷酸序列测定。 2.5 HA基因的碱基序列分析 用DNAstar软件对HA基因进行序列分析，包括同源性分析、系统进化树等。 2.6 HA基因及其氨基酸序列的生物信息学分析 2.6.1 HA基因稀有密码子预测 采用RACC服务器http://nihserver.mbi.ucla.edu/RACC/ ，将HA基因的氨基酸序列输入工作区进行稀有密码子预测； 2.6.2 HA蛋白信号肽预测 采用SignalP服务器http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ ，将HA基因的氨基酸序列输入工作区进行HA蛋白的信号肽预测； 2.6.3 HA蛋白的跨膜区预测 采用TMHMM服务器http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/， 将HA基因的氨基酸序列输入工作区进行HA蛋白的跨膜区预测； 2.6.4 HA蛋白的疏水性分析 采用Bioedit7.0软件，将HA基因的氨基酸序列输入工作区进行HA蛋白的疏水性分析； 2.6.5 HA蛋白的二级结构预测（SOPMA服务器） http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html ,将HA基因的氨基酸序列输入工作区进行HA蛋白的二级结构预测； 2.6.6 HA蛋白抗原位点的预测（antigenic.pl服务器） http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/antigenic.pl，将HA基因的氨基酸序列输入工作区进行HA蛋白抗原位点的预测； 2.6.7 HA蛋白的磷酸化位点预测 将研究的HA基因的氨基酸序列提交到丹麦技术大学生物序列分析中心(CBS)网站http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/ 进行HA蛋白的磷酸化位点预测； 2.6.8 HA蛋白的N-糖基化位点预测 将研究的HA基因的氨基酸序列提交到丹麦技术大学生物序列分析中心(CBS)网站http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/ 进行HA蛋白的N－糖基化位点预测。 2.7 pBCX对H1N1亚型猪流感HA基因在大肠杆菌中高效可溶表达 2.7.1 引物的设计与合成 根据测定的H1N1亚型猪流感HA基因序列设计1对引物，即HAup/HAdn，该片段理论跨度为1701bp，编码566个氨基酸，在HAup5’端加上BamHI酶切位点 （斜体） 和保护碱基，在HAdn加上SalI酶切位点（斜体）和终止密码。引物由上海博亚生物工程公司合成。合成后的引物用三蒸水稀释成25mmol/L溶液，-20℃保存。引物序列如下： HAup：5'-ATGGATCCGACACAATATGTATA-3' HAdn：5'- ATGTCGACGATGCATATTCTGCACT-3' 2.7.2 HA基因的PCR扩增 用HAup/HAdn引物对从T-HA重组质粒上扩增HA基因片段。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶（含0.5μg/mL的溴化乙锭）电泳检测。 2.7.3 PCR产物纯化 按TaKaRa公司凝胶纯化试剂盒说明书进行，方法同2.3.3。 2.7.4 PCR产物的酶切 将纯化的HA基因片段的PCR扩增产物用适量ddH2O溶解，在100µL反应体系中加入下列反应物，于37℃消化4h。 2.7.5 酶切产物的凝胶回收 方法同2.3.3。 2.7.6 质粒载体pBCX的制备与消化 在LA平板上划线培养含有pBCX质粒的E.coli DH5α，37℃温箱中培养16h。挑取单菌落接种于3 mL LA培养基中，37℃、200 r/m振摇培养16-20h。将3mL菌液分装2只1.5mL离心管中，4℃、3500r/m离心10min，沉淀细菌。 按照E.Z.N.A.® Plasmid Minipreps Kit质粒DNA抽提试剂盒说明书抽提质粒，质粒DNA溶解于50µL ddH2O中。取2µL进行琼脂糖凝胶电泳，检测质粒的纯度，用紫外吸收法测定质粒DNA含量。 在100µL pBCX质粒的酶切反应体系中加入反应物(10×buffer 10µL、BamHI 5µL、SalI 5µL、CIAP 1µL、pBCX 25µL、dd H2O 54µL)于37℃酶切消化4h。 2.7.7 质粒酶切产物的回收 方法同2.3.3。 2.7.8 HA基因片段pBCX质粒的连接 将经酶切消化、凝胶纯化后的HA基因片段与质粒酶切产物按T4 DNA连接酶连接过夜。在10µL的连接反应体系中加入反应物（10 ×连接缓冲液1µL、HA基因片段3.5µL、pBCX 1.5µL、T4 DNA连接酶1µL、Dd H2O 3µL），连接产物直接用于转化DH5α。 2.7.9 连接产物转化E.coli DH5α受体菌 取2.7.8中的连接产物5µL加入到50 µL E.coli DH5α感受态细胞中，混匀，冰浴30 min；42℃热休克90sec，而后迅速转移到冰浴2min；加入200µL LB液体培养基，于37℃以160r/m振摇培养45min。然后取200µL菌液涂布于LA固体琼脂培养基，37℃培养18h。 2.7.10 转化子的PCR鉴定 以菌液为模板，以特异性的HAup/HAdn引物对进行PCR鉴定。 2.7.11 重组质粒的限制性内切酶酶切鉴定 抽提含有HA基因的重组质粒命名为pBCX-HA，用BamHI和SalI进行酶切鉴定。 2.7.12 HA基因在大肠杆菌BL21中的表达和SDS-PAGE检测 将阳性的转化菌pBCX-HA-BL21划线培养；挑取单菌落接种于3mL LA液体培养基中，37℃，220r/m的空气摇床中培养10h，取出菌液，置4℃冰箱过夜；按1%比例将上述菌液接种于3mL LA液体培养基，37℃，220r/m振摇培养；当OD600为0.4～0.6时，加入终浓度为1mmol/L IPTG进行诱导表达，取0～5h菌液，12 000rpm离心2min，去上清，细菌沉淀中加100μL 1×SDS上样缓冲液，-80℃冻融三次，沸水中煮3～5min，12000r/m离心2min，取上清进行SDS-PAGE电泳。同时，设pBCX空质粒作为对照。pBCX-HA-BL21表达的融合蛋白命名为msyB-HA。按金东雁等（1996）介绍的方法制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）。 2.7.13 HA蛋白的Western blot检测 按照《蛋白技术手册》中的方法进行（汪家政等，2000）。 用的一抗是猪的H1N1亚型SIV阳性血清，二抗是HRP标记的山羊抗猪IgG。 2.8 H1N1 SIV单克隆抗体的制备 2.8.1 免疫动物　 选择8 周龄健康BALb/C小鼠，每只小鼠分别肌肉注射以弗氏完全佐剂乳化的疫苗,注射量为100μg（抗原含量）左右；2周后以弗氏不完全佐剂(FIA)乳化H1N1 SIV标准抗原腹腔注射；最后一次加强免疫时，直接腹腔注射100μg的H1N1 SIV标准抗原；融合前3～4d尾静脉注射50μg纯化的病H1N1 SIV标准抗原。 2.8.2 细胞融合 SP2/0细胞及免疫鼠脾细胞用洗液作适当稀释后计数,两种细胞按1∶5的比例混合，离心去上清,缓慢加入PEG-4000（pH8.0）,再加入洗液20～30mL ，离心弃上清，加入HAT营养液混匀。在铺有饲养细胞的96孔板上每孔加入100μL融合细胞悬液，最后将融合细胞培养板放置37℃5%的CO2 培养箱中培养。 2.8.3 筛选及克隆　 用间接ELISA 法筛选分泌阳性抗体的杂交瘤细胞，所用的包被抗原是纯化的H1N1 SIV HA蛋白。将筛选的阳性杂交瘤细胞进行克隆，将检出的阳性孔再次克隆和亚克隆，最后选择OD值高、细胞活力好、只有一株细胞的孔扩大培养。 2.8.4 腹水的制备　 将0.5mL高压灭菌的石蜡油注射到小鼠腹腔，一周后注入适量的杂交瘤细胞于小鼠腹腔，待7～10d小鼠腹部极度膨胀时，抽取腹水，将收集好的腹水离心，上清于56℃灭活30min即可。 2.9 ELISA检测 以H1N1 SIV HA蛋白筛选的单克隆抗体倍比稀释后进行方阵滴定，探索最佳的抗原包被浓度和血清的最佳稀释度，并用最佳的抗原浓度包被酶标板，检测部分送检的血清。 3 结果与分析 3.1 HA基因的RT-PCR扩增 实验发现在约1 700bp出现特异性扩增带(图3)，与预期的大小相符，初步表明用RT-PCR方法成功扩增了SIV HA基因。 图3 H1N1亚型SIV HA基因的RT-PCR扩增产物电泳结果 M：DL2000 DNA marker (bp)， 1、 2、3、4为RT-PCR 扩增出的目的条带； Fig.3 Electrophoretic analysis of RT-PCR amplification of H1N1 subtype SIV HA gene M:DL2000 DNA marker(bp),1、2、3、4:RT-PCR products 3.2 HA基因的cDNA的克隆及鉴定 SIV HA cDNA的RT-PCR产物经纯化、加尾后，插入到pGEM-T Easy载体的外源基因插入位点，重组质粒转化E.coil DH5，以培养的菌液为模板进行PCR鉴定。阳性菌液经上海博亚生物工程公司测序，测序结果与GenBank中检索的SIV HA基因同源性达95.3%以上，而氨基酸同源性为96.0%以上。 图4 HA基因的cDNA的PCR鉴定 M：DL2000 DNA marker (bp)， 1、 2、5、6、7为PCR鉴定阳性菌落；3、4、8为阴性菌落 Fig.4 Indentification of cDNA from HA gene by PCR M：DL2000 DNA marker (bp)， 1、 2、5、6、7:prositive velum ,3、4、8:negative velum 3.3