血液病标准化方案.ppt

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1、流式细胞术的应用 血液病的诊断 p血液病基础知识p流式诊断血液病标准化方案 血液病基础知识正常血细胞的发育过程多能祖细胞髓系多能祖细胞淋巴系多能祖细胞造血干细胞 髓系多能祖细胞红系祖细胞粒系祖细胞单核系祖细胞巨核系祖细胞 红系祖细胞原始红细胞成熟红细胞网织红细胞晚幼红细胞中幼红细胞早幼红细胞 粒系祖细胞原始粒细胞分叶核细胞杆状核粒细胞晚幼粒细胞早幼粒细胞中幼粒细胞 单核系祖细胞原始单核细胞幼稚单核细胞成熟单核细胞 巨核系祖细胞颗粒巨核细胞原始巨核细胞幼稚巨核细胞成熟巨核细胞 淋巴祖细胞T祖细胞 B祖细胞NK细胞前胸腺淋巴细胞（pre-T) T细胞前B细胞（pre-B) 记忆T细胞效应T细胞未成

2、熟B细胞成熟B细胞浆细胞 正常血细胞发育过程的抗原表达规律 期：原粒细胞阶段 期：早幼粒细胞阶段 期：中幼粒细胞阶段期：晚幼粒细胞阶段 期：原始单核细胞阶段期：幼稚单核细胞阶段期：成熟单核细胞阶段 期：原始B淋巴细胞阶段期和期：幼稚B淋巴细胞阶段 期：成熟B淋巴细胞阶段 4期：原始T淋巴细胞阶段期和期：幼稚T淋巴细胞阶段 期：成熟T淋巴细胞阶段 期：原始红细胞阶段期：幼稚红细胞阶段 III期：成熟红细胞阶段 白 血 病 分 类综合分类（FAB, 免疫性分型，染色体分型，分子生物学分型）1.急性白血病急性髓细胞白血病（AML) M0, M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7急性淋巴

3、细胞白血病(ALL)T-ALL, B-ALL2.慢性增生性白血病慢性粒细胞白血病（CML)慢性淋巴细胞增生性白血病慢性淋巴细胞白血病（CLL)淋巴瘤其它慢性淋巴细胞增生性白血病HCL, FL, MCL等3.骨髓异常增生综合症（MDS)4.浆细胞性白血病多发性骨髓瘤（MM) 浆细胞白血病（PCL) 急性髓系白血病WHO分类伴遗传学异常的AML伴多系增生异常的AML治疗相关性的AML不能按照上述分类的AML (M0-M7) 急性白血病一线抗体B-ALL T-ALL AML未分化型白血病cCD79acCD22 cCD3 cMPO TdTCD19CD10 CD2CD7 CD13CD33CD117CD1

4、4 CD34HLA-DR 急性白血病补充抗体B-ALL T-ALL红白血病巨核细胞白血病SmIg(k/l)CD20CD22cyIgM CD1aCD4CD8TCR/ GLyACD71CD36 CD41CD42CD61 慢性淋巴增生性疾病（CLD)抗体组合初筛：CD5，CD19，kappa，lambda；CD3，CD20，CD23,CD10，CD45B-LPD:CD22，FMC7，CD11c,CD103CD38,CD25,CD79b,HeavychainT-LPD:CD4,CD7,CD8,CD2,CD56,CD16,TCR/，TCR/ p血液病基础知识p流式诊断血液病标准化方案 标准化方案u标本处

5、理u标本检测u结果分析 急性白血病(AL)免疫分型FITC PE PC7 PC5TUBE1 CD34 CD117 CD45 HLA-DRTUBE2 CD7 CD10 CD45 CD19TUBE3 CD38 CD22 CD45 CD20TUBE4 CD15 CD13 CD45 CD11bTUBE5 CD3 CD33 CD45 CD56-APCTUBE6 MPO CD79a CD45 TdT 骨髓增生异常综合征（MDS）FITC PE PC7 PC5TUBE1 CD7 CD117 CD45 CD38TUBE2 CD34 CD10 CD45 HLA-DRTUBE3 CD64 CD20 CD45 CD

6、19TUBE4 CD15 CD33 CD45 CD14TUBE5 CD16 CD13 CD45 CD11bTUBE6 CD4 CD56 CD45 CD3 B淋巴瘤（B-LPD)FITC PE PC7 PC5TUBE1 CD5 CD10 CD45 CD19TUBE2 FMc7 CD23 CD45 CD38TUBE3 CD22 CD20 CD45TUBE4 CD103 CD25 CD45 CD11cTUBE5 Kappa lambda CD45 sIgM T-NK淋巴瘤FITC PE PC7 PC5TUBE1 CD7 CD10 CD45 CD5TUBE2 CD4 CD8 CD45 CD3TUBE3

7、 CD57 CD56 CD45 CD3TUBE4 CD16 CD25 CD45 CD2TUBE5 NKB1 CD30 CD45 CD3TUBE6 TCR TCR CD45 CD3 浆细胞瘤（MM)FITC PE PC7 PC5TUBE1 CD38 CD138 CD45 CD19TUBE2 CD38 CD117 CD19 CD56TUBE3 CD38 CD13 CD20 CD33TUBE4 CD38 CD27 CD200-APCTUBE5 cKappa cLambda CD38 T-B淋巴细胞白血病FITC PE PC7 PC5TUBE1 CD22 CD20 CD45 CD19TUBE2 FMc

8、7 CD23 CD45 CD2TUBE3 CD7 CD10 CD45 CD5TUBE4 CD16 CD8 CD45 CD4TUBE5 CD57 CD56 CD45 CD3TUBE6 Kappa Lambda CD45 sIgM B淋巴瘤残留病(B-MRD)FITC PE PC7 PC5TUBE1 CD38 CD34 CD45-APC CD19TUBE2 CD38 CD10 CD20-APC CD19TUBE3 CD38 CD13+33 CD45 CD19 霍奇金淋巴瘤FITC PE PC7 PC5TUBE1 CD34 CD117 CD45 CD19TUBE2 CD15 CD13 CD45 CD

9、33TUBE3 CD22 CD10 CD45 CD20TUBE4 CD7 CD2 CD45 CD5TUBE5 CD4 CD8 CD45 CD3TUBE6 CD36 GlyATUBE7 CD30 CD45 CD38TUBE8 CD79a 标准化方案u方案设计u标本检测u结果分析 标本的准备 （一）外周血、采集物或骨髓1.保存方法:抗凝管室温保存，12小时内处理标本，大于24小时，肝素抗凝4冰箱保存2.处理方法：无需特殊处理3.抗凝剂的选择：血液标本可用EDTA或肝素；骨髓标本用肝素！ （二）体 液1.保存方法：肝素抗凝管室温保存12小时内完成检测；储存在4冰箱时间应48小时。2.处理方法：新鲜标

10、本1000rpm离心5min,弃上清后，加入PBS离心洗涤5min，加入适量PBS，必要时300尼龙网过滤后备用 （三）组织细胞1.保存方法：新鲜组织标本置于生理盐水或PBS中12小时内处理完标本。若4冰箱保存应小于48小时。2.处理方法：机械法处理组织标本！ 荧光染色：（1）细胞表面抗原标记：1）根据实验方案（4色方案）加入4种荧光素（FITC、PE、PC7、PC5或APC)标记的相应抗体。2）标记：加入待检标本适量与检测管；低速涡旋混匀室温避光15min。3）溶血：加入Oplise C 溶血素0.5ml,震荡混匀，室温避光10min。4）洗涤：加入PBS适量（3ml左右）避光室温放置10m

11、in后1000rpm 5min ；5)弃上清液，加适量PBS（0.20.5ml) 混匀后上机检测，不能及时检测者置4冰箱内保持；24小时内完成检测。 （2）细胞膜和胞内抗原同时标记1）膜表面抗原染色：分别加入相应的荧光素标记抗体和适量骨髓标本，充分混匀后室温避光孵育15min；2）加入贝克曼破膜剂1液100ul混匀后室温避光放置15min；3）洗涤：加入PBS 1200rpm 离心洗涤5min4)加入破膜剂2液混匀后室温避光5min5）加入胞内抗体（如MPO cCD79a cCD3等）充分混匀室温避光15min;6)洗涤：加适量PBS 1200rpm 5min 离心洗涤！7）上机检测：弃去上清

12、；加入适量PBS（200500ul）混匀上机检测；不能及时检测则4冰箱保存，24小时内完成检测。 标准化方案u方案设计u标本处理u结果分析 开机：启动FC500仪器；质控：选择质控程序，执行flow check；上样：根据实验项目选择相应方案模板，输入相关信息；后MCL自动上样！部分标本颗粒过多（如MRD)，需先200目过滤后再上机检测！检测过程中需要FSC /SSC门内细胞分布；若细胞分群不够清楚，需及时调整电压！ 标准化方案u方案设计u标本处理u标本检测 免疫分型设门、分析和报告设门：选择感兴趣的细胞分析其各参数表现常用设门方法如下：I.散射光（FSC/SSC)设门II.散射光和荧光设门

13、CD45/SSC 设门 CD19/SSC 或CD19/CD45设门 m/cCD3/SSC或CD3/CD45 设门 CD45/CD38或CD38/CD138设门 FSC/SSC 设门：根据FSC反应细胞大小，SSC反应细胞结构的原理；通过FSC/SSC二维点图将细胞初步分群：淋巴、单核、粒细胞；但是各区细胞有重叠，难以达到清晰分群的目的！主要初步设门！白血病的设门更多借助SSC/CD45设门法！ CD45/SSC辅助设门的原理 CD45是所有白细胞的抗原， CD45表达量在成熟淋巴细胞最高，单核细胞、粒细胞、早期造血细胞依次减弱。红细胞(中、晚幼红细胞、成熟红细胞)不表达 CD45。侧向角光散射

14、(SSC)反映细胞的颗粒性，成熟粒细胞 SSC最高，依次为单核细胞、淋巴细胞、 早期造血细胞、红细胞。以 CD45SSC典型图即可获得初步印象。若同时加上一个或二个以上其它单抗进行二、三色甚至四色分析，则很容易识别非正常细胞群的表型，并排除正常细胞的干扰，当标本中幼稚细胞低于50或检测残存白细胞时尤为必要 CD19/CD45设门用于B细胞白血病的分析 CD3/CD45设门用于T细胞白血病的分析 CD38/CD138设门用于MM和浆细胞瘤的分析 设门步骤：a.采用FSC/SSC设门R1去除碎片b.在CD45/SSC图上显示R1内细胞，分别设定R2(淋巴细胞）R3(幼稚细胞)R4(粒胞)R5(单核细胞)R6(有核红细胞)，并根据电压适当调整！ 结果报告方式:阳性比例？描述性表达异常细胞群描述幼稚细胞比例（20）是否有异常细胞群？正常细胞群比例是否异常？正常细胞群抗原表达是否正常？