大肠杆菌中的基因表达.ppt

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1、第 二 章 基 因 工 程 制 药 第 一 节 概 述第 二 节 目 的 基 因 的 获 得第 三 节 基 因 表 达第 四 节 基 因 工 程 菌 的 不 稳 定 性第 五 节 基 因 工 程 菌 中 试第 六 节 重 组 工 程 菌 的 培 养第 七 节 基 因 工 程 药 物 的 分 离 纯 化第 八 节 变 性 蛋 白 的 复 性第 九 节 基 因 工 程 药 物 的 质 量 控 制 第 二 章 基 因 工 程 制 药 一 、 基 因 工 程 技 术 生 产 药 品 的 优 点 二 、 基 因 工 程 药 物 生 产 的 基 本 过 程 三 、 国 内 外 基 因 工 程 药 物 研

2、究 进 展 第 一 节 概 述 第 一 节 概 述基 因 工 程 技 术 诞 生 ： 20世 纪 70年 代 现 代 生 物 技 术 的 发 展 基 因 工 程 ： 应 用 DNA重 组 技 术 ， 按 照 人 们 的 意 愿 ， 在 基 因 水 平 上 改 变 生 物 遗 传 性 ， 创 造 新 的 生 物 物 种 ， 通 过 工 程 化 手 段 为 人 类 提 供 有 用 产 品和 服 务 的 技 术 。 一 、 基 因 工 程 技 术 生 产 药 品 的 优 点 1. 大 量 生 产 过 去 通 过 常 规 生 化 分 离 提 取 技 术 难 以 获 得 （ 富 集 ） 的 生 理 活

3、性 蛋 白 和 多 肽 。 2. 提 供 足 够 数 量 的 生 理 活 性 物 质 。 3. 开 发 更 多 的 内 源 性 生 理 活 性 物 质 。 4. 通 过 基 因 工 程 和 蛋 白 质 工 程 对 天 然 生 理 活 性 物 质 进 行 改 造 ， 优 化 天 然 的 生 理 活 性 物 质 。 5. 利 用 基 因 工 程 技 术 可 获 得 新 型 化 合 物 ， 扩 大 药 物 筛 选 来 源 。 6. 降 低 成 本 ， 提 高 产 品 质 量 。 二 、 基 因 工 程 药 物 生 产 的 基 本 过 程 1. 目 的 基 因 的 获 得 2. 构 建 DNA重 组

4、体 上 游 技 术 3. 构 建 工 程 菌 4. 工 程 菌 的 发 酵 5. 外 源 基 因 表 达 产 物 的 分 离 纯 化 6.产 品 的 检 验 三 、 国 内 外 基 因 工 程 药 物 研 究 进 展 目 前 研 制 的 基 因 工 程 药 物 主 要 包 括 : 1. 免 疫 性 蛋 白 ， 如 各 种 抗 原 和 单 克 隆 抗 体 ; 2. 细 胞 因 子 ， 如 各 种 干 扰 素 、 白 细 胞 介 素 、 集 落 刺 激 生 长 因 子 表 皮 生 长 因 子 、 凝 血 因 子 ； 3. 激 素 ， 如 胰 岛 素 、 生 长 激 素 、 心 钠 素 ； 4. 酶

5、 类 ， 如 尿 激 酶 、 链 激 酶 、 葡 激 酶 、 组 织 型 纤 维 蛋 白 溶 酶 激 活 剂 、 超 氧 化 物 歧 化 酶 等 。 Vitamin A 第 二 节 目 的 基 因 的 获 得 一 、 反 转 录 法 二 、 化 学 合 成 法 一 、 反 转 录 法 1 mRNA的 纯 化 （ 1） 选 择 表 达 目 的 蛋 白 质 丰 度 高 的 mRNA的 生 物 材 料 。 （ 2） 分 离 总 RNA。 （ 3） 分 离 mRNA（ 多 聚 T纤 维 素 ） 2 cDNA第 一 链 的 合 成 （ RT-PCR， 随 机 引 物 ）3 cDNA第 二 链 的 合 成

6、4 cDNA克 隆5 将 重 组 体 导 入 宿 主 细 胞 S 1RNaseH 核 酸发 夹 结 构 克 隆定 向酶 入 噬 菌 体质 粒 T、A、 转 染电 击化 学 法一 、 反 转 录 法 6 cDNA文 库 的 鉴 定 显 色 抗 性 失 活抗 性 获 得抗 体差 示寡 核 苷 酸 探 针核 酸 探 针一 、 反 转 录 法 7 目 的 cDNA克 隆 的 分 离 和 鉴 定 计 算 机 辅 助 分 析阅 读 测 序酶 切 、一 、 反 转 录 法 优 点 ： 准 确 性 高 、 人 工 接 头 、 改 进 、 利 用 局 限 性 ： 1 小 分 子 量 的 蛋 白 或 多 肽 2

7、已 知 核 苷 酸 顺 序 或 氨 基 酸 顺 序 3 费 用 较 高 二 、 化 学 合 成 法 Vitamin B2 基 因 表 达 的 成 败 ， 直 接 影 响 药 品 的 质 量 、 成 本 。 基 因 表 达 是 外 源 基 因 在 生 物 体 转 录 、 翻 译 以 及 所 有 加 工 过 程 ， 是 外 源 基 因 异 源 转 录 翻 译 利 用 宿 主 功 能 的 过 程 ， 也 是 外 源 DNA、 RNA、 Pr克 服 宿 主 细 胞 进 攻 ， 保 护 自 身 的 过 程 。 第 三 节 基 因 表 达 1. 原 核 细 胞 （ 大 肠 杆 菌 、 枯 草 芽 孢 杆

8、菌 、 链 霉 菌 等 ） 2. 真 核 细 胞 （ 酵 母 、 丝 状 真 菌 、 动 物 细 胞 等 ）一 、 宿 主 菌 的 选 择 1 原 核 细 胞（ 1） 大 肠 杆 菌 优 点 ： 遗 传 背 景 清 晰 ， 生 长 迅 速 。 缺 点 ： 胞 内 表 达 ， 提 取 困 难 。 包 含 体 形 式 ， 需 复 性 。 表 达 后 不 存 在 修 饰 作 用 ， 应 用 受 限 。 翻 译 产 物 的 N末 端 常 多 余 一 个 甲 硫 氨 酸 残 基 （ AUG启 始 密 码 子 编 码 ） 容 易 引 起 免 疫 反 应 。 大 肠 杆 菌 产 生 内 毒 素 给 纯 化

9、带 来 不 便 。 蛋 白 酶 水 解 作 用 破 坏 产 物 。一 、 宿 主 菌 的 选 择 1 原 核 细 胞（ 2） 枯 草 芽 孢 杆 菌 优 点 ： 分 泌 能 力 强 ， 产 物 可 直 接 到 培 养 液 中 。 缺 点 ： 蛋 白 酶 水 解 活 性 更 强 。 （ 3） 链 霉 菌 优 点 ： 不 致 病 分 泌 能 力 强 具 有 糖 基 化 能 力 缺 点 ： 培 养 条 件 要 求 高 、 遗 传 稳 定 性 差一 、 宿 主 菌 的 选 择 2 真 核 细 胞（ 1） 酵 母 ： 无 毒 、 倍 增 时 间 短 、 分 泌 功 能 、 糖 基 化 作 用 、 使 之

10、 成 为 理 想 的 宿 主 。（ 2） 丝 状 真 菌 ： 肽 剪 切 、 糖 基 化 。（ 3） 哺 乳 动 物 细 胞 ： 产 品 保 真 性 高 ， 生 产 效 率 低 。一 、 宿 主 菌 的 选 择 1 载 体 表 达 载 体 必 须 具 备 下 列 条 件 ： 载 体 能 独 立 复 制 具 有 多 克 隆 （ MCS） 位 点 和 标 记 基 因 具 有 很 强 的 启 动 子 具 有 调 节 基 因 具 有 很 强 的 终 止 子 具 有 产 生 带 有 SD序 列 和 AUG 的 mRNA的 能 力二 、 大 肠 杆 菌 中 的 基 因 表 达 基 因 工 程 药 物 研

11、究 中 常 用 的 表 达 载 体 （ 1） PBV220系 统 PL、 PR串 联 启 动 子 ， 增 强 启 动 信 号 。 rrnB基 因 的 终 止 信 号 。 PL、 PR与 rrnB之 间 有 MCS及 SD序 列 。 CITS857抑 制 子 基 因 （ 温 控 诱 导 ） 质 粒 较 小 （ 366kb） ， 便 于 插 入 大 的 外 源 基 因二 、 大 肠 杆 菌 中 的 基 因 表 达 PBG -2: 由 PBV220衍 生 ,可 以 表 达 与IgG 结 合 的 融 合 蛋 白 ， 并 且 是 有 蛋白 剪 切 位 点 ， 便 于 表 达 后 纯 化 及纯 化 后 剪

12、 切 。二 、 大 肠 杆 菌 中 的 基 因 表 达 （ 2） PET系 统 IPTG 诱 导 （ 异 丙 基 -硫 代 -D-半 乳 糖 苷 ） 多 克 隆 位 点 上 有 NdeI或 NCOI单 一 切 点 ， 切 开 后 粘 性 末 端 为 ATG ， 便 于 外 源 基 因 插 入 表 达 。 在 外 源 基 因 的 N末 端 可 融 合 6个 H is， 便 于 纯 化 。二 、 大 肠 杆 菌 中 的 基 因 表 达 2 影 响 目 的 基 因 在 大 肠 杆 菌 中 表 达 的 因 素（ 1） 外 源 基 因 的 拷 贝 数（ 2） 启 动 子 的 强 弱（ 3） SD序 列

13、的 有 效 性（ 4） SD与 ATG 的 间 距（ 5） 密 码 子 的 组 成 （ 偏 爱 性 ）（ 6） 产 物 的 稳 定 性（ 7） 产 物 对 宿 主 的 影 响二 、 大 肠 杆 菌 中 的 基 因 表 达 3 表 达 形 式（ 1） 融 合 蛋 白 ， 增 强 稳 定 性 。（ 2） 非 融 合 表 达 。二 、 大 肠 杆 菌 中 的 基 因 表 达 1 载 体 YEP类 （ 酵 母 附 加 体 质 粒 ） 由 大 肠 杆 菌 质 粒 ， 2m质 粒 和 Trp或 URA3组 成 ， ARS来 自 2m质 粒 。 YRP（ 酵 母 复 制 型 质 粒 ） ARS来 自 染 色

14、 体 DNA、 TrP1、 URA3双 标 及 大 肠 杆 菌 质 粒 。 YCP（ 酵 母 着 丝 粒 型 质 粒 ） 除 具 有 YRP元 件 外 ， 还 具 有 着 粒 成 份 。 三 、 酵 母 中 的 基 因 表 达 YIP（ 酵 母 整 合 型 质 粒 ） 含 有 可 与 染 色 体 进 行 同 源 重 组 的 序 列 酵 母 表 达 型 质 粒 分 泌 型 表 达 质 粒 带 有 控 制 蛋 白 质 分 泌 的 信 号 序 列三 、 酵 母 中 的 基 因 表 达 2 影 响 目 的 基 因 在 酵 母 中 表 达 的 因 素 （ 1） 外 源 基 因 的 拷 贝 数 （ 2）

15、TATA盒 启 动 子 成 分 （ 3） 分 泌 信 号 序 列 （ 4） 终 止 序 列 （ 5） 翻 译 后 修 饰 （ 6） 对 宿 主 影 响三 、 酵 母 中 的 基 因 表 达 基 因 工 程 菌 在 传 代 过 程 中 经 常 出 现 质 粒 不 稳 定 的 现 象 ，质 粒 不 稳 定 分 为 分 裂 不 稳 定 和 结 构 不 稳 定 。第 四 节 基 因 工 程 菌 的 不 稳 定 性 1. 质 粒 的 分 裂 不 稳 定 性 ： 指 工 程 菌 分 裂 时 出 现 一 定 比 列 不 含 质 粒 的 子 代 菌 的 现 象 。 主 要 与 两 个 因 素 有 关 ： （

16、1） 含 质 粒 菌 产 生 不 含 质 粒 子 代 的 频 率 ， 质 粒 丢 失 率 与 宿 主 菌 、 质 粒 特 性 和 培 养 条 件 有 关 。 （ 2） 含 质 粒 菌 与 不 含 质 粒 菌 比 生 长 速 率 的 差 异 的 大 小 。 2. 质 粒 的 结 构 不 稳 定 性 ： 指 DNA从 质 粒 上 丢 失 或 碱 基 重 排 、 缺 失 所 致 工 程 菌 性 能 的 改 变 。一 、 质 粒 不 稳 定 产 生 的 原 因 ： 1. 选 择 合 适 的 宿 主 菌 2. 选 择 合 适 的 载 体 3. 选 择 压 力 4. 分 阶 段 控 制 培 养 5. 控

17、制 培 养 条 件 6. 固 定 化二 、 提 高 质 粒 稳 定 性 的 方 法 一 、 工 程 菌 选 择二 、 反 应 器 （ 发 酵 罐 ） 设 计三 、 发 酵 培 养 基 组 成四 、 工 艺 最 佳 化 与 参 数 监 测 控 制第 五 节 基 因 工 程 菌 中 试 一 、 基 因 工 程 菌 的 培 养 方 式二 、 基 因 工 程 菌 的 培 养 工 艺三 、 基 因 工 程 菌 的 培 养 设 备第 六 节 重 组 工 程 菌 的 培 养 基 因 工 程 产 品 纯 化 前 的 性 质 ： 目 的 产 物 在 体 系 中 含 量 较 低 体 系 中 组 份 复 杂 （ 细

18、 胞 、 代 谢 物 、 残 留 培 养 基 及 无 机 盐 等 ） 目 的 产 物 稳 定 性 差 ： 对 pH 、 温 度 、 金 属 离 子 、 有 机 溶 剂 、 剪 切 力 、 表 面 活 性 剂 等 十 分 敏 感 ， 容 易 失 活 、 变 性 。 第 七 节 基 因 工 程 药 物 的 分 离 纯 化 一 、 建 立 分 离 纯 化 工 艺 需 了 解 的 各 种 因 素 1. 含 目 的 产 物 的 初 始 物 料 的 特 点 利 用 基 因 工 程 菌 进 行 发 酵 生 产 的 产 物 ， 其 上 游 过 程 中 的 各 种 因 素 均 对 分 离 纯 化 技 术 和 工

19、 艺 有 直 接 影 响 。 这 些 因 素 包 括 ： （ 1） 菌 种 类 型 、 形 式 ， 各 种 生 物 学 性 质 ， 产 物 和 副 产 物 种 类 、 产 物 在 细 胞 内 所 处 的 位 置 ， 表 达 方 式 （ 胞 内 、 胞 外 、 包 含 体 ） ， 代 谢 物 种 类 ， 产 物 类 似 物 、 毒 素 和 能 降 解 产 物 的 酶 类 等 ； （ 2） 原 材 料 和 培 养 基 的 来 源 及 质 量 是 否 稳 定 ； （ 3） 生 产 工 艺 和 条 件 。 包 括 灭 菌 方 法 和 条 件 ， 生 产 方 式 (连 续 、 批 式 、 半 连 续 )

20、， 生 产 周 期 ， 生 产 能 力 ， 工 艺 控 制 条 件 及 方 式 等 ； （ 4） 初 始 物 料 的 物 理 、 化 学 和 生 物 学 特 性 。 包 括 产 物 浓 度 、 主 要 杂 质 种 类 和 浓 度 、 盐 的 种 类 和 浓 度 、 溶 解 度 、 pH、 粘 度 、 流 体 力 学 性 质 和 热 力 学 性 质 等 。 一 、 建 立 分 离 纯 化 工 艺 需 了 解 的 各 种 因 素2. 物 料 中 杂 质 种 类 和 性 质 物 料 中 杂 质 种 类 和 性 质 包 括 相 关 性 和 非 相 关 性 杂 质 的 含 量 、化 学 性 质 、 结

21、构 、 相 对 分 子 质 量 、 电 荷 性 质 及 数 量 、 生 物 学 特 性 、稳 定 性 (对 热 、 pH、 盐 、 有 机 溶 剂 等 )、 溶 解 度 、 分 配 系 数 、 挥 发 性及 吸 附 性 能 等 。 二 、 建 立 分 离 纯 化 工 艺 需 了 解 的 各 种 因 素 3. 目 的 产 物 的 特 性 目 的 产 物 特 性 主 要 有 产 物 的 化 学 、 物 理 和 生 物 学 特 性 。 包 括 化 学 组 成 、 相 对 分 子 质 量 、 等 电 点 、 电 荷 分 布 及 密 度 、 溶 解度 、 稳 定 性 (对 热 、 冷 冻 、 pH、 盐

22、 、 有 机 溶 剂 和 金 属 离 子 等 )、 疏 水 性、 扩 散 性 、 扩 散 系 数 、 分 配 系 数 、 吸 附 性 能 、 生 物 活 性 、 亲 和 性 、 配基 种 类 、 表 面 活 性 等 。 二 、 建 立 分 离 纯 化 工 艺 需 了 解 的 各 种 因 素 4. 产 品 质 量 要 求 产 品 质 量 要 求 主 要 包 括 产 品 质 量 指 标 ， 产 品 用 途 ， 对 纯 度 、 生物 活 性 、 比 活 的 要 求 。 允 许 的 杂 质 种 类 和 最 大 允 许 含 量 ， 特 殊 杂 质的 种 类 和 最 大 允 许 量 ， 以 及 对 使 用

23、 的 影 响 ， 产 品 剂 型 、 贮 存 稳 定 性等 。 二 、 分 离 纯 化 的 基 本 过 程 基 因 工 程 药 物 的 分 离 纯 化 一 般 包 括 细 胞 破 碎 、 固 液 分 离 、 浓 缩 与 初步 纯 化 、 高 度 纯 化 直 至 得 到 纯 品 、 成 品 加 工 等 步 骤 。 二 、 分 离 纯 化 的 基 本 过 程 分 离 纯 化 的 技 术 特 点 ： 条 件 温 和 选 择 性 好 收 率 要 高 纯 化 过 程 快 速 三 、 细 胞 的 破 碎 方 法1. 细 胞 收 集 2. 细 胞 破 碎 膜 过 滤离 心 物 理 破 碎 法 ： 高 压 匀

24、 浆 法 、 高 速 珠 磨 法 、 超 声 破 碎 法 、 高 压 挤 压 法化 学 破 碎 法 ： 渗 透 冲 击 、 增 溶 法 、 脂 溶 法生 物 破 碎 法 ： 酶 溶 法 （ 溶 菌 酶 、 甘 露 糖 酶 、 壳 多 糖 酶 等 ） 超 声 破 碎 法 四 、 固 液 分 离分 离 细 胞 碎 片 常 用 的 方 法 有 ：1. 离 心 沉 淀 ： 高 速 离 心 、 超 速 离 心2. 膜 过 滤 ： 微 滤 、 超 滤 和 反 渗 透3. 双 水 相 萃 取 ： 聚 乙 二 醇 -葡 聚 糖 聚 乙 二 醇 -无 机 盐 五 、 重 组 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 分

25、离 纯 化 主 要 依 赖 色 谱 分 离 方 法 。 色 谱 技 术 包 括 ： 离 子 交 换 色 谱 、 疏 水 色 谱 、 反 相 色 谱 、 亲 和 色 谱 、 凝 胶 过 滤 色 谱 、 高 效 液 相 色 谱 等 。 五 、 重 组 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 1. 离 子 交 换 层 析 ： 是 以 离 子 交 换 剂 为 固 定 相 ， 依 据 流 动 相 中 的 组 分 离 子 与 交 换 剂 上 的 平 衡 离 子 进 行 可 逆 交 换 时 的 结 合 力 大 小 的 差 别 而 进 行 分 离 的 一 种 层 析 方 法 。 pH、 两 性 分 子 、 侧 链 、

26、 COONH 3 五 、 重 组 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 2. 疏 水 层 析 ： 是 利 用 蛋 白 质 表 面 的 疏 水 区 域 与 固 定 相 上 疏 水 性 基 团 相 互 作用 力 的 差 异 ， 对 蛋 白 质 组 分 进 行 分 离 的 层 析 方 法 。 疏 水 层 析 最 常 用 填 料 是 多 聚 糖 （ 如 琼 脂 糖 ） 及 硅 胶 。 利 用 氨 基 酸 侧 链 的 疏 水 键 。 五 、 重 组 蛋 白 质 的 分 离 纯 化3. 亲 和 层 析 ： 是 利 用 固 定 化 配 体 与 目 的 蛋 白 质 之 间 非常 特 异 的 生 物 亲 和 力 进

27、行 吸 附 ， 这 种 结 合 既是 特 异 的 ， 又 是 可 逆 的 ， 改 变 条 件 可 以 使 这种 结 合 解 除 。 五 、 重 组 蛋 白 质 的 分 离 纯 化4. 凝 胶 过 滤 层 析 ： 又 称 为 凝 胶 排 阻 层 析 、 分 子 筛 层 析 ， 是以 多 孔 性 凝 胶 填 料 为 固 定 相 ， 按 分 子 大 小 对溶 液 中 各 组 分 进 行 分 离 的 液 相 层 析 方 法 。 大 分 子 先 从 色 谱 柱 中 流 出 六 、 非 蛋 白 质 类 杂 质 的 去 除1. DNA的 去 除 （ 1） DNA在 pH 4. 0以 上 呈 阴 离 子 ，

28、可 用 阴 离 子 交 换 剂 吸 附 除 去 ， 但 目 的 蛋 白 质 PI应 在 6. 0以 上 。 （ 2） 如 蛋 白 质 为 强 酸 性 ， 则 可 选 择 条 件 使 其 吸 附 在 阳 离 子 交 换 剂 上 ， 而 不 让 DNA吸 附 上 去 。 （ 3） 利 用 亲 和 层 析 吸 附 蛋 白 质 ， 而 DNA不 被 吸 附 ， 也 可 分 离 。 （ 4） 疏 水 层 析 对 分 离 也 有 效 ， 在 上 柱 时 需 要 高 盐 浓 度 ， 使 DNA-蛋 白 质 结 合 物 离 解 ， 蛋 白 质 吸 附 在 柱 上 ， 而 DNA不 被 吸 附 。 六 、 非

29、蛋 白 质 类 杂 质 的 去 除2. 热 原 质 的 去 除（ 1） 整 个 生 产 过 程 在 无 菌 条 件 下 进 行 ， 防 止 产 生 热 原 质 。（ 2） 所 有 层 析 介 质 在 使 用 前 先 除 去 热 原 质 ， 在 28 下 进 行 操 作 ， 洗 脱 液 需 先 经 无 菌 处 理 ， 流 出 的 蛋 白 质 溶 液 也 应 无 菌 处 理 ， 即 通 过 0. 2m微 滤 膜 ， 并 在 28 下 保 存 。 六 、 非 蛋 白 质 类 杂 质 的 去 除3. 病 毒 的 去 除 成 品 中 必 须 检 查 是 否 含 有 病 毒 。 病 毒 主 要 来 源 于

30、 宿 主 细 胞 。经 过 色 谱 分 离 ， 一 般 能 除 去 病 毒 ， 必 要 时 可 以 用 紫 外 线 照 射 使 病毒 失 活 ， 或 过 滤 将 病 毒 除 去 。 七 、 选 择 分 离 纯 化 方 法 的 依 据1. 根 据 产 物 表 达 形 式 来 选 择2. 根 据 分 离 单 元 之 间 的 衔 接 选 择3. 根 据 分 离 纯 化 工 艺 的 要 求 来 选 择（ 1） 要 具 有 良 好 的 稳 定 性 和 重 复 性 。（ 2） 要 尽 可 能 减 少 组 成 工 艺 的 步 骤 。（ 3） 组 成 工 艺 的 各 技 术 或 步 骤 之 间 要 能 相 互

31、 适 应 和 协 调 ， 工 艺 与 设 备 也 能 相 互 适 应 。（ 4） 在 工 艺 过 程 中 要 尽 可 能 少 用 试 剂 ， 以 免 增 加 分 离 纯 化 步 骤 ， 或 干 扰 产 品 质 量 。（ 5） 工 艺 时 间 要 尽 可 能 短 。（ 6） 工 艺 和 技 术 必 须 高 效 ， 收 率 高 ， 易 操 作 ， 对 设 备 要 求 低 ， 能 耗 低 。（ 7） 具 有 较 高 的 安 全 性 。 第 八 节 变 性 蛋 白 的 复 性一 、 包 含 体 形 成 的 原 因二 、 包 含 体 的 分 离 和 溶 解三 、 包 含 体 蛋 白 复 性 方 法 一

32、、 包 含 体 形 成 的 原 因包 含 体 形 成 的 原 因 主 要 是 高 水 平 表 达 的 结 果 。1. 在 高 水 平 表 达 时 ， 新 生 肽 链 的 聚 集 速 率 一 旦 超过 蛋 白 正 确 折 叠 的 速 率 就 会 导 致 包 含 体 的 形 成 。2. 重 组 蛋 白 在 大 肠 杆 菌 中 表 达 时 ， 缺 乏 一 些 蛋 白折 叠 过 程 中 需 要 的 酶 和 辅 助 因 子 ， 如 折 叠 酶 和 分 子伴 侣 等 ， 也 导 致 包 含 体 的 形 成 。 电 镜 下 包 含 体 颗 粒 一 、 包 含 体 形 成 的 原 因 包 含 体 虽 然 由

33、无 活 性 的 蛋 白 组 成 ， 但 包 含 体 形 成 对 重 组 蛋 白 的 生 产提 供 了 几 个 优 势 ：1. 包 含 体 具 有 高 密 度 ， 易 于 分 离 纯 化 ；2. 重 组 蛋 白 以 包 含 体 的 形 式 存 在 有 效 地 抵 御 了 大 肠 杆 菌 中 的 蛋 白 酶 对 目的 蛋 白 的 降 解 ；3. 用 于 生 产 处 于 天 然 构 象 对 宿 主 细 胞 有 毒 害 的 蛋 白 。 二 、 包 含 体 的 分 离 和 溶 解1.包 含 体 的 分 离（ 1） 对 培 养 收 集 的 重 组 菌 进 行 破 碎 （ 高 压 匀 浆 、 超 声 波 破

34、 碎 等 ） ， 为 了 提 高 破 碎 率 ， 可 以 加 入 一 定 量 的 溶 菌 酶 。（ 2） 离 心 除 去 破 碎 上 清 液 ， 沉 淀 部 分 用 含 有 低 浓 度 的 变 性 剂 （ 如 脲 和 盐 酸 胍 ） 、 去 垢 剂 （ 如 Triton X-100） 、 脱 氧 胆 酸 钠 等 化 合 物 的 缓 冲 液 进 行 洗 涤 ， 如 果 需 要 对 包 含 体 进 行 纯 化 ， 一 般 多 采 用 蔗 糖 密 度 梯 度 离 心 法。 二 、 包 含 体 的 分 离 和 溶 解2.包 含 体 的 溶 解 包 含 体 的 溶 解 一 般 都 用 强 的 变 性 剂

35、 如 脲 、 盐 酸 胍 或 硫 氰 酸 盐 ， 或去 垢 剂 如 SDS、 正 十 六 烷 基 三 甲 基 铵 氯 化 物 等 ； 对 于 含 有 半 胱 氨 酸 的蛋 白 质 ， 还 需 加 入 还 原 剂 如 巯 基 乙 醇 、 二 硫 苏 糖 醇 、 二 硫 赤 藓 糖 醇 及半 胱 氨 酸 。 温 度 一 般 选 择 在 30 以 促 进 溶 解 。 此 外 ， 由 于 金 属 离 子 具有 氧 化 催 化 作 用 ， 还 常 常 需 要 加 入 金 属 螯 合 剂 如 EDTA以 除 去 金 属 离子 。 三 、 包 含 体 蛋 白 复 性 方 法有 效 的 、 理 想 的 折 叠

36、 复 性 方 法 应 具 备 以 下 几 个 特 点 ： 活 性 蛋 白 质 的 回 收 率 高 。 正 确 复 性 的 产 物 易 于 与 错 误 折 叠 蛋 白 质 分 离 。 折 叠 复 性 后 应 得 到 浓 度 较 高 的 蛋 白 质 产 品 。 折 叠 复 性 方 法 易 于 放 大 。 复 性 过 程 耗 时 较 少 。 第 九 节 基 因 工 程 药 物 的 质 量 控 制一 、 医 药 生 物 技 术 产 品 质 量 保 证 的 一 般 性 要 点二 、 生 物 材 料 的 质 量 控 制三 、 培 养 过 程 的 质 量 控 制四 、 纯 化 过 程 的 质 量 控 制五

37、、 目 标 产 品 的 质 量 控 制 一 、 医 药 生 物 技 术 产 品 质 量 保 证 的 一 般 性 要 点1. 产 品 安 全 性 评 价 根 据 各 个 具 体 品 种 的 情 况 ， 提 出 各 不 相 同 的 安 全 性 评 价 要 求 ， 这 类 制 品安 全 性 临 床 试 验 设 计 方 案 与 试 验 范 围 须 根 据 不 同 情 况 作 不 同 规 定 。 一 、 医 药 生 物 技 术 产 品 质 量 保 证 的 一 般 性 要 点2. 产 品 本 身 的 结 构 基 因 工 程 产 品 或 人 的 多 肽 和 蛋 白 质 相 同 ， 或 其 氨 基 酸 序 列

38、 或 翻 译 后 修 饰 上 存 在 差 异 ， 或 是 非 人 源 性 或 外 源 多 肽 和 蛋 白 质 ， 如 病 毒 、细 菌 抗 原 。 对 上 述 后 两 类 产 品 ， 视 其 特 点 作 药 动 学 、 毒 理 学 研 究 。 对 基 因 修 饰 产 品 ， 要 作 一 般 毒 性 、 长 期 毒 性 以 及 致 突 变 、 致 癌 变 和 致 畸变 等 遗 传 毒 理 研 究 。 一 、 医 药 生 物 技 术 产 品 质 量 保 证 的 一 般 性 要 点3. 严 格 控 制 条 件 宿 主 细 胞 中 表 达 的 天 然 基 因 ， 转 录 或 翻 译 后 ， 或 精 制

39、 、 工 艺 放 大 过 程 中 ， 都 有 可 能 发 生 变 化 ， 故 从 原 料 到 制 成 品 制 备 全 过 程 的 每 一 步 都须 严 格 控 制 条 件 与 鉴 定 质 量 ， 确 保 符 合 标 准 规 格 、 安 全 有 效 。 二 、 生 物 材 料 的 质 量 控 制 原 材 料 的 质 量 控 制 是 要 确 保 编 码 药 品 的 DNA序 列 的 正 确 性 ，重 组 微 生 物 来 自 单 一 克 隆 ， 所 用 质 粒 纯 而 稳 定 ， 以 保 证 产 品 质 量 的安 全 性 和 一 致 性 ， 所 以 原 材 料 的 质 量 控 制 主 要 是 对 目

40、 的 基 因 、 表 达载 体 以 及 宿 主 细 胞 的 检 查 。 1.目 的 基 因 根 据 指 控 要 求 ， 需 明 确 目 的 基 因 的 来 源 、 克 隆 经 过 ； 对 于 改 造过 的 基 因 应 说 明 被 修 改 的 密 码 子 、 被 切 除 的 肽 段 及 拼 接 的 方 法 ；使 用 PCR技 术 扩 增 得 到 的 基 因 ， 应 说 明 扩 增 的 模 板 、 引 物 及 酶 反 应条 件 等 情 况 ， 并 以 限 制 性 内 切 酶 酶 切 图 谱 和 核 苷 酸 序 列 等 分 析 方 法确 证 基 因 结 构 的 正 确 无 误 。二 、 生 物 材

41、料 的 质 量 控 制 2. 表 达 载 体 应 提 供 表 达 载 体 的 名 称 、 结 构 、 遗 传 特 性 及 其 各 组 成 部 分 (如 复 制子 、 启 动 子 )的 来 源 与 功 能 ， 构 建 中 所 用 位 点 的 酶 切 图 谱 ， 抗 生 素 抗 性标 记 物 等 。二 、 生 物 材 料 的 质 量 控 制 3.宿 主 细 胞 应 提 供 宿 主 细 胞 的 名 称 、 来 源 、 传 代 历 史 、 检 定 结 果 及 其生 物 学 特 性 等 ； 需 阐 明 载 体 引 入 宿 主 细 胞 的 方 法 及 载 体 在 宿 主细 胞 内 的 状 态 ， 是 否

42、整 合 到 染 色 体 内 及 拷 贝 数 ， 并 证 明 宿 主 细胞 与 载 体 结 合 后 的 遗 传 稳 定 性 ； 提 供 插 入 基 因 与 表 达 载 体 两 侧端 控 制 区 内 的 核 苷 酸 序 列 ， 详 细 叙 述 在 生 产 过 程 中 ， 启 动 与 控制 克 隆 基 因 在 宿 主 细 胞 中 表 达 的 方 法 及 水 平 。二 、 生 物 材 料 的 质 量 控 制 在 贮 存 中 ， 要 求 种 子 克 隆 纯 而 稳 定 ； 在 培 养 过 积 中 ， 要 求 质 粒稳 定 ， 始 终 无 突 变 ； 重 复 生 产 发 酵 中 ， 工 程 菌 表 达 稳

43、 定 ； 始 终 能 排除 外 源 微 生 物 污 染 。三 、 培 养 过 程 的 质 量 控 制 1.生 产 用 细 胞 库 需 证 明 种 子 批 不 含 致 癌 因 子 ， 无 细 菌 、 病 毒 、 霉 菌 和 支 原 体 等 污染 ， 由 原 始 种 子 批 建 生 产 用 工 作 细 胞 库 。 在 同 一 实 验 室 工 作 区 内 ， 不 得 同 时 操 作 两 种 不 同 的 细 胞 或 菌 种 ，一 个 工 作 人 员 也 不 得 同 时 操 作 两 种 不 同 的 细 胞 或 菌 种 。 建 原 始 种 子 批 须 确 证 克 隆 基 因 DNA序 列 ， 详 细 叙

44、述 种 子 批 来 源 、方 式 、 保 存 及 预 计 使 用 期 ， 保 存 与 复 苏 时 宿 主 载 体 表 达 系 统 的 稳 定 性 。 对 生 产 种 子 ， 应 详 细 叙 述 细 胞 生 长 与 产 品 生 成 的 方 法 和 材 料 ， 并控 制 微 生 物 污 染 ； 提 供 培 养 生 产 浓 度 与 产 量 恒 定 性 数 据 ， 依 据 宿 主 细 胞/载 体 系 统 稳 定 性 确 定 最 高 允 许 传 种 代 数 。三 、 培 养 过 程 的 质 量 控 制 2.培 养 过 程 培 养 过 程 中 ， 应 测 定 被 表 达 基 因 分 子 的 完 整 性 及

45、 宿 主 细 胞长 期 培 养 后 的 基 因 型 特 征 ； 依 宿 主 细 胞 /载 体 稳 定 性 与 产 品 恒 定 性 ， 规 定 持 续 培 养 时 间 ，并 定 期 评 价 细 胞 系 统 和 产 品 。 培 养 周 期 结 束 时 ， 应 监 测 宿 主 细 胞 /载 体 系 统 的 特 性 。三 、 培 养 过 程 的 质 量 控 制 分 离 纯 化 过 程 中 ， 常 用 分 级 沉 淀 、 超 滤 、 电 泳 和 色 谱 等 技 术 ，其 质 量 控 制 要 求 能 保 证 去 除 微 量 DNA、 糖 类 、 残 余 宿 主 蛋 白 质 、纯 化 过 程 带 入 的 有

46、 害 化 学 物 质 及 热 原 质 ， 或 者 将 这 类 杂 质 都 控 制 在规 定 限 度 以 下 。四 、 纯 化 过 程 的 质 量 控 制 纯 化 工 艺 的 每 一 步 完 成 后 均 应 测 定 收 获 物 纯 度 ， 计 算 提 纯 倍 数 、 收获 率 等 ， 要 对 每 一 步 的 纯 化 效 率 、 活 性 回 收 率 和 蛋 白 回 收 率 进 行 检 测 。 要 明 确 使 用 的 纯 化 方 法 的 原 理 、 目 的 以 及 预 期 的 去 除 杂 质 的 效 果 ，在 不 同 纯 化 步 骤 中 能 去 除 不 同 性 质 的 杂 质 ， 并 进 行 相 应

47、 的 工 艺 验 证 。 纯 化 方 法 的 设 计 应 考 虑 到 尽 量 去 除 污 染 病 毒 、 核 酸 、 宿 主 细 胞 杂蛋 白 、 糖 以 及 纯 化 过 程 带 入 的 其 他 有 害 物 质 。 纯 化 工 艺 过 程 中 应 尽 量 不 加 入 对 人 体 有 害 的 物 质 。四 、 纯 化 过 程 的 质 量 控 制 如 用 柱 层 析 技 术 应 提 供 所 用 填 料 的 质 量 认 证 证 明 ， 并 证 实 从 柱 上不 会 掉 下 有 害 物 质 。 上 样 前 应 清 洗 除 去 热 原 质 等 。 若 用 亲 和 层 析 技 术 ， 不 应 含 有 可

48、测 出 的 异 种 免 疫 球 蛋 白 。 如 在 反 相 纯 化 步 骤 中 用 到 乙 腈 或 甲 醇 等 有 机 溶 剂 ， 用 Protein A亲和 层 析 纯 化 抗 体 ， 有 机 溶 剂 和 Protein A等 这 些 对 人 体 有 害 的 物 质 应 加以 去 除 和 控 制 。四 、 纯 化 过 程 的 质 量 控 制 基 因 工 程 药 物 质 量 控 制 主 要 包 括 以 下 几 项 要 求 ： 产 品 的 鉴 别 、 纯 度 、 活 性 、 安 全 性 、 稳 定 性 和 一 致 性 。 需 要 综 合 利 用 生 物 化 学 、 免 疫 学 、 微 生 物 学

49、 、 细 胞 生 物 学和 分 子 生 物 学 等 多 门 学 科 的 理 论 与 技 术 ， 保 证 基 因 工 程 药 品 的安 全 有 效 。五 、 目 的 产 品 的 质 量 控 制 1 生 物 活 性 测 定多 肽 和 蛋 白 质 药 物 的 生 物 学 活 性 是 蛋 白 质 药 物 的 重 要 质 量 控 制 指 标 。效 价 测 定 必 须 采 用 国 际 上 通 用 的 方 法 ， 测 定 结 果 必 须 用 国 际 或 国 家 标准 品 进 行 校 正 ， 以 国 际 单 位 表 示 或 折 算 成 国 际 标 准 单 位 。生 物 学 效 价 的 测 定 往 往 需 要

50、进 行 动 物 体 内 试 验 或 通 过 细 胞 培 养 进 行 体外 效 价 测 定 。体 内 生 物 活 性 的 测 定 要 根 据 目 的 产 物 的 生 物 学 特 性 建 立 适 合 的 生 物 学模 型 。体 外 生 物 活 性 测 定 的 方 法 有 细 胞 培 养 计 数 法 、 3H-TdR掺 入 法 和 酶 法 细 胞 计 数 等 。 五 、 目 的 产 品 的 质 量 控 制 蛋 白 质 的 比 活 性 是 每 毫 克 蛋 白 质 的 生 物 学 活 性 。 它 不 仅 是 含 量指 标 ， 也 是 纯 度 指 标 。 由 于 蛋 白 质 的 空 间 结 构 不 能 常

51、 规 测 定 ， 而 蛋 白 质 空 间 结 构 的 改变 ， 特 别 是 二 硫 键 的 错 配 ， 可 影 响 蛋 白 质 的 生 物 学 活 性 ， 从 而 影 响蛋 白 质 药 物 的 药 效 ， 比 活 性 可 以 间 接 地 反 应 这 一 情 况 。五 、 目 的 产 品 的 质 量 控 制 2 理 化 性 质 鉴 别（ 1） 非 特 异 性 鉴 别 根 据 还 原 型 电 泳 的 迁 移 率 和 高 效 液 相 色 谱 的 保 留 时 间 和 峰 型 来 进 行 分 析 。（ 2） 特 异 性 鉴 别 利 用 免 疫 印 迹 、 免 疫 电 泳 、 免 疫 扩 散 等 免 疫

52、学 方 法 ， 确 定 蛋 白 质 的 抗 原 性 。五 、 目 的 产 品 的 质 量 控 制 （ 3） 相 对 分 子 质 量 测 定 蛋 白 质 相 对 分 子 质 量 测 定 最 常 用 的 方 法 有 凝 胶 过 滤 法 和SDS-PAGE法 ， 凝 胶 过 滤 法 测 定 完 整 的 蛋 白 质 相 对 分 子 质 量 ，而 SDS-PAGE法 测 定 蛋 白 质 亚 基 的 相 对 分 子 质 量 。（ 4） 等 电 点 测 定 样 品 用 等 点 聚 焦 法 测 定 等 电 点 。 在 生 产 过 程 中 ， 批 与 批 之间 的 电 泳 结 果 应 该 一 致 ， 以 此 控

53、 制 生 产 工 艺 的 稳 定 性 。五 、 目 的 产 品 的 质 量 控 制 （ 5） 肽 图 分 析 肽 图 分 析 是 用 酶 法 或 化 学 法 降 解 目 的 蛋 白 质 ， 对 生 成 的 肽 段 进 行 分 离 分 析 。 是 一 种 检 测 蛋 白 质 一 级 结 构 中 细 微 变 化 的 最 有 效 方 法 。 肽 图 分 析 可 作 为 制 品 与 标 准 品 作 精 密 比 较 的 手 段 ， 与 氨 基 酸 成分 和 序 列 分 析 结 果 合 并 ， 作 为 蛋 白 质 的 精 确 鉴 别 。 该 技 术 灵 敏 高 效 ， 是 对 基 因 工 程 药 物 的

54、分 子 结 构 和 遗 传 稳 定 性进 行 评 价 和 验 证 的 首 选 方 法 。 同 种 产 品 不 同 批 次 的 肽 图 的 一 致 性 是 工 艺 稳 定 性 的 验 证 指 标 。五 、 目 的 产 品 的 质 量 控 制 蛋 白 质 降 解 形 成 的 肽 段 的 鉴 定 可 以 用 SDS-PAGE电 泳 法 、 高 效 液相 色 谱 （ high performance liquid chromatography, HPLC） 、 毛 细管 电 泳 法 及 质 谱 法 来 测 定 。五 、 目 的 产 品 的 质 量 控 制 （ 6） 氨 基 酸 组 成 分 析 一 般

55、对 含 50个 左 右 的 氨 基 酸 残 基 的 蛋 白 质 的 定 量 分 析 接 近 理 论 值 。 完 整 的 氨 基 酸 成 分 分 析 结 果 ， 应 包 括 甲 硫 氨 酸 、 胱 氨 酸 和 色 氨 酸 的 准 确 值 。 氨 基 酸 成 分 分 析 结 果 应 为 三 次 分 别 水 解 样 品 测 定 后 的 平 均 值 。 测 定 的 重 组 蛋 白 质 的 氨 基 酸 组 成 应 与 标 准 品 一 致 。 氨 基 酸 组 成 分 析 采 用 氨 基 酸 自 动 分 析 仪 测 定 ， 包 括 蛋 白 质 水 解 、 自 动 进 样 ， 氨 基 酸 分 析 、 定 量

56、分 析 报 告 等 内 容 。五 、 目 的 产 品 的 质 量 控 制 （ 7） 部 分 氨 基 酸 序 列 分 析 此 项 是 重 组 蛋 白 质 的 重 要 鉴 别 指 标 ， 一 般 要 求 对 中 试 前 三 批 产 品 至 少 应 该 测 定 N端 15个 氨 基 酸 ， C端 应 根 据 情 况 测 定 13个 氨 基 酸 。（ 8） 蛋 白 质 二 硫 键 分 析 测 定 巯 基 的 方 法 有 别 PMCB法 、 DTNB法 、 NEMI法 等 。五 、 目 的 产 品 的 质 量 控 制 3.蛋 白 质 含 量 测 定 主 要 用 于 原 液 比 活 性 计 算 和 成 品

57、 规 格 的 控 制 。 蛋 白 质 含 量 可 根 据 其 物 化 性 质 采 用 Folin-酚 试 剂 法 、 染 色法 （ Bradford） 、 双 缩 脲 法 、 紫 外 吸 收 法 ， HPLC法 和 凯 氏 定氮 法 等 方 法 ， 其 中 Folin-酚 试 剂 法 、 染 色 法 是 在 质 量 检 定 中 常使 用 的 方 法 。五 、 目 的 产 品 的 质 量 控 制 4.蛋 白 质 纯 度 分 析 纯 度 分 析 是 基 因 工 程 药 物 质 量 控 制 的 关 键 项 目 。 测 定 蛋 白质 含 量 可 根 据 其 本 身 理 化 性 质 和 生 物 学 特

58、性 设 计 。 通 常 采 用 的方 法 有 还 原 性 及 非 还 原 性 SDS-PAGE、 等 电 点 聚 焦 、 各 种HPLC及 毛 细 管 电 泳 等 。五 、 目 的 产 品 的 质 量 控 制 5.杂 质 的 检 测 基 因 工 程 产 物 的 杂 质 包 括 蛋 白 质 和 非 蛋 白 质 两 类 。五 、 目 的 产 品 的 质 量 控 制 （ 1） 蛋 白 类 杂 质 在 蛋 白 类 杂 质 中 ， 最 主 要 的 是 纯 化 过 程 中 残 余 的 宿 主 细 胞 蛋 白 。 测 定 采 用 免 疫 分 析 的 方 法 。 同 时 需 辅 以 电 泳 等 其 他 检 测

59、 手 段 补 充 和 验证 。 除 宿 主 细 胞 蛋 白 外 ， 目 的 蛋 白 本 身 也 可 能 发 生 某 些 变 化 ， 形 成 在理 化 性 质 上 与 原 蛋 白 质 极 为 相 似 的 蛋 白 杂 质 ， 在 体 内 往 往 会 导 致 抗 体的 产 生 ， 在 质 量 控 制 中 也 要 加 以 严 格 控 制 。五 、 目 的 产 品 的 质 量 控 制 （ 2） 非 蛋 白 类 杂 质 具 有 生 物 学 作 用 的 非 蛋 白 类 杂 质 主 要 有 病 毒 和 细 菌 等 微 生 物 、 热原 质 、 内 毒 素 、 致 敏 原 及 DNA。 基 因 工 程 药 物

60、应 证 实 最 终 制 品 中 无 外源 病 毒 和 细 菌 等 污 染 。 热 原 质 可 用 传 统 的 注 射 家 兔 法 进 行 检 测 。 目 前 鲎 试 验 法 测 定 内 毒 素 。 必 须 用 敏 感 的 方 法 来 测 定 来 源 于 宿 主 细 胞 的 残 余 DNA的 含 量 。五 、 目 的 产 品 的 质 量 控 制 6.稳 定 性 考 察 药 品 的 稳 定 性 是 评 价 药 品 有 效 性 和 安 全 性 的 重 要 指 标 之 一 ， 也 是确 定 药 品 贮 藏 条 件 和 使 用 期 限 的 主 要 依 据 。 没 有 一 种 单 一 的 稳 定 性 试

61、验 或 参 数 能 够 完 全 反 映 基 因 工 程 药 物 的 稳定 性 特 征 ， 必 须 对 产 品 在 一 致 性 、 纯 度 、 分 子 特 征 和 生 物 效 价 等 多 方面 的 变 化 情 况 加 以 综 合 评 价 。 采 用 恰 当 的 物 理 化 学 、 生 物 化 学 和 免 疫 化 学 技 术 对 其 活 性 成 分 的 性质 进 行 全 面 鉴 定 ， 并 且 要 准 确 检 测 在 贮 藏 过 程 中 由 于 脱 氨 、 氧 化 、 磺酰 化 、 聚 合 或 降 解 等 造 成 的 分 子 变 化 ， 可 选 用 电 泳 和 高 分 辨 率 的 HPLC， 以

62、及 肽 图 分 析 等 方 法 。五 、 目 的 产 品 的 质 量 控 制 由 于 蛋 白 质 是 一 种 结 构 十 分 复 杂 的 大 分 子 物 质 ， 可 能 同 时 存 在 多 种 降解 途 径 ， 其 降 解 过 程 往 往 不 符 合 Arrhenius动 力 学 方 程 ， 因 此 通 过 加 速 降解 试 验 来 预 测 基 因 工 程 药 物 的 有 效 期 并 不 十 分 可 靠 。 必 须 进 行 在 真 实 条 件下 、 真 实 时 间 的 长 期 稳 定 性 考 察 ， 才 能 确 定 其 有 效 期 限 。五 、 目 的 产 品 的 质 量 控 制 7 产 品

63、一 致 性 的 保 证 以 重 组 DNA技 术 为 主 的 生 物 制 药 是 一 个 十 分 复 杂 的 过 程 ， 生 产 周期 可 达 一 个 月 甚 至 更 长 ， 影 响 因 素 较 多 。 只 有 对 从 原 料 、 生 产 到 产 品 的 每 一 步 骤 都 进 行 严 格 的 控 制 和 质 量检 定 ， 才 能 确 保 各 批 最 终 产 品 都 是 安 全 有 效 、 含 量 和 杂 质 限 度 一 致 并符 合 标 准 规 格 的 。五 、 目 的 产 品 的 质 量 控 制 目 的 产 物 失 活 受 多 种 理 化 因 素 的 影 响 ， 保 存 时 要 根 据 其

64、 不 同 特 性 ， 采用 不 同 的 措 施 ， 防 止 变 性 、 降 解 ， 保 护 其 活 性 。六 、 产 品 的 保 存 1. 液 态 保 存液 态 保 存 主 要 有 4种 常 用 方 法 ： （ 1） 低 温 保 存 蛋 白 质 对 热 敏 感 ， 温 度 越 高 ， 稳 定 性 越 差 ， 在 绝 大 多 数 情 况 下 可 以 低 温 保 存 蛋 白 质 溶 液 ， 液 态 蛋 白 质 样 品 在 -20- 10 以 下 冰 冻 保 存 比 较 理 想 。（ 2） 在 稳 定 pH条 件 下 保 存 多 数 蛋 白 质 只 有 在 很 窄 的 pH范 围 内 才 稳 定 ，

65、 超 出 此 范 围 会 迅 速 变 性 ， 蛋 白 质 较 稳 定 的 pH一 般 在 等 电 点 ， 因 而 保 存 液 态 蛋 白 质 样 品 时 ， 应 小 心 调 到 其 稳 定 的 pH范 围 内 。六 、 产 品 的 保 存 （ 3） 高 浓 度 保 存 一 般 蛋 白 质 在 高 浓 度 溶 液 中 比 较 稳 定 ， 保 存 时 浓 度 不 能 太 低 ， 否 则 可 能 会 引 起 亚 基 解 离 和 表 面 变 性 。（ 4） 加 保 护 剂 保 存 可 以 降 低 蛋 白 质 溶 液 的 极 性 ， 以 免 变 性 失 活 。 这 类 蛋 白 质 的 稳 定 剂 有 糖

66、 类 、 脂 肪 类 、 蛋 白 质 类 、 多 元 醇 、 有 机 溶 剂 等 ； 有 些 蛋 白 质 加 入 中 性 盐 可 稳 定 ； 某 些 蛋 白 质 可 加 入 2-巯 基 乙 醇 、 二 硫 苏 糖 醇 等 ， 在 真 空 或 惰 性 气 体 中 密 闭 保 存 。六 、 产 品 的 保 存 2 固 态 保 存 固 态 蛋 白 质 比 液 态 稳 定 。 长 期 保 存 蛋 白 质 的 最 好 方 法 是 制 成 干 粉 或 结 晶 。 冻 干 粉 或 结 晶 都 具 有 强 抗 热 性 和 稳 定 性 ， 放 在 干 燥 器 中 在 4 以 下 可 保 存 相 当 长 的 时 间 。 六 、 产 品 的 保 存 七 、 基 因 工 程 制 药 实 例1. 干 扰 素2. GM-CSF3. 人 白 细 胞 介 素 -2