疟疾血检技术培训

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1、全 球 基 金 疟 疾 项 目镜 检 技 术 培 训 （ 二 ） 疟 原 虫 检 验 技 术v 采 集 血 样v 血 片 制 作v 血 片 染 色v 疟 原 虫 镜 检 采 集 血 样采 血 部 位 ： 耳 垂 或 无 名 指 ，取 血 方 法 ： 通 常 在 耳 垂 取 血 ， 先用 75%酒 精 棉 球 消 毒 取 血 部 位 ，待 酒 精 干 后 ， 用 左 手 拇 指 和 食指 紧 捏 耳 垂 上 方 或 无 名 指 指 尖 ，右 手 持 消 毒 针 迅 速 刺 入 皮 肤 ，不 宜 过 深 或 过 浅 。 然 后 用 右 手中 指 轻 轻 挤 压 出 血 。 厚 血 膜 血量 约 一

2、 粒 米 大 小 ,薄 血 膜 血 量 为厚 血 膜 的 一 半 或 1/3。 厚 血 膜 ： 用 推 片 的 一 角 ， 取 血一 小 滴 （ 约 4 4. 5微 升 ） ，置 于 平 置 的 载 玻 片 上 ， 由里 向 外 一 个 方 向 旋 转 ， 涂成 直 径 0. 81厘 米 大 小 圆 形厚 血 膜 。薄 血 膜 ： 以 推 片 一 端 的 中 部 取血 一 小 滴 ， 使 血 滴 与 载 玻片 接 触 ， 血 液 沿 推 片 边 缘向 两 侧 展 开 ， 将 推 片 与 载玻 片 保 持 30 0-450， 均 匀 而 迅速 适 当 地 用 力 向 前 推 成 舌形 薄 血 膜

3、 。 血 片 制 作 （ 一 ） 厚 血 膜薄 血 膜 血 片 制 作 （ 二 ）标 准 的 疟 疾 厚 薄 血 膜 片 ：v 把 载 玻 片 分 成 六 等 份 ， 把 厚 血 膜 涂 在 从 右 到 左 的 第 三 格 中央 ， 薄 血 膜 涂 在 第 四 格 前 缘 至 第 六 格 中 部 ， 第 一 、 二 格 备贴 标 签 编 号 用 。 厚 、 薄 血 膜 间 用 蜡 笔 划 线 分 开v 厚 血 膜 血 量 不 宜 过 多 或 过 少v 薄 血 膜 平 整 ,无 皱 折 和 空 泡 .显 微 镜 下 红 细 胞 单 层 排 列 血 片 制 作 （ 三 ）不 同 血 片 涂 布 法

4、 ：v 标 准 血 片v 门 诊 发 热 病 人 血 片 v 居 民 普 查 血 片 血 片 染 色 （ 一 ）染 色 方 法 :v吉 氏 染 色 法v瑞 氏 染 色 法 WHO推 荐 使 用 吉 氏 染 色 法 血 片 染 色 （ 二 ）吉 氏 原 液 的 配 制 ： 吉 氏 染 粉 (Azure B type) g 甘 油 (纯 ) 50ml 甲 醇 (纯 ) 50mlv 把 吉 氏 粉 置 于 研 钵 中 ， 加 少 量 甘 油 充 分 研 磨 , 然 后 边 加边 磨 ， 直 至 50ml甘 油 完 全 加 入 ， 倒 入 棕 色 瓶 中 。 然 后在 研 钵 中 加 入 少 许 甲

5、醇 清 洗 研 钵 ， 洗 液 倒 入 棕 色 瓶 中 ，再 放 入 甲 醇 清 洗 ， 反 复 数 次 ， 直 至 甲 醇 用 完 。 盖 好 瓶 盖 ，充 分 摇 匀 ， 置 于 65 温 箱 中 24小 时 ， 或 室 温 阴 暗 处 1-2周 后 过 滤 ， 备 用 。 v 整 个 染 色 液 配 制 时 间 不 能 少 于 5个 小 时v 时 间 越 长 染 色 效 果 越 好 。 血 片 染 色 （ 三 ）吉 氏 染 液 的 配 制 ：v把 吉 氏 原 液 用 PH7.0 0.2缓 冲 液 稀 释 ， 比例 约 为 1:15 20， 稀 释 后 方 可 用 于 厚 薄 血片 染 色

6、 。v吸 取 原 液 时 ， 不 要 晃 动 瓶 子 ,以 免 沉 淀 物 泛起 影 响 染 色 效 果 . 血 片 染 色 （ 四 ）v 血 膜 固 定 ： 血 膜 充 分 晾 干 后 ， 用 甲 醇 固 定 薄 血 膜 。 厚血 膜 上 滴 加 蒸 馏 水 进 行 溶 血 ， 到 血 膜 呈 灰 白 色 时 ， 将水 倒 去 ， 晾 干 后 再 用 甲 醇 固 定 。注 意 ： 薄 血 膜 固 定 时 ， 甲 醇 不 可 触 碰 未 溶 血 的 厚 血 膜 。 厚 血 膜 溶 血 时 ， 蒸 馏 水 不 可 触 碰 薄 血 膜 。 血 片 染 色 （ 五 ）v 血 片 染 色 ：1.吉 氏

7、 染 色 法 ： 把 吉 氏 染 液 滴 加 于 已 固 定 的 厚 、 薄 血 膜 上 ， 室温 染 色 30分 钟 ， 用 缓 冲 液 冲 洗 干 净 。 血 片 晾 干 后 镜 检 。2.快 速 吉 氏 染 色 法 ： 取 吉 氏 原 液 1ml， 加 缓 冲 液 5ml， 混 匀 后 ，滴 加 于 厚 、 薄 血 膜 上 染 色 5分 钟 ， 用 缓 冲 液 冲 洗 ， 晾 干 后 镜检 。 血 片 染 色 （ 六 ）3.成 批 血 片 染 色 ： 将 已 固 定 的 血 片 插 入 染 色 缸 ， 加 入 吉 氏 染 液浸 没 血 片 ， 对 厚 、 薄 血 膜 同 时 染 色 30

8、分 钟 。注 意 ： 如 果 吉 氏 染 液 是 从 市 场 上 购 置 的 成 品 试 剂 ， 请 严 格 按 照说 明 书 操 作 。 血 片 染 色 （ 七 ）血 片 染 色 结 果 ：v 染 色 质 量 好 的 血 片 ：显 微 镜 下 核 呈 红 色 ，胞 浆 呈 蓝 色 ， 薄 血膜 平 整 ， 红 细 胞 单层 排 列 。v 如 果 血 片 偏 红 ,说 明染 液 偏 酸 性 v 如 果 血 片 偏 蓝 ,说 明染 液 偏 碱 性 吉 氏 染 色 血 片 外 观 血 片 染 色 （ 八 ）v 血 片 制 作 与 染 色 注 意 事 项 ： 、 载 玻 片 必 须 清 洁 无 油

9、污 ； 、 固 定 薄 血 膜 时 ， 甲 醇 不 要 触 碰 到 厚 血 膜 ； 、 厚 血 膜 在 染 色 之 前 先 用 清 水 滴 加 在 上 面 进 行 溶 血 ，以 防 厚 血 膜 染 色 后 颜 色 发 黑 ， 影 响 镜 检 ； 、 血 片 充 分 干 燥 后 方 可 染 色 ， 防 止 冲 洗 染 液 时 厚 血膜 脱 落 。5、 未 染 色 血 膜 的 放 置 时 间 夏 天 不 宜 超 过 48小 时 ， 冬天 不 宜 超 过 72小 时 ， 否 则 厚 血 膜 会 自 然 固 定 ， 影 响镜 检 。 疟 原 虫 镜 检 （ 一 ） 厚 血 膜 薄 血 膜 优 点 血

10、量 多 ， 面 积 小 ， 原虫 较 为 集 中 。 原 虫检 出 率 高 血 量 少 ， 面 积 大 ， 干 燥 快 红细 胞 完 整 ， 原 虫 形 态 极 少 变形 。 用 于 观 察 原 虫 形 态 与 鉴别 虫 种 。 缺 点 原 虫 在 干 燥 过 程 中 皱缩 ， 红 细 胞 消 失 ， 原虫 变 形 较 大 ， 原 虫鉴 定 困 难 血 量 比 厚 血 膜 少 许 多 ， 但 面积 是 厚 血 膜 的 8-10倍 。 检 查费 时 ， 原 虫 检 出 率 较 低用 途 用 于 疟 疾 病 人 检 查 虫 种 、 虫 期 鉴 定 及 初 学 者 教 学 标 本疟 原 虫 厚 、

11、薄 血 膜 镜 检 优 缺 点 显 微 镜 下 厚 血 膜 读 片 顺 序疟 原 虫 镜 检 （ 二 ）v 读 片 顺 序 ： 显微 镜 镜 下 按 由上 而 下 、 之 字形 顺 序 读 片 疟 原 虫 镜 检 （ 三 ）镜 检 疟 原 虫 结 果 判 断 ：v 阴 性 血 片 ： 检 查 全 部 厚 血 膜 视 野 未 查 见 疟 原 虫 ； 最 少 检 查 100个 厚 血 膜 视 野 未 查 见 疟 原 虫 （ 临 床 病人 ） 。v 阳 性 血 片 ： 检 出 各 期 疟 原 虫 （ 环 状 体 、 裂 殖 体 、 配 子体 ） 。v 混 合 感 染 ： 在 一 个 血 膜 上 有

12、2种 以 上 疟 原 虫 感 染 称 为 混合 感 染 ， 较 常 见 的 是 间 日 疟 原 虫 与 恶 性 疟 原 虫 混 合 。 v 镜 检 判 断 P.v+P.f混 合 感 染 ： 必 须 是 看 到 P.v各 期 原 虫 和P.f的 配 子 体 。 间 日 疟 和 恶 性 疟 的 鉴 定 要 点疟 原 虫 镜 检 （ 四 ） 疟 原 虫 镜 检 （ 五 ）v 疟 原 虫 形 态 特 征 ： 间 日 疟 （ P. vivax ） 鉴 定 要 点 红 细 胞 通 常 涨大 薛 氏 点 明 显 成 熟 环 状 体 粗大 滋 养 体 胞 浆 有阿 米 巴 样 伪 足 血 片 中 可 见 各期

13、 的 原 虫 形 态 成 熟 裂 殖 体 约含 12-24个 裂 殖子 疟 原 虫 镜 检 （ 六 ）v 疟 原 虫 形 态 特 征 ： 恶 性 疟 （ P.falciparum） 鉴 定 要点 ： 红 细 胞 不 涨 大 小 滋 养 体 （ 环 状 体 ）纤 细 , 常 有 多 重 感 染， 环 状 体 内 可 有 2个核 环 状 体 可 贴 在 红 细 胞边 缘 血 片 中 没 有 其 他 发 育期 的 大 滋 养 体 配 子 体 呈 新 月 形 或 腊肠 形 成 熟 裂 殖 体 约 含 16-32个 裂 殖 子 可 出 现 茂 氏 点 镜 检 示 教v以 下 血 片 采 自 现 症 病

14、例疟 原 虫 镜 检 （ 七 ） 间 日 疟 环 状 体 2. Intermittent fever; arrived from India 2 months ago. 间 日 疟 滋 养 体 3. History of round the world safari including S. America, Asia and Africa. General malaise. 恶 性 疟 雄 配 子 体 4. Unspecified overseas travel. Presented with temperature 38.4C 三 日 疟 裂 殖 体 5. Male recently re

15、turned to Australia after backpacking through Asia. History of flu like symptoms. 白 细 胞 6. New Australian previously from Malaysia. Intermittent temperatures and headaches. 白 细 胞 7. Aches and pains, with fever. ? Glandular Fever, ?malaria. 间 日 疟 裂 殖 体 恶 性 疟 环 状 体 18. Recent trip to Southern India- h

16、eadaches and vaguely unwell. 间 日 疟 裂 殖 体 19. Patient has been holidaying in the Dominican Republic, now feverish. 恶 性 疟 雄 配 子 体 21. A member of the UN forces in East Timor. Presented with high temperature. 恶 性 疟 雌 雄 配 子 体 间 日 疟 裂 殖 体 恶 性 疟 雌 配 子 体 间 日 疟 裂 殖 体 血 检 质 量 考 核v 实 验 室 条 件v 血 检 工 作 要 求v 考 核

17、 标 准 实 验 室 条 件v 人 员 ： 各 单 位 至 少 有 1名 专 职 或 兼 职 的 经 过 疟 原 虫检 验 技 术 培 训 的 人 员 。 熟 悉 疟 疾 血 片 的 制 作 ， 疟原 虫 的 镜 下 特 征 ， 能 承 担 疟 疾 血 检 工 作 。v 环 境 ： 实 验 室 相 对 独 立 ， 可 做 疟 疾 血 检 。v 设 备 ： 显 微 镜 、 玻 片 、 玻 片 架 、 玻 片 合 、 染 色 缸 。v 试 剂 ： 吉 氏 染 液 、 甲 醇 、 二 甲 苯 、 镜 油 。 血 检 工 作 要 求v 制 定 疟 原 虫 镜 检 实 验 室 管 理 制 度 、 疟 原

18、 虫 镜检 操 作 规 程 v 对 血 检 对 象 进 行 认 真 登 记 ， 填 写 疟 原 虫 镜 检 登 记表 ， 按 接 样 顺 序 编 号 。 编 号 ： 医 院 名 称 代 码 序号 。v 保 留 镜 检 过 的 所 有 血 片 ， 以 备 上 级 抽 样 复 查 ， 经 上一 级 机 构 同 意 后 方 可 清 洗 。 阳 性 血 片 须 专 人 管 理 。v 血 液 标 本 有 潜 在 生 物 危 害 ， 在 实 验 室 血 检 工 作 、 标本 保 存 中 应 严 格 遵 守 实 验 室 生 物 安 全 通 用 要 求 。 县 （ 市 /区 ） 全 球 基 金 疟 疾 项 目

19、 发 热 病 人 疟 原 虫 血 检 登 记 表 血 检 单 位 ： 、 序号 姓 名 年龄 性别 居 住 地 址 外 出史 及地 点 职业 发病日期 体温（oC) 临床初诊 血检日期 血 检 方 法 血 检 结 果 检验人签名 血样编号镜检 RDT 阴性 Pf Pv Pm Po 混合1 234合计 疟 原 虫 血 检 考 核 标 准 (1)项 目 检 查 内 容 质 量 标 准 考 核分 值好 分值 中 分值 差 分值血 片制作 厚 血 膜(25分 ） 血 量 （ 5分 ） 4 5 l 5 略 多 或 略 少 3 过 多 或 过 少 1位 置 （ 5分 ） 玻 片 右 1/3 5 稍 偏 右

20、 4 偏 右 过 多 3直 径 （ 5分 ） 0.8 1.0cm 5 0.7 0.8 或 1.01.2cm 3 1.2cm 1外 观 (10分 ) 圆 形 厚 膜 均 匀 ,边 缘 整 齐 10 圆 形 稍 不 均 不 整 齐 8 厚 薄 不 匀 影 响 着 色 5薄 血 膜(25分 ） 血 量 （ 5分 ） 1 1.5 l 5 略 多 或 略 少 3 过 多 或 过 少 1位 置 （ 5分 ）直 径 （ 5分 ）外 观 (10分 ） 玻 片 1/2 1/3处 5 稍 偏 右 或 偏 左 4 偏 右 或 偏 左 过 多 32.5 2.0cm 5 稍 大 或 稍 小 3 过 多 或 过 少 1舌

21、 状 厚 薄 均 匀 10 舌 状 稍 不 均 5 厚 薄 不 匀 呈 波 浪 型 3 考 核 标 准 疟 原 虫 血 检 考 核 标 准 （ 2）项 目 检 查内 容 质 量 标 准 考 核分 值好 分值 中 分值 差 分值血 片 染色 质 量(15分 ) 外 观（ 5分 ） 蓝 紫 色 5 深 蓝 色 3 红 色 或 灰 白 色 2镜 下(10分 ) 白 细 胞 、 疟 原虫 胞 浆 蓝 色 ，核 红 色 10 染 色 过 深 ， 原虫 胞 浆 与 核 均呈 深 蓝 色 8 染 色 过 浅 ， 胞浆 蓝 色 不 易 显见 ， 核 淡 红 5 血 片 清洁 度(10分 ) 外 观（ 5分 ）

22、 光 洁 无 油 灰 5 稍 有 油 污 2 油 灰 粘 连 2镜 下（ 5分 ） 无 沉 渣 5 稍 有 沉 渣 2 沉 渣 多 或 有 杂菌 2 疟 原 虫 血 检 考 核 标 准 （ 3）项 目 检 查内 容 使 用 标 准 扣 分 标 准 考 核分 值显 微 镜 使 用（ 25分 ） 使 用 前 （ 10分 ） 显 微 镜 干 净 ， 有 绸 布 遮 盖 ， 接物 镜 不 与 聚 光 器 对 接 显 微 镜 稍 有 灰 （ -2分 ） ， 无绸 布 遮 盖 （ -4分 ） ， 接 物 镜与 聚 光 器 对 接 （ -4分 ）镜 检 时 （ 10分 ） 打 开 光 源 ， 调 节 亮 度

23、 ， 聚 光 器上 升 至 最 高 位 置 ， 油 镜 与 聚 光器 对 接 ， 放 入 待 检 血 片 ， 镜 台上 升 直 至 油 镜 与 血 膜 接 触 ， 然后 镜 台 徐 徐 下 降 ， 出 现 视 野 用微 调 调 节 聚 光 器 未 上 升 至 最 高 位 置 即放 血 片 （ -2分 ） ， 镜 台 上 升或 下 降 过 快 （ -3分 ） ， 压 破玻 片 （ -10分 ） 使 用 后（ 5分 ） 擦 拭 干 净 油 镜 ， 物 镜 转 离 聚 光器 ， 绸 布 遮 盖 未 擦 拭 油 镜 （ -1分 ） ， 物 镜未 转 离 聚 光 器 （ -2分 ） ， 未用 绸 布 遮 盖 （ -2分 ）合 计 100分