转化子的筛选与重组子的鉴定

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1、LOGO 转 化 子 的 筛 选 与 重 组 子 的 鉴 定 为 什 么 要 进 行 转 化 子 的 筛 选 和 重 组子 的 鉴 定 ？ 在 DNA体 外 重 组 实 验 中 ， 外 源 DNA片 段 与 载 体 DNA的 连 接 反 应 物一 般 不 经 分 离 直 接 用 于 转 化 ， 再 加 上 重 组 率 和 转 化 率 的 不 理 想 ， 因 此必 须 通 过 筛 选 和 鉴 定 来 区 分 转 化 子 与 非 转 化 子 、 重 组 子 与 非 重 组 子 、期 望 重 组 子 与 非 期 望 重 组 子 。v转 化 子 ： 接 纳 载 体 或 重 组 分 子 的 转 化 细

2、胞 。v非 转 化 子 ： 为 接 纳 载 体 或 重 组 分 子 的 非 转 化 细 胞 。v重 组 子 ： 含 有 重 组 DNA分 子 的 转 化 子 。v非 重 组 子 ： 仅 含 有 空 载 载 体 分 子 的 转 化 子 。v期 望 重 组 子 ： 含 有 目 的 基 因 的 重 组 子 。v非 期 望 重 组 子 ： 不 含 目 的 基 因 的 重 组 子 。 转 化 子重 组 子期 望 重 组 子 三 者 的 关 系 转 化 子 的 筛 选 与 重 组 子 的 鉴 定 方 法v基 于 载 体 遗 传 标 记 的 筛 选 与 鉴 定 利 用 载 体 DNA分 子 上 所 携 带

3、的 选 择 性 遗 传 标 记 基 因 筛 选 转 化 子 或重 组 子v基 于 克 隆 片 段 序 列 的 筛 选 与 鉴 定 由 于 基 于 载 体 遗 传 的 筛 选 与 鉴 定 程 序 不 能 区 分 期 望 重 组 子 与 非 期望 重 组 子 。 在 大 多 数 情 况 下 ， 待 克 隆 的 目 的 基 因 或 DNA片 段 的 序 列 至少 部 分 是 已 知 的 ， 因 此 根 据 克 隆 片 段 序 列 设 计 的 筛 选 与 鉴 定 程 序 具 有广 泛 的 实 用 性v基 于 外 源 基 因 表 达 产 物 的 筛 选 与 鉴 定 如 果 克 隆 在 受 体 细 胞 中

4、 的 外 源 基 因 编 码 产 物 是 蛋 白 质 ， 则 可 通 过 检 测 这 种 蛋 白 质 的 生 物 功 能 或 结 构 来 筛 选 和 鉴 定 期 望 重 组 子 基 于 载 体 遗 传 标 记 的 筛 选 与 鉴 定抗 药 性 筛 选 法营 养 缺 陷 性 筛 选 法显 色 模 板 筛 选 法 噬 菌 斑 筛 选 法 ROPROI Sal IBamH ITcrPvu IPst I Pst IEcoR ICla IHind IIIHind II Bal IAp rpBR3224363 bpori 可 区 分 转 化 子 与 非 转 化 子 、 重 组 子 与 非 重 组 子 。非

5、 重 组 子 ： Apr、 Tcr 重 组 子 ： Aps、 Tcs 抗 药 性 筛 选 法将 外 源 DNA片 段插 入 BamH I、 Sal I位 点 将 转 化 液 涂 布 含 Ap的 平 板 Ap再 将 Ap平 板 上 的 转 化 子 影 印至 含 有 Ap和 Tc的 平 板 上 Ap+Tc影印挑选在 Ap平 板 上 生 长 、 但 在Ap+Tc平 板 上 不 长 的 转 化 子为 重 组 子基 本 操 作 ： 营 养 缺 陷 性 筛 选 法基 本 原 理 ： 营 养 缺 陷 型 筛 选 法 可 以 区 分 转 化 子 与 非 转 化 子 ， 一 般 不 能 区 分 重 组子 与 非

6、 重 组 子 。 其 原 理 是 ： 载 体 分 子 上 携 带 某 种 营 养 组 份 的 合 成 基 因 ，而 受 体 细 胞 本 身 不 能 合 成 这 一 营 养 组 份 ， 将 转 化 细 胞 涂 布 在 不 含 此 营 养组 份 的 培 养 基 上 ， 长 出 的 便 是 转 化 子 。 Lys Lys+ Lys Lys+基 本 原 理 图 示 ： 常 见 的 营 养 缺 陷 型 筛 选 标 记 ： 哺 乳 动 物 细 胞 中 存 在 两 条 dTTP的 合 成 途 径 ： 用 于 大 肠 杆 菌 的 营 养 标 记 基 因 常 选 用 色 氨 酸 生 物 合 成 基 因 trp+

7、用 于 高 等 哺 乳 动 物 细 胞 的 营 养 标 记 基 因 常 使 用 胸 腺 嘧 啶 核 苷 激 酶 基 因 tk，相 应 的 受 体 细 胞 则 选 择 tk-缺 陷 型 dCDP dTDP dTTPTR dTMP dTDP dTTPAPTK AP 氨 基 喋 呤TK 胸 腺 嘧 啶 核 苷 激 酶 显 色 模 型 筛 选 法基 本 原 理 ： 显 色 筛 选 法 可 以 区 分 转 化 子 与 非 转 化 子 ， 也 可 区 分 重 组 子 与 非重 组 子 。 其 原 理 是 ： 载 体 分 子 上 携 带 某 种 显 色 酶 基 因 ， 其 表 达 产 物能 使 细 胞 产

8、生 颜 色 反 应 ， 从 而 易 于 辨 认 和 挑 选 ， 如 大 肠 杆 菌 质 粒pUC18携 带 的 lacZ基 因 （ 蓝 色 反 应 ） 、 链 霉 菌 质 粒 pIJ702携 带 的melC基 因 （ 黑 色 反 应 ） 等 。 显 色 筛 选 法 的 基 本 操 作 ： pUC18Apr lacZ oriAp + X-gal重 组 子 （ Ap r + lacZ-） 将 外 源 基 因 克 隆 在 pUC18的lacZ标 记 基 因 内 部 ， 使 之 灭 活， 此 时 重 组 子 呈 Apr、 lacZ-， 淡黄 色 菌 落 ； 而 非 重 组 子 则 呈 Apr、 lac

9、Z+， 蓝 色 菌 落 噬 菌 斑 筛 选 法重 组 子 非 重 组 子1.取 代 型 载 体 噬 菌 斑 中 的 噬 菌 体 即 为 重 组 子 。2.插 入 型 载 体 根 据 载 体 上 的 标 记 基 因 筛 选 。 （ 如 ： lacZ） 基 于 克 隆 片 段 序 列 的 筛 选 与 鉴 定PCR鉴 定 法菌 落 原 位 杂 交 法限 制 性 酶 切 图 谱 法亚 克 隆 法 DNA序 列 测 定 法 PCR鉴 定 法 PCR技 术 的 两 大 主 要 用 途 为 目 的 基 因 的 获 得 和 DNA特 定 序 列 的 检 测 。 根 据 引 物 互 补 区 域 的 不 同 ，

10、PCR技 术 即 可 用 于 区 分 重 组 子 与 非 重 组 子 ， 也 能 鉴 定期 望 重 组 子 与 非 期 望 重 组 子 ， 甚 至 还 能 探 测 目 的基 因 或 DNA片 段 是 否 整 合 在 受 体 细 胞 的 基 因 组 上 。上 述 PCR鉴 定 程 序 一 般 需 要 将 筛 选 平 板 上 的 单 菌 落分 别 挑 出 进 一 步 培 养 ， 因 此 不 太 适 用 于 成 千 上 万个 转 化 子 的 鉴 定 。 转 化 子 重 组 子 非 期 望重 组 子 转 化 子 期 望 重 组 子期 望 重组 子 受 体 基 因 组 非 整 合 子 整 合 子 工 作

11、 原 理 ： 菌 落 原 位 杂 交 法 菌 落 原 位 杂 交 法 （ 又 称 探 针 原 位 杂 交 法 ） 能 从 成千 上 万 个 转 化 子 中 迅 速 检 测 出 期 望 重 组 子 ， 其 前提 条 件 是 必 须 拥 有 与 目 的 基 因 某 一 区 域 同 源 的 探针 序 列 。 根 据 核 酸 杂 交 原 理 ， 探 针 序 列 特 异 性 的杂 交 目 的 基 因 ， 并 通 过 放 射 性 同 位 素 或 荧 光 基 团进 行 定 位 检 测 。 原 位 杂 交 的 操 作 程 序 探 针 的 制 备 探 针 的 长 度 以 及 与 目 的 基 因 之 间 的 序

12、列 同 源 性 是 杂 交 实 验 成 败 的 关 键 最 佳 的 探 针 长 度 范 围 为 1001000bp 探 针 内 部 不 能 含 有 大 面 积 的 互 补 序 列 ， 会 直 接 影 响 探 针 与 DNA靶 序 列 的 杂 交 。探 针 的 获 取 方 法 ： 1、 目 的 基 因 的 同 源 序 列 2、 cDNA 3、 人 工 合 成 探 针 的 标 记 探 针 在 杂 交 后 是 通 过 其 分 子 中 的 放 射 性 同 位 素 或 荧 光 基 团 进 行 定 位示 踪 的 ， 放 射 性 的 强 弱 直 接 关 系 到 杂 交 反 应 的 灵 敏 度 。 单 位 长

13、 度 探 针 标 记 的 同 位 素 越 多 ， 杂 交 反 应 灵 敏 度 就 越 高 。探 针 标 记 方 法 ： 1、 5 端 标 记 法 。 2、 反 转 录 标 记 法 。 3、 缺 刻 前 移 标 记 。 4、 ABC标 记 法 。 5 端 标 记 法P PDTT、 Mg2+、-32PdATP、 过 量 ADPT4-PNP酶P P 方 法 1 P P碱 性 磷 酸 酶 P P 方 法 2T4-PNP酶变 性 制 备 单 链 探 针 缺 刻 前 移 标 记 法5 55 555 55 55 DNase IDNA聚 合 酶 IdNTP、 -32PdATP变 性 限 制 性 酶 切 图 谱

14、 法 所 谓 的 限 制 性 酶 切 图 谱 法 就 是 对 载 体 上 插 入 的 外 源DNA片 段 进 行 酶 切 图 谱 分 析 ， 并 以 此 与 目 的 基 因 的 已知 图 谱 对 比 ， 因 此 利 用 这 种 方 法 不 仅 能 区 分 重 组 子 与 非重 组 子 ， 而 且 还 能 鉴 定 目 的 重 组 子 。 但 这 种 方 法 在 用 于数 千 规 模 的 转 化 子 筛 选 时 ， 工 作 量 极 大 ， 实 验 成 本 也 高。 全 酶 解 图 谱 法 pUC18 2.7 kbHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoR

15、I AprlacZ oriB BE P4.0 kb1.0 kb 0.8 kb区 分 重 组 子 与 非 重 组 子电 泳 观 察 酶 解 产 物 片 段重 组 子 ： 2.7 kb + 4.0 kb非 重 组 子 ： 2.7 kb如 果 外 源 DNA片 段 也 是 2.7 kb， 最 好选 用 单 一 切 口 的 酶 将 质 粒 线 型 化 ， 然后 通 过 其 长 度 来 鉴 定 其 是 否 为 重 组 子 pUC18 2.7 kbHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI AprlacZ oriS SB P4.0 kb1.0 kb 0.8 k

16、b区 分 重 组 子 与 非 重 组 子如 果 外 源 DNA片 段 插 pUC18的 SphI位 点 处 ， 原 则 上 也 可用 SphI酶 解 鉴 定 ， 但 这 样 做很 不 经 济 ， 因 为 SphI非 常 昂贵 （ 每 100单 位 50美 元 ） 。 用HindIII和 EcoRI联 合 酶 解 同 样可 以 达 到 目 的 ， 但 这 两 种 酶的 价 格 只 及 SphI的 1 / 50 pUC18 2.7 kbHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI AprlacZ oriB BE P4.0 kb1.0 kb 0.8 kb区

17、 分 目 的 重 组 子 与 非 目 的 重 组 子用 EcoRI酶 切 转 化 子 质 粒 DNA目 的 重 组 子 ： 3.0 kb + 3.7 kb 或 者 ： 1.0 kb + 5.7 kb用 PstI酶 切 转 化 子 质 粒 DNA目 的 重 组 子 ： 3.2 kb + 3.5 kb 或 者 ： 0.8 kb + 5.9 kb pUC18 2.7 kbHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI AprlacZ oriB BE 4.0 kb2.0 kb 2.0 kb 区 分 目 的 重 组 子 与 非 目 的 重 组 子对 图 示 的

18、克 隆 片 段 ， 转 化 子质 粒 DNA用 EcoRI酶 切 开 后 ，只 出 现 2.0 kb和 2.7 kb两 条 带子 ， 实 际 上 2.0 kb的 条 带 中 含有 两 种 不 同 的 分 子 2.7 kb2.0 kb E 部 分 酶 解 图 谱 法 2.2 kbPstI EcoRI BamHIBBE 4.4 kb1.2 1.8 kb EB0.6 0.8 该 重 组 质 粒 经 酶 解 后 ， 分 别 得 到 下 列 几 组 数 据 ：BamHI全 酶 解 ： 0.6 0.8 1.8 3.4 kbBamHI+EcoRI全 酶 解 ： 0.6 0.8 1.8 1.2 2.2 kb其

19、 中 ， 1.2 kb片 段 的 存 在 表 明 该 片 段 位 于 一 端BamHI部 分 酶 解 ： 1.4 2.6 4.0 kb其 中 ， 1.4 kb的 片 段 必 为 0.6 kb和 0.8 kb两 片 段 ， 表明 两 者 是 连 在 一 起 的 ； 同 理 ， 2.6 kb的 片 段 必 为 0.8 kb和 1.8 kb两 片 段 ， 表 明 两 者 是 连 在 一 起 的 ； 最 后 ，4.0 kb的 片 段 必 为 0.6 kb和 3.4 kb两 片 段 ， 表 明 两 者是 连 在 一 起 的 DNA序 列 测 定 法 DNA序 列 测 定 是 精 确 鉴 定 目 的 基

20、因 的 重 要 手 段 ， 目 前 国 际 上 流 行 采用 Sanger发 明 的 双 脱 氧 末 端 终 止 法 测 定 DNA序 列 ， 其 工 作 原 理 是 在 DNA聚 合 反 应 的 进 程 中 ， 通 过 位 点 特 异 性 终 止 测 定 。DNA序 列 其 关 键 技 术 有 ：DNA链 聚 合 反 应 时 的 定 点 随 机 中 断 （ ddNTP） 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 的 高 分 辨 率 （ 600 bp / 601 bp）电 脑 自 动 检 测 、 记 录 、 编 辑 程 序用 于 DNA测 序 的 专 一 性 试 剂 盒 （ Kit） 双 脱 氧 末

21、 端 终 止 测 序 法 的 基 本 操 作 ： A C G T ssDNA ssDNA ssDNA ssDNA Primer Primer Primer Primer Klenow Klenow Klenow KlenowdNTPs dNTPs dNTPs dNTPsddATP ddCTP ddGTP ddTTP A G T C DNA聚 合 反 应 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电泳 双 脱 氧 末 端 终 止 测 序 法 的 基 本 反 应 ： Klenow OH 35 P TdNTP + ddATP TTTTT OH 35 P A G T C GGCATTGCGTTACTAGTCCAGT

22、ACA 基 于 外 源 基 因 表 达 产 物 的 筛 选 与鉴 定 蛋 白 质 生 物 功 能 检 测 法放 射 免 疫 原 位 检 测 法 蛋 白 凝 胶 电 泳 检 测 法 蛋 白 质 生 物 功 能 检 测 法 某 些 外 源 基 因 编 码 具 有 特 殊 生 物 功 能 的 酶 类 或 活 性 蛋白 （ 如 -淀 粉 酶 、 葡 聚 糖 内 切 酶 、 -葡 萄 糖 苷 酶 、 蛋 白酶 、 抗 生 素 抗 性 蛋 白 等 ） ， 设 计 简 单 灵 敏 的 平 板 模 型 ， 可以 迅 速 筛 选 出 克 隆 了 上 述 蛋 白 编 码 基 因 的 期 望 重 组 子 。 重 组

23、 子利 用 淀 粉 酶 基 因 表 达 产 物 检 测 重 组 子 放 射 免 疫 原 位 检 测 法 基 本 原 理 及 操 作 程 序 与 菌 落 原 位 杂 交法 非 常 相 似 ， 只 不 过 后 者 是 用 核 酸 探 针 通过 碱 基 互 补 的 形 式 特 异 性 杂 交 目 的 DNA序列 ， 而 前 者 利 用 抗 体 通 过 特 异 性 免 疫 反 应搜 寻 目 标 蛋 白 质 。 因 此 使 用 放 射 免 疫 原 位检 测 法 筛 选 鉴 定 期 望 重 组 子 的 前 提 条 件 是外 源 基 因 在 受 体 细 胞 中 必 须 表 达 出 具 有 正确 空 间 构 象 的 蛋 白 产 物 ， 同 时 具 备 与 之 对应 的 特 异 性 抗 体 。 蛋 白 凝 胶 电 泳 检 测 法 对 于 那 些 生 物 功 能 难 以 检 测 的 外 源 基 因 编 码产 物 ， 手 头 又 没 有 现 成 的 抗 体 做 蛋 白 免 疫 原 位 分析 实 验 ， 可 以 通 过 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 对 重 组 克隆 进 行 筛 选 鉴 定 。 表 达 产 物 非 重 组 子 重 组 子