肿瘤干细胞课件

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1、CYTOME:细胞组，包括细胞结构、亚细胞结构和细胞功能元件CYTOMICS:细胞组学，研究异质性细胞组的科学，特别是以生物信息学方法研究单细胞分子水平由基因、蛋白和环境引起的细胞异质性PROTEOME:蛋白组，指单个单位生命组分（细胞器、细胞、组织、器官乃至生命个体等）所有蛋白构成PROTEOMICS:蛋白组学，研究异质性生命组分蛋白组的科学，特别是由基因和环境引起的变化。干扰RNA（RNAi）信号传导蛋白（Cell Signalling）系统生物学系统生物学环境细胞组基因/蛋白组相互作用网络Cell-based71%Biochemical23%Uncertain6%Cell-based40

2、%Biochemical60%Past 5 yearsIn DevelopmentSource:Dr.Priya Kunapuli,Senior Research Scientist,Merck Research Laboratories;Dec.2002Key takeaways:Rapid movement to cell-based assays for contextual analysisGrowth in cell based assays-以细胞为目标以细胞为目标细胞组学研究的过去、现在和未来细胞组学研究的过去、现在和未来暗视野光镜，相差显微镜，微分干涉对比显微镜，偏振光显微镜，

3、荧光显微镜大体荧光成像系统细胞计数仪18世纪，明视野显微镜发明分光高度计，荧光高度计，干涉光高度计放射自显影?目标细胞分选 形态学研究工具的发展历程形态学研究工具的发展历程Simple optical microscopeBasic clinical scopeResearch grade fluorescence scopeHigh-end automated HCS systemsConfocal scanning system细胞定量工具发展历程细胞定量工具发展历程Simple cell counters&sizersAutomated Cell viability2-4 color c

4、ytometer simple assays5-6 color cytometer clinical/high-end res.6 color plus cytometer/sorter high-end res.Cell Lab QuantaCONFOCAL SUB-CELL OR STRUCTURE ORIENTED IMAGING 利用流式细胞仪(flow cytometer)通过检测荧光信号来检测细胞或其它颗粒性物质（表面或胞浆或胞核）的物理、化学特性并 通过这些特性对细胞或颗粒进行定量。&检测表面标记物&检测胞浆标记物&检测胞核内标记物&检测可溶性蛋白流式细胞术流式细胞术（FLOW

5、CYTOMETRY）流式细胞术应用基础知识流式细胞术应用基础知识1)认识荧光素2)抗原抗体结合的基础和特点3)对待测目标细胞标记物的理解应用的背景知识五光十色的荧光素五光十色的荧光素单分子荧光素耦合的复合荧光素分子新型的荧光素样荧光物质QdotsQdots-纳米晶体：未来的荧光素纳米晶体：未来的荧光素同一种光源激发一种晶体发射多种荧光Qdots 605的激发波长和发射波长（VERY SHARP）用荧光标记抗体抗体特异性地结合细胞上对应的抗原表达该抗原的细胞被标记上荧光；抗原表达多的细胞荧光强度强阳性细胞百分比或浓度靶蛋白浓度从模拟信号到从模拟信号到先进的数字化信号先进的数字化信号数字化信号转换

6、对数查表保证最优化的线性和稳定性对数查表保证最优化的线性和稳定性4次幂转换误差次幂转换误差 1%光纤通讯速度快速度快保真性高保真性高实时获取数据和分析报告结果实时获取数据和分析报告结果20比特的数据，补偿数字化全矩阵正反补偿全矩阵正反补偿 离线补偿离线补偿线性对对数查表线性对对数查表 VS 普通对数放大普通对数放大 让目标细胞让目标细胞特异性特异性带上荧光！带上荧光！1)抗原抗体结合2)荧光素特异性结合&细胞器&生物大分子3)生物大分子之间的结合，如 PS 与ANNEXIN V的结合抗原抗体结合非特异性因素抗原抗体结合非特异性因素抗体的交叉反应所以最好选用单克隆抗体FC受体与Fc段的结合其它因

7、素例如：IgG-CH3与单核细胞上FcR结合；IgE-CH4与肥大细胞上FcR结合IgG1,IgG2 and IgG4IgG3从模拟信号到从模拟信号到先进的数字化信号先进的数字化信号数字化信号转换对数查表保证最优化的线性和稳定性对数查表保证最优化的线性和稳定性4次幂转换误差次幂转换误差 1%光纤通讯速度快速度快保真性高保真性高实时获取数据和分析报告结果实时获取数据和分析报告结果20比特的数据，补偿数字化全矩阵正反补偿全矩阵正反补偿 离线补偿离线补偿线性对对数查表线性对对数查表 VS 普通对数放大普通对数放大 抗原抗体结合的特异性抗原抗体结合的特异性 血液系统各系列细胞分化阶段抗原表达T T细胞

8、分化发育与膜表面分子的表达：细胞分化发育与膜表面分子的表达：胚胎肝脏、骨髓胚胎肝脏、骨髓阴性阴性选择选择胸胸腺腺浅皮质区浅皮质区深皮质区深皮质区髓髓 质质 区区 CD4+CD8-CD4-CD8+CD4-CD8-4-8-4-8-阳性阳性选择选择原原T细胞细胞CD3-CD4-/CD8-CD3+/+CD4-/CD8-CD3+/+CD4+/CD8+8+4+4+8+4+8+抗己抗己抗己抗己MHCIIMHCICD抗原及其相关细胞群抗原及其相关细胞群 细胞群 CD抗原 T细胞 CD2 CD3 CD4 CD5 CD7 CD8 CD28 CD38 B细胞 CD10 CD19 CD20-CD24 CD37 CD7

9、2-CD75 髓系细胞 CD13 CD14 CD15-CD17 CD33 CD34 CD35 NK细胞 CD16 CD56 CD57 CD94 血小板 CD31 CD41 CD42a CD42b CD61 CD62p CD63 激活抗原 CD26 CD30 CD69 CD95-CD97 粘附分子 CD11a-c CD18 CD29 CD44 CD49a-f 内皮细胞 CD105 CD106 CD109细胞因子受体 CD25 CD115 CD117 CD122 CD126流式细胞仪的主要特点流式细胞仪的主要特点u高速测定细胞，大样本计数高速测定细胞，大样本计数u检测稀有细胞检测稀有细胞u多参数分

10、析多参数分析u自动化自动化u细胞分选细胞分选流式细胞仪工作原理流式细胞仪工作原理 基本原理基本原理流路流动室 鞘液SHEATH 样本流SAMPLE 单细胞悬液5*1051*106个/ml光路光源滤片光电倍增管PMT HV电路放大电路HV及GAIN 增益A/D转换统计 计算机 单细胞悬液 大多数仪器是在50-300 m 大小的孔径中,将细胞悬液 注射进入鞘液中 这一过程,成为流体动力学聚焦流路流路流动室流动室Injector TipFluorescencesignalsFocused laserbeamSheath fluid流式细胞仪光路图流式细胞仪光路图Air-cooled Argon Io

11、n LaserBeam Shaping LensesHigh SensitivityQuartz Flow CellForward ScatterDetectorSide ScatterDetector525BP FL1(FITC)575BP FL2(PE)620BP FL3(ECD)675BP FL4(PC5)488DL488BK550DL600DL645DL -单激光激发四色荧光标准模式 确保在同一个细胞上获得最多的信息单激光激发四色单激光激发四色光路光路光路光路-滤片特性滤片特性滤片特性滤片特性 长通滤片 允许长于设定波长的光通过 短通滤片 允许短于设定波长的光通过 带通滤片 允许一定带

12、宽的波长通过当以 45o 角放置滤片时,该滤片可以通过一定波长的光,同时也可以阻断并折射该波长以下的光，这种方式的滤片称为二向色性滤片(dichroic filter)630 nm BandPass FilterWhite Light Source散射光信号散射光信号 细胞大小及颗粒性细胞大小及颗粒性FSSS信号信号散射光信号 FS 细胞大小 SS 细胞颗粒性荧光信号 FL1 FITC FL2 PE FL3 ECD FL4 PC5 FL5-PC7荧光信号荧光信号原理：细胞表面的抗原(或细胞膜受体)与相关的荧光抗体结合，形成带有荧光的抗原抗体复合物。通过流式细胞仪测定其荧光量，即可得到细胞群的不

13、同抗原位点表达情况。电压调节利用同型对照：设置背景电压调节利用同型对照：设置背景 电压电压 volts 增益增益 Gain设定阴性和阳性信号强度的设定阴性和阳性信号强度的临界点临界点荧光补偿荧光补偿 Need to do when we measure signals from more than 1 fluorescence.FITC520BP520 BPE575BP4 Color Single Laser(488nm)FITC/PE/ECD/PC5荧光检测通道1荧光检测通道2荧光检测通道3荧光检测通道4荧光检测通道5荧光交叉对光路的影响荧光交叉对光路的影响补偿补偿PEFITCPE+cell

14、sFITC+cellsTo do colour compensation:For Pure FITC+cells,=PE signal -%FITC signalFor Pure PE+cells,=FITC signal-%PE signalAfter compensationPEFITCPE+cellsFITC+cellsGOOD compensation:Y-mean of the FITC cell=the Y-mean of -/-cellsX-mean of the PE cell=the X-mean of-/-cellsPEFITCPE+cellsFITC+cellsOVER

15、compensationBeckmancoulterBeckmancoulter-应用最精确的全矩阵软件应用最精确的全矩阵软件 利用软件进行全矩阵颜色补偿（任何两个荧光利用软件进行全矩阵颜色补偿（任何两个荧光检测通道之间都可以进行补偿）检测通道之间都可以进行补偿）检测的一般步骤检测的一般步骤设置检测方案（PROTOCOL)染色标本（同型对照，补偿管，检测抗体）同型对照管调电压电压不变，补偿管调补偿电压不变，补偿不变，上检测管检测后直接阅读结果如何看图如何看图流式细胞分选流式细胞分选流式细胞仪分选u电荷式分选是当前的主流分选电荷式分选是当前的主流分选模式模式u高速分选是保证结果的基本条高速分选是

16、保证结果的基本条件件u高纯度和高活性是分选的基本高纯度和高活性是分选的基本要求要求u可选的激光要多样化（空冷、可选的激光要多样化（空冷、水冷、固体；不同的波长；真水冷、固体；不同的波长；真正的紫外）正的紫外）u提供多种分选流动室提供多种分选流动室u光路稳定，紫外激光功率大光路稳定，紫外激光功率大u流式分选和磁珠分选的差别和流式分选和磁珠分选的差别和联系联系uBECKMAN COULTER提供工业提供工业标准的大型分选机型标准的大型分选机型Epics ALTRA:能满足绝大多数的分选需能满足绝大多数的分选需求求uBD的的FACSVantage：只提供水冷：只提供水冷激光和激光和JIA流动室，光路

17、不稳定，流动室，光路不稳定，不方便检测，分选成本高不方便检测，分选成本高uBD的的FACSAria：是一种过渡机：是一种过渡机型，只能提供空冷激光和石英流型，只能提供空冷激光和石英流动室，不适用于大功率分选和活动室，不适用于大功率分选和活细胞分选细胞分选uCytomation的的Moflow是最经典的是最经典的流式分选机，仅供应少量实验室，流式分选机，仅供应少量实验室，操作和人为干涉复杂，在中国无操作和人为干涉复杂，在中国无维修和售后服务，价格昂贵维修和售后服务，价格昂贵电荷式流式细胞仪分选系统488 nm laser+-Charged PlatesSingle cells sortedint

18、o test tubesFALS SensorFluorescence detector流式细胞仪应用流式细胞仪应用CELLS OF THE IMMUNE RESPONSECELLS OF THE IMMUNE RESPONSE INNATE INNATE PMN NUETROPHILS EOSINOPHILS BASOPHILS MONOCYTES/MACROPHAGES DENDRITIC CELLS:mDC-pDC NK CELLS NKT CELLS gd T LYMPHOCYTES CD5+B CELLS ADAPTIVEADAPTIVE B CELLS HELPER T-CELLS

19、Th1Th2 REGULATORY T-CELLS (Th3)CYTOTOXIC T-CELLS细胞免疫功能测定细胞免疫功能测定淋巴细胞亚群活化的T淋巴细胞抗原特异性免疫细胞调控性T细胞树突状细胞先天免疫细胞淋巴细胞亚群淋巴细胞亚群T淋巴细胞淋巴细胞(CD3+)名名 称称功功 能能CD3+CD4+CD3+CD4+辅助性/诱导性T细胞(Th/Ti)辅助和诱导细胞免疫和体液免疫 CD3+CD4+CD29+CD3+CD4+CD29-辅助性T细胞(Th)诱导性T细胞(Ti)辅助细胞免疫和体液免疫诱导细胞免疫和体液免疫CD3+CD8+CD3+CD8+抑制性/杀伤性T细胞(Ts/Tc)抑制免疫反应/杀伤异

20、源细胞 CD3+CD8+CD28-CD3+CD4+CD29-抑制性T细胞(Ts)杀伤性T细胞(Tc)抑制细胞和体液免疫细胞毒性T细胞CD3+CD4+CD8+活化的T细胞在T细胞恶性增生时升高 CD3+CD4-CD8-有调节功能的T细胞,其表达/T细胞受体(TCR/)CD4+/CD8+CD4+/CD8+比值比值比值比值CD45RA+CD45RO-幼稚的/静止的T淋巴细胞 当免疫系统没有能力更新辅助性或抑制性/细胞毒性淋巴细胞的祖细胞时此细胞亚群较低 CD45RA-CD45RO+记忆性T淋巴细胞 病菌感染时升高,但在慢性病毒感染,如HIV患者中降低CD45RA+CD45RO+活化的T细胞,感染时升

21、高 感染时升高淋巴细胞亚群淋巴细胞亚群活化活化T淋巴细胞淋巴细胞名名 称称功功 能能CD3+HLA-DR+活化T细胞CD4+HLA-DR+活化的辅助性/诱导性T细胞CD8+HLA-DR+活化的抑制性/杀伤性T细胞CD4+CD25+活化的辅助性/诱导性T细胞CD8+CD25+CD8+CD38+HLA-DR+活化的抑制性/杀伤性T细胞在病毒感染的患者中增加;其增加意味着HIV患者的预后较差B B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞(19+)(19+)CD19+CD23+活化的B细胞过敏患者中升高 CD19+CD5+在自身免疫性疾病中升高 CD19+CD5+CD23+慢性B细胞白血病及单克隆B淋巴细胞

22、NKNK细胞细胞细胞细胞CD3+CD(16+56)+CD3+CD(16+56)+自身免疫性疾病时降低,而病毒感染时升高 CD3+CD57+CMV(巨细胞病毒)感染的强烈征兆 根据根据T T淋巴细胞分泌细胞因子的不同还可将淋巴细胞分泌细胞因子的不同还可将CD4+CD4+、CD8+CD8+分为分为 CD4+:T h1:CD4+IFNr+Th2:CD4+IL4+Th0:CD4+IFNr+IL4+CD8+:Tc1:CD8+IFNr+Tc2:CD8+IL4+Tc0:CD8+IFNr+IL4+Th1Th2细胞因子分泌细胞测定根据产生的细胞因子的类型和生物学功能,人的4+细胞可以分为1、21细胞产生 2、1

23、2、等细胞因子,主要参与细胞介导的免疫反应、迟发性过敏反应,并在清除病毒等细胞内致病因子方面起着重要作用2细胞分泌 4、5、6、10、13等细胞因子,主要促进体液免疫反应,中和胞外病原体相应地，CD8+T细胞也可以分为Tc1和Tc2Th1细胞：介导细胞免疫、细胞毒性T细胞的生长和活化、巨噬细胞的活化、介导迟发型过敏反应。其功能亢进将导致炎症慢性迁延，器官特异性自身免疫病，急性排异反应和接触性皮炎等的发病和免疫病理损伤。Th2细胞：介导体液免疫，促进B细胞的生长、活化和分化，是IgG1和IgE类抗体的转换因子，其功能亢进将导致特异性过敏反应，参与高IgE综合症和嗜酸性粒细胞增多症。淋巴细胞亚群数

24、量检查项目和意义淋巴细胞亚群数量检查项目和意义疾病CD3CD4CD8CD4/CD8NK自身免疫病降低增高降低降低AIDS降低严重降低增高降低SARS降低降低降低降低降低慢性活动性肝炎、肝硬化降低正常或增高降低降低肿瘤降低降低增高降低降低抗原特异性T细胞分析四聚体（tetramer)染色细胞因子分泌试验ELISPOTCytokine Secretion AssayTETRAMER抗原递呈细胞（抗原递呈细胞（APC）携带抗原片段通过与）携带抗原片段通过与TCR复合物结合，在复合物结合，在APC和和T细胞的细胞的MHC相容和其它共刺激分子的相互作用下激活相容和其它共刺激分子的相互作用下激活T细胞细胞

25、并产生细胞免疫效应。并产生细胞免疫效应。MHC-四聚体染色技术用于抗原特异性四聚体染色技术用于抗原特异性T细胞细胞分析的原理在于体外模仿上述抗原递呈的过程来实现对特异性分析的原理在于体外模仿上述抗原递呈的过程来实现对特异性T细胞细胞的鉴定，通过流式细胞仪这种高通量分析仪器对标本中这群细胞进的鉴定，通过流式细胞仪这种高通量分析仪器对标本中这群细胞进行分析行分析 四聚体技术的优势是：可以对特异性免疫细胞进行定量；用流式细四聚体技术的优势是：可以对特异性免疫细胞进行定量；用流式细胞仪检测可以快速测定大量细胞，可以同时进行其它表面染色，可胞仪检测可以快速测定大量细胞，可以同时进行其它表面染色，可以直接

26、用外周血测定而不需要培养；四聚体染色不会杀伤细胞，因以直接用外周血测定而不需要培养；四聚体染色不会杀伤细胞，因此染色后的细胞可以进行分选或其它功能分析；四聚体对所有的特此染色后的细胞可以进行分选或其它功能分析；四聚体对所有的特异性异性T细胞都能够结合，而不仅仅是对有功能的细胞进行检测。细胞都能够结合，而不仅仅是对有功能的细胞进行检测。不同厂家的不同厂家的MHC四聚体产品不太一样：贝克曼库尔特公司创造性地四聚体产品不太一样：贝克曼库尔特公司创造性地构建和表达了构建和表达了MHC分子分子3链的区域突变的蛋白（链的区域突变的蛋白（iTAg），能降低其），能降低其与非特异性与非特异性T细胞结合，大大提

27、高了特异性。并且将细胞结合，大大提高了特异性。并且将MHC四聚体直四聚体直接标记荧光，和常用的抗原多肽负载后整体商品化，也有单独的接标记荧光，和常用的抗原多肽负载后整体商品化，也有单独的MHC分子（分子（iTAg）单独出售，极大方便了研究者）单独出售，极大方便了研究者 Beckman Coulter已经有的产品传染性疾病相关：传染性疾病相关：HIV gag SLYNTVATL HLA-A*0201HIV pol ILKEPVHGV HLA-A*0201CMV PP65 NLVPMVATV HLA-A*0201EBV GLCTLVAML HLA-A*0201EBV GLCTLVAML HLA-A

28、*0201Influenza M1 GILGFVFTL HLA-A*0201HBV core FLPSDFFPSV HLA-A*0201肿瘤性疾病相关：肿瘤性疾病相关：Mart1 ELAGIGILTV HLA-A*0201Gp 100 IMDQVPFSV HLA-A*0201Gp 100 ITDQVPFSV HLA-A*0201Her-2/neu KIFGSLAFL HLA-A*0201Her-2/neu RLLQETELV HLA-A*0201PR-1 VLQELNVTV HLA-A*0201Tyrosinase YMDGTMSQV HLA-A*0201 抗原决定簇分析的科学平台iTopia

29、 Epitope Discovery System 在目前主要以数据库为基础的理论性分析抗原决定簇的基础上，iTopia技术平台为研究者研究免疫的发生发展、疫苗的研制和免疫学检测提供了一个科学合理的解决方案 活化的淋巴细胞分泌细胞因子检测TH1类细胞因子:与细胞免疫有关TH2类细胞因子:与体液免疫有关TH17类细胞因子:与炎症反应有关PMA,IONOMYCIN,BFA处理后全血染色分析IFN-GAMMA抗原特异性CD8 T细胞检测检测HBV核心抗原(8AA)特异性CD8 T细胞新现象?待进一步阐明 TETRAMER结合后对CD3,CD8位点的结合是否有影响?观察到CD3,CD8弱阳性一群细胞,

30、TER阳性理论支持TETRAMER+CD8竞争位点TETRAMER+CD3竞争位点ELISPOTELISPOT的优势是非常敏感（流式细胞仪检测的极限是10*-6,ELISPOT的极限可以到10*-8)ELISPOT的缺点是计数麻烦，并且不能限定细胞因子是由哪一类细胞分泌的Cytokine Secretion Assay 非常新的思路CD4CD25 Treg调控性T细胞的主要功能是抑制机体免疫功能，太强则免疫耐受，太弱会引起自身免疫反应调控性T细胞调节抗原递呈细胞对抗原的递呈调控性T细胞的表型是CD4+CD25bright，逐渐发现越来越多的其它分子可能能够更精确限定（eg.FOX-P3)CD2

31、5也是免疫细胞晚期活化的标记，但表达的平均荧光强度不足够强树突状细胞分析（Dendritic Cells,DC)DC是主要的抗原递呈细胞，同时又是重要的先天免疫细胞，还是具有免疫调控功能的一个细胞群，没有发现特异性的抗原标记DC研究的主要内容包括直接分析计数、体外诱导检测,一般分为两群PDC,MDC当前DC检测的方法：1）Lin-,CD11c,CD123,同时可能表达CD80,CD86,CD83,DR等2）利用BDCA1,2,3,4对外周血或其它组织DC进行分析3）CD14+16/CD85/CD33,CD14+16/CD85/CD1233 contexts for DC DISCOVERYPe

32、ripheral blood DCDC in tissuesDC generated in vitroFLOW CYTOMETRY两群树突状细胞MDC/PDC新的DC细胞群Regulatory DC :Regulatory DC与传统DC不同，不递呈抗原，不激活T细胞主要存在与二级淋巴组织，发挥与传统DC相反的作用与淋巴组织的微环境相互作用，调节DC的功能非特异性的先天免疫细胞细胞:占外周血T细胞的10以下，非抗原依赖型免疫细胞，在传染病、肿瘤病人外周血数量增加，表达CD3量较普通T细胞多NK细胞：占外周血淋巴细胞825，传染病和肿瘤病人数量偏低。NK细胞可以根据NKR的不同而分类，丙型肝炎的

33、发生和预后可能与NK细胞的表型相关DC：分布与淋巴组织和外周血，为非成熟状态，遇到相应的抗原后主要分泌IFN-alpha来发挥左右受体与疾病关系受体与疾病关系趋化因子受体CCR5与HIV易感性干细胞研究干细胞研究造血系统干细胞肿瘤干细胞间充质干细胞神经干细胞脂肪干细胞热门研究间充质干细胞热门研究间充质干细胞非造血系统细胞的主要来源共同的祖先在不同的培养诱导条件下能分化为不同的系列细胞或组织无特异性标记，天然数量稀少最好用流式细胞仪的多参数分析方法来分析表达的抗原包括间质细胞,内皮细胞,表皮细胞的标志:1)粘附分子类:CD102,CD56,CD54,CD166等,无CD62P;2)生长因子和细胞

34、因子受体类:CD121-126等,无CD25;3)整合素分子类:CD49,CD29等,无CD11;4)其它分子类:CD105,CD90,CD73等,无CD34,CD45,CD80,CD86.CD34 ISHAGE Single Plateform 热门研究（肿瘤）干细胞热门研究（肿瘤）干细胞肿瘤组织无限制的增殖在于肿瘤干细胞的存在目前研究的肿瘤干细胞来源于前列腺、乳腺等肿瘤肿瘤干细胞数量稀少，常规方法很难检测目前研究发现，肿瘤干细胞和正常细胞在HOECHEST33342染料摄取方面有重大差别因此流式细胞仪是分析和检测肿瘤干细胞的重要工具肿瘤干细胞中的研究应用肿瘤干细胞中的研究应用-Hoechs

35、t 33342 side population-Hoechst 33342 side population干细胞能表达ABCG2泵蛋白，在HOECHST33342染色时能将该染料泵出，因此分析不能被该染料染色的细胞群时可以发现一群不能染色的细胞既是干细胞，因此能够在众多肿瘤细胞中区分出肿瘤干细胞。QUANTA检测SP结果SIDE POPULATION检测指南检测指南波长为355nm的超过50mw的紫外激光;488BPand488DLforSSC608LPHoechst-red515SPHoechst-blue非常关键的染色步骤-Goodell,M.,et al.(1996)J Exp Med

36、183,1797-806 ALTRA检测SP结果细胞凋亡和细胞周期检测细胞凋亡和细胞周期检测细胞凋亡研究细胞凋亡研究 1.鉴别凋亡与坏死鉴别凋亡与坏死:Annexin/PI2.测定凋亡率测定凋亡率:Annexin、Apo 27、TUNEL3.研究凋亡触发机制：研究凋亡触发机制：Caspase、Fas及及FasL bcl-2/bax4.多参数分析凋亡是趋势分析凋亡是趋势细胞膜非对称性和通透性检测细胞膜非对称性和通透性检测 细胞周期分析细胞周期分析:在细胞周期在细胞周期(G0(G0，G1G1，S S，G2 G2，M)M)的各个时期，的各个时期，DNADNA的的含量随各时相呈现出周期性的变化。含量随

37、各时相呈现出周期性的变化。通过核酸染料标记通过核酸染料标记DNADNA，并由流式细，并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出时期的分布状态，计算出G0/G1%G0/G1%，S%S%及及G2/M%G2/M%。了解细胞的周期分布及。了解细胞的周期分布及细胞的增殖活性。也可利用细胞周细胞的增殖活性。也可利用细胞周期蛋白（期蛋白（CYCLINCYCLIN）、）、Ki67Ki67、核增殖、核增殖抗原（抗原（PCNAPCNA）等，对细胞周期进行）等，对细胞周期进行精确的分期：精确的分期：G0G0、G1G1、S S、G2G2、M.M.DNA含量及细胞周期分

38、析含量及细胞周期分析Normal Cell Cycle 细胞增值和凋亡检测CFSE检测细胞增值Regulatory proteins(bax/bcl-2 family,p53)Forward and side scatterDye uptake(YO-PRO-1+PI)Membrane inversion(Annexin V)Loss of mitochondrial membrane potential(DiOC6)Caspase activation(Ab)DNA strand break(TUNEL,Sub G1)M4M5M6M7T-allB-ALL常见白血病CD45设门、FS/SS设门

39、分群比较M2M3CD45/SSCCD45/SSC辅助设门的辅助设门的原理原理 CD45CD45是是所所有有白白细细胞胞的的抗抗原原，CD45CD45表表达达量量在在成成熟熟淋淋巴巴细细胞胞最最高高，单单核核细细胞胞、粒粒细细胞胞、早早期期造造血血细细胞胞依依次次减减弱弱。红红细细胞胞(中中、晚晚幼幼红红细细胞胞、成成熟熟红红细细胞胞)不不表表达达 CD45CD45。侧侧向向角角光光散散射射(SSC)(SSC)反反映映细细胞胞的的颗颗粒粒性性，成成熟熟粒粒细细胞胞 SSCSSC最最高高，依依次次为为单单核核细细胞胞、淋淋巴巴细细胞胞、早早期期造造血血细细胞胞、红红细细胞胞。以以 CD45CD45

40、SSCSSC典典型型图图即即可可获获得得初初步步印印象象。若若同同时时加加上上一一个个或或二二个个以以上上其其它它单单抗抗进进行行二二、三三色色甚甚至至四四色色分分析析，则则很很容容易易识识别别非非正正常常细细胞胞群群的的表表型型，并并排排除除正正常常细细胞胞的的干干扰扰，当标本中幼稚细胞低于当标本中幼稚细胞低于5050或检测残存白细胞时尤为必要。或检测残存白细胞时尤为必要。贝克曼库尔特公司贝克曼库尔特公司BBA试剂试剂能同时检测能同时检测10种细胞因子种细胞因子*Human Th1/Th2 Cytokine I KitFL2(Reporter Parameter)FL4(Differenti

41、ator Parameter)Comparison of FlowCytomix and ELISA Standard RangesFlowCytomix Correlation with ELISAs采用的是夹心免疫分析方法，捕捉抗体包被在微球上微球:直径直径4.4 和和5.5 m 的两种聚乙的两种聚乙烯小球小球抗体通抗体通过羧基与微球基与微球连接接检测不同指标的微球其内部荧光或大小不同ELISA的原理.Microsphere技技术原理原理Kit ConfigurationsKit TypesSimplex KitsMultiplex Kits(up to 10)Basic KitsSpec

42、ies/ApplicationHuman Th1/Th2Human Cardio-VascularMouse Th1/Th2Rat CytokineHuman Adhesion Main MenuKit ConfigurationsSimplex Kits:Contain reagents for the detection of one individual cytokineUser may combine Simplex kits for custom assay*Basic Kit required Multiplex Kits:Contain reagents for the dete

43、ction of up to 10 analytes per sample simultaneously Common Sample TypesSerumPlasmaCell culture supernatantsWhole BloodMain MenuProduct CharacteristicsMain MenuSimplex KitsIFN-gIL-8sVCAM-1IFN-gIL-5IL-1bIL-10t-PAGM-CSFIL-6IL-2IL-12p70sP-selectinIL-1aIL-10IL-4TNF-asCD40LIL-2IL-17IL-5TNF-bMCP-1IL-4TNF-

44、aIL-6Up to 10 Simplex Kits can be combined Except for Simplex kits with identical bead populationsHuman AnalytesMouse AnalytesFlowCytomix Multiplex KitsHuman Th1/Th2 10 plexTh1/Th2 Cytokines Multiplex Kit I(IFN-,IL-1b,IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-8,IL-10,TNF-a,TNF-b)Th1/Th2 Cytokines Multiplex Kit II(IFN-

45、,IL-1b,IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-8,IL-10,IL-12p70,TNF-a)Human Cardiovascular 7 plex(sCD40L,IL-6,IL-8,MCP-1,sP-selectin,t-PA,sVCAM-1)Mouse Th1/Th2 10plex(GM-CSF,IFN-,IL-1a,IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-10,IL-17,TNF-a)Human Adhesion 6 Plex(sE-selectin,sICAM-1,sICAM-3,sPECAM-1,sP-selection,sVCAM-1)Rat Cytokine 6

46、 plex(rGM-CSF,rIFN-g,rIL-1a,rIL-4,rMCP-1,rTNF-a)Cardiovascular 7-plex:DetailsHuman Cardiovascular 7-plex(sCD40L,IL-6,IL-8,MCP-1,sP-selectin,t-PA,sVCAM-1)These analytes are useful in cardiovascular research as well as the study of immune disorders.sCD40L a unique antibody used in the study of cardiov

47、ascular anomalies and immune disorders.Elevated levels have been found in research studies.sP-selectin-released by activated platelets and is an indicator of the number of platelets in blood.MCP-1-induces mononuclear cell infiltration.Elevated levels have also been found in cardiovascular research s

48、tudies.t-PA is used to study the development of cardiovascular abnormalities.VCAM-1-elevated expression may be useful in cardiovascular research.IL-6&IL-8 used as a marker in the study of cardiovascular anomalies.Main MenuHuman Th1/Th2 Standard:10,000 pg/ml流式细胞仪对细胞结构的分析神经元细胞融合检测神经元细胞融合检测利用DIL,DIO对神经

49、元细胞进行染色观察和流式检测流式细胞仪在化工药物筛选和安全评价中的应用主要有：流式细胞仪在化工药物筛选和安全评价中的应用主要有：1)药物对细胞增殖的作用监测；2)药物对细胞诱导凋亡和促进细胞死亡能力的评估；3)药物对细胞周期影响效果测定；4)药物对正常细胞和病理靶细胞选择性作用效果验证；5)药物对细胞活动关键靶蛋白升高或降低表达的影响；6)药物对细胞信号传导途径的影响效果观察；7)药物在提高免疫功能作用评估中对免疫细胞数量的监测，如T细胞（CD3,CD4,CD8,gammadelta TCR），NK细胞（CD3CD56）,B细胞（CD3CD19）等；8)药物在提高免疫功能作用评估中对活性的免疫

50、细胞的监测，如活化的T,B,NK细胞（表达CD25,CD69,HLA-DR等）；9)药物对其它免疫细胞的促进作用，如抗原递呈细胞（树突状细胞，DC）,调控性T细胞（CD4CD25FOX-P3）；10)药物对细胞免疫和体液免疫平衡的影响效果评估（检测Th1Th2细胞因子等）。流式细胞术在生物医学研究的新方向流式细胞术在生物医学研究的新方向u细胞多态性分析：受体、抗原折叠、HLA等，包括CXCR4,CCR5,DC-SIGN(与AIDS易感性有关），NKRu重要分子的进一步分析，如粘附分子（物种间高度保守，与细胞间通讯，干细胞HOMING，肿瘤的发生，细胞分化成熟等）u信号传导（实际主要为胞浆内磷酸化及去磷酸化蛋白的检测）u新型荧光特异性探针：胞内病原体检测、转录因子检测、细胞器或细胞生命活动指标的新荧光素的应用u利用分选的细胞进行体内和体外功能研究u与其它定位性的荧光设备联合使用（如MPE,CONFOCAL,IC200等）