动物细胞培养的准备

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1、第三章细胞培养的准备工作 玻 璃 器 皿 金 属 器 械 橡 胶 塑 料 制 品 玻璃器皿的清洗 浸 泡 （ 自 来 水 ） 刷洗 （ 洗 衣 粉 ） 酸 泡 （ 24小 时 ） 自来 水 冲 洗 蒸 溜 水 浸 泡 和 冲 洗 50烘 干 橡胶、塑料制品的清洗 清 水 清 洗 浸 于自 来 水 过 夜 用 纱 布 或 棉 签 和 50 稀 洗液 刷 洗 流 水 冲 洗 （ 15 20遍 ） 晾干 浸 于 清 洁 液 15分 钟 流 水 冲 洗 （ 15 20遍 ） 蒸 馏 水 浸 洗 三 次 ， 三 蒸 水泡 24小 时 晾 干 或 50 烘 干 备 用 。 金属器械的清洗 放 到 含 洗

2、涤 剂 的 水 中 反复 刷 洗 后 自 来 水 反 复 冲 洗 干 净 晾 干 用 75 酒 精 擦 拭 自 来 水 反 复 冲 洗 干净 最 后 三 蒸 水 浸 洗 3次 ， 晾 干 或 50烘 干 备 用 。 正压除菌滤器的清洗 含 稀 洗 涤 剂 的水 中 ， 反 复 刷 洗 后 流 水 冲 洗 15min 漓 水 蒸 馏 水 浸 泡 24h 三 蒸 水 浸 泡24h 晾 干 或 50 烘 干 备 用 。 塑 料 器 材常 用 的 塑 料 器 材 有 多 孔 培 养 板 （ 4孔 、 6孔 、 12孔 、 24孔 、 96孔 ） 、 培 养 皿 、 培养 瓶 及 吸 头 。重 复 使

3、用 的 处 理 步 骤 ： 自 来 水 刷 洗 3 HCl或 2 NaOH溶 液 浸 泡 过 夜 自 来 水 充 分 冲 洗 双 蒸 水 冲 洗 3次 紫 外 线 直 接 照 射 或 辐 照 灭 菌 清 洗 时 应 注 意 ： 浸 泡 、 煮 沸 、 酸 泡 的器 皿 内 要 充 满 液 体 ， 不 得 有 气 泡 。 冲洗 时 要 流 水 振 荡 冲 洗 ， 方 法 是 ： 每 瓶 灌2/3容 积 的 自 来 水 ， 振 荡 后 倒 掉 ， 重 复15-20次 。 煮 沸 前 水 面 要 高 于 器 材 5厘米 ， 水 沸 后 投 入 洗 涤 剂 配 制 时 先 在 容 器 中 加 入 蒸

4、馏 水 ， 加 热 溶 解 重 铬酸 钾 ， 再 将 容 器 置 流 动 自 来 水 中 ， 待 重 铬 酸 钾液 冷 却 后 ， 缓 慢 加 入 浓 硫 酸 ， 边 加 边 搅 拌 。重 铬 酸 钾（ 克 ） 浓 硫 酸 （ 毫升 ） 蒸 馏 水 （ 毫升 ）弱 液 100 100 1000次 强 液 120 200 1000 强 液 63 1000 200组成强度 包 装 材 料 ： 牛 皮 纸 硫 酸 纸 铝 箔 纱 布 金 属 消 毒 桶 铝 质 饭 盒方 式 ： 全 包 装 局 部 包 装 包 装 时 应 注 意 ： 手 指 与 器 材 接 触 面 积 要小 ， 手 指 不 能 触

5、及 器 材 的 使 用 端 ； 封 闭器 材 使 用 端 ， 标 记 器 材 手 持 端 ； 小 包 装 ；玻 璃 管 道 口 （ 尖 吸 管 、 移 液 管 手 持 端 等 ）加 棉 花 。 消 毒 灭 菌 方 法清 除 或 杀 灭 物 品 上 的 一 切 微 生 物 , 以 杀 灭芽 孢 为 准 物 理 法 1： 紫 外 线 消 毒 紫 外 线 直 接 照 射 消 毒 是 各 实 验 室 常 用 的 方 法 ； 主 要 用 于 培 养 室 空 气 、 操 作 台 、 塑 料 培 养 皿和 培 养 板 等 表 面 消 毒 。 紫 外 线 消 毒 时 产 生 臭 氧 ， 对 身 体 有 害 ，

6、 故 紫外 线 消 毒 停 止 后 30分 钟 才 可 入 室 工 作 。 目 前 有 的 实 验 室 采 用 电 子 灭 菌 灯 代 替 紫 外 灯进 行 空 气 消 毒 。 紫 外 线 消 毒 法 是 利 用 紫 外 线 照 射 ， 使 菌体 蛋 白 发 生 光 解 、 变 性 ， 菌 体 内 的 核 酸 、酶 遭 到 破 坏 而 死 亡 的 一 种 消 毒 方 法 。 紫外 线 的 杀 菌 力 与 其 波 长 密 切 相 关 ， 最 佳杀 菌 波 长 为 250-270nm. 光 照 消 毒 法 主 要 利 用 紫 外 线 照 射 ， 使 菌体 蛋 白 发 生 光 解 变 性 而 导 致

7、 细 菌 死 亡 ，常 用 方 法 有 ： 日 光 曝 晒 消 毒 法 日 光曝 晒 法 用 于 枕 头 、 床 褥 、 床 垫 、 棉 絮 等的 消 毒 ， 一 般 曝 晒 6 h可 达 到 消 毒 ， 曝晒 时 2 h翻 面 一 次 紫 外 线 消 毒 法 紫 外线 消 毒 法 用 于 空 气 消 毒 与 物 品 表 面 的 消毒 物 理 法 2： 干 热 消 毒 干 热 是 指 相 对 湿 度 在 20%以 下 的 高 热 ， 由 空 气导 热 ， 传 热 较 慢 ， 干 热 消 毒 灭 菌 常 用 的 方 法 ;1.焚 烧 灭 菌 法 ;2.燃 烧 灭 菌 法 ;3.干 烤 消 毒 灭

8、 菌 法 :用 于 高 温 下 不 变 质 、 不 损 坏 、不 蒸 发 的 物 品 ， 如 油 剂 、 粉 剂 、 玻 璃 器 具 、金 属 制 品 等 ; 玻 璃 器 皿 ， 160oC 90-240mins4.微 波 消 毒 灭 菌 法 : 用 于 食 品 及 餐 具 的 消 毒 医 疗 药 品 及 耐 热 非 金 属 材 料 物 品 的 消 毒灭 菌 物 理 法 3： 滤 过 消 毒 目 前 细 胞 培 养 工 作 中 采 用 的 培 养 用 液 ，包 括 人 工 合 成 培 养 液 、 血 清 、 消 化 用 胰酶 等 常 含 有 维 生 素 、 蛋 白 、 多 肽 、 生 长因 子

9、 等 物 质 ， 这 些 物 质 在 高 温 或 射 线 照射 下 易 发 生 变 性 或 失 去 功 能 ， 因 而 上 述液 体 多 采 用 滤 过 消 毒 以 除 去 细 菌 。 滤 膜 使 用 时 应 注 意 ：滤 膜 薄 且 光 滑 ， 容 易 移 动 ， 安 装 时 膜 位 置 一 定 要 放 正 。 过 分 干燥 的 滤 膜 很 脆 ， 在 高 压 或 高 温 干 燥 时 易 破 裂 ， 因 此 安 装 前 可 先用 三 蒸 水 润 湿 滤 膜 。为 保 证 过 滤 效 果 ， 在 使 用 时 ， 每 次 垫 两 张 滤 膜 ， 上 面 一 张 孔 径为 0 45微 米 ， 下

10、面 一 张 孔 径 为 0 22微 米 ， 或 两 张 均 为 0 22微米 。使 用 无 齿 玻 片 镊 子 夹 取 滤 膜 ， 以 防 止 镊 齿 弄 破 滤 膜 。加 大 压 力 时 用 力 应 均 匀 ， 用 后 打 开 滤 器 对 光 检 查 滤 膜 是 否 移 动和 有 无 破 裂 。 用于滤过除菌的各式滤器滤 过 除 菌 法 ： 培 养 基 、 血 清 、 消 化 酶 、 抗 生素 等 。 物 理 法 4： 湿 热 灭 菌 湿 热 由 空 气 和 水 蒸 气 导 热 ， 传 热 快 ， 穿 透 力强 ， 湿 热 消 毒 灭 菌 常 用 的 方 法 ： 煮 沸 消 毒 法 高 压

11、蒸 汽 灭 菌 法 ， 一 般 高 压 蒸 汽 灭 菌 的 压 力为 102. 97-137.30 kPa， 温 度 为 1211260C 经 15-30 min可 达 到 灭 菌 目 的 最 常 用 、 最 有 效 的 方 法 ； 布 、 金 属 、 橡 胶 、 玻 璃 、 某 些 培 养 液 培 养 液 ， 橡 胶 ： 10磅 （ 115oC） 20mins； 玻 璃 、 金 属 ： 12磅 （ 121 oC） 30mins； 高压蒸汽灭菌器 化 学 消 毒 灭 菌 法 化 学 消 毒 灭 菌 法 是 利 用 化 学 药 物 渗 透 细菌 体 内 ， 使 菌 体 蛋 白 凝 固 变 性 ，

12、 干 扰 细菌 酶 的 活 性 ， 抑 制 细 菌 代 谢 和 生 长 或 损害 细 菌 膜 的 结 构 ， 改 变 其 渗 透 性 ， 破 坏其 生 理 机 能 等 ， 从 而 达 到 消 毒 灭 菌 目 的 化 学 消 毒 剂 的 使 用 原 则 (1)根 据 物 品 的 性 能 及 微 生 物 的 特 性 ， 选 择 合适 的 消 毒 剂 。 (2)严 格 掌 握 消 毒 剂 的 有 效 浓 度 、 消 毒 时 间 及使 用 方 法 。 (3)消 毒 剂 应 定 期 更 换 ， 易 挥 发 的 消 毒 剂 要加 盖 ， 并 定 期 检 测 ， 调 整 其 浓 度 。 (4)浸 泡 前 将

13、 物 品 洗 净 擦 干 ， 浸 没 在 消 毒 液 内的 物 品 应 注 意 打 开 轴 节 或 套 盖 ， 管 腔 内 应 注满 消 毒 液 。 (5)在 使 用 前 用 无 菌 生 理 盐 水 冲 净 消 毒 后 的 物品 ， 避 免 消 毒 剂 刺 激 人 体 组 织 化 学 消 毒 剂 的 分 类 l、 高 效 消 毒 剂 高 效 消 毒 剂 可 杀 灭 一 切 微生 物 ， 包 括 芽 孢 (碘 酊 、 福 尔 马 林 等 ) 2、 中 效 消 毒 剂 中 效 消 毒 剂 可 杀 灭 细 菌繁 殖 体 ， 不 能 杀 灭 芽 孢 (乙 醇 、 碘 伏 等 ) 3、 低 效 消 毒

14、剂 低 效 消 毒 剂 可 杀 灭 细 菌 繁殖 体 ， 不 能 杀 灭 结 核 杆 菌 、 亲 水 性 病 毒 或 芽孢 (苯 扎 溴 铵 、 氯 己 定 等 ) 化 学 消 毒 剂 的 使 用 方 法 浸 泡 法 侵 泡 法 是 将 物 品 洗 净 、 擦 干 后 ， 浸没 在 消 毒 液 中 进 行 消 毒 灭 菌 的 方 法 。 擦 拭 法 擦 拭 法 是 用 消 毒 剂 直 接 擦 拭 人 体 或物 品 表 面 ， 如 皮 肤 、 桌 椅 等 ， 达 到 消 毒 灭 菌的 方 法 。 喷 雾 法 喷 雾 法 是 利 用 喷 雾 器 将 消 毒 剂 变 成微 粒 气 雾 弥 散 在 空

15、 气 中 对 空 气 和 物 品 表 面进 行 消 毒 灭 菌 的 方 法 。 熏 蒸 法 熏 蒸 法 是 将 消 毒 剂 加 热 或 加 人 氧 化剂 ， 使 其 产 生 气 体 来 进 行 消 毒 灭 菌 的 方 法 。 常 用 消 毒 剂 过 氧 乙 酸 peracetic acid 福 尔 马 林 formalin （ 37 -40%的 甲 醛 溶 液 ) 戊 二 醛 glutaraldehyde 环 氧 乙 烷 ethylene oxide 含 氯 消 毒 剂 乙 醇 alcohol 苯 扎 漠 铵 (新 洁 尔 灭 ) 过 氧 乙 酸 消 毒 效 力 ： 高 效 0.2 用 于 手

16、 消 毒 ， 浸泡 1- 2min 0.5 用 于 用 具 消 毒 ， 浸 泡30 - 60 min 0.2 -0.5 用 于 物 体 表面 消 毒 ， 或 浸 泡 10 min 1 -2 用 于空 气 消 毒 ， 8 mL/m3， 加 热 熏 蒸 ， 密 闭 门窗 30-120 min 注 意 事 项 ： 对 金 属 有 腐 蚀 性 ， 不 可 用 于 金 属 器 械的 消 毒 ； 易 氧 化 分 解 而 降 低 杀 菌 力 ， 需 现 配 现 用 ； 浓 溶 液 有 腐 蚀 性 ， 配 制 时 要 戴 口 罩 和橡 胶 手 套 ； 存 放 于 阴 凉 避 光 处 ， 防 高 温 引 起 爆

17、 炸 ； 福 尔 马 林 (37 -40%的 甲 醛 溶 液 ) 消 毒 效 力 ： 高 效 40 甲 醛 2 10 mL m3加 水 4 20 mL加热 ， 作 室 内 物 品 及 空 气 消 毒 ； 40 甲 醛 40 60 mL m3加 高 锰 酸 钾20 40 g， 柜 内 熏 蒸 ， 密 闭 6 12 h； 10 甲 醛 可 作 浸 泡 器 械 消 毒 注 意 事 项 ： 蒸 汽 穿 透 力 弱 ， 因 此 衣 服 应 挂 起 消 毒 ； 消 毒 效 果 易 受 温 度 、 湿 度 影 响 ， 要 求室 温 在 18 以 上 ， 相 对 湿 度 在 70 以 上 ； 对 人 体 有

18、一 定 毒 性 和 刺 激 性 ， 使 用 时注 意 防 护 ； 戊 二 醛 消 毒 效 力 ： 高 效 浓 度 和 用 法 ： 2 戊 二 醛 溶 液 加 入 0.3碳 酸 氢 钠 ， 成 为 2 碱 性 戊 二 醛 ， 用 于浸 泡 不 耐 高 温 的 金 属 器 械 、 医 学 仪 器 、内 镜 等 ， 消 毒 需 10-30 min， 灭 菌 需 7-10 h. 注 意 事 项 ： 每 周 过 滤 1次 ， 每 2周 应 更 换 消 毒 液 1次 ； 浸 泡 金 属 类 物 品 时 ， 加 入 0.5 亚 硝 酸钠 作 为 防 锈 剂 ； 消 毒 灭 菌 后 的 物 品 ， 使 用 前

19、 用 无 菌 蒸 馏水 冲 净 含 氯 消 毒 剂 含 氯 消 毒 剂 ： 常 用 的 有 漂 白 粉 消 毒 效 力 ： 中 、 高 效 浓 度 和 用 法 ： 0.5 漂 白 粉 溶 液 、 0.5 1 氯 胺 溶 液 用 于 浸 泡 餐 具 、 便 器 等 ， 浸 泡 30 min ； 1 3 漂 白 粉 溶 液 、 0.5 3 氯 胺 溶 液喷 洒 或 擦 拭 地 面 、 墙 壁 及 物 品 表 面 ； 排 泄 物 消 毒 ： 干 粪 5份 加 漂 白 粉 1份 搅 拌 ， 放置 2 h， 尿 液 100 mL加 漂 白 粉 1 g， 放 置 1 h 注 意 事 项 ： 消 毒 剂 保

20、 存 在 密 闭 容 器 内 ， 置 于 阴 凉 、干 燥 、 通 风 处 ， 减 少 有 效 氯 的 丧 失 ； 配 制 的 溶 液 性 质 不 稳 定 ， 应 现 配 现 用 ； 有 腐 蚀 及 漂 白 作 用 ， 不 宜 用 于 金 属 制品 、 有 色 衣 服 及 油 漆 家 具 的 消 毒 ； 3 d更 换 一 次 消 毒 液 乙 醇消 毒 效 力 ： 中 效 浓 度 和 用 法 ： 70 -75 用 于 皮 肤 消 毒 95 用 于 燃 烧 灭 菌 注 意 事 项 ： 易 挥 发 ， 需 加 盖 保 存 ， 定 期测 定 ， 保 持 有 效 浓 度 有 刺 激 性 ， 不 宜用 于

21、 黏 膜 及 创 面 消 毒 易 燃 ， 故 应 置 于避 火 处 苯 扎 漠 铵 (新 洁 尔 灭 )消 毒 效 力 ： 低 效 0.1 -0.2 用 于 皮 肤 消 毒 0.1%-0.2 用 于 金 属 器 械 消 毒 ， 浸 泡15-30 min (加 入 0.5 亚 硝 酸 钠 以 防 锈 ) 注 意 事 项 ： 对 肥 皂 、 碘 、 高 锰 酸 钾 等阴 离 子 表 面 活 性 剂 有 拮 抗 作 用 有 吸 附 作 用 ， 会 降 低 药 效 ， 所 以 溶 液 内不 可 投 人 纱 布 、 棉 花 等 对 铝 制 品 有 破 坏 作 用 ， 故 不 可 用 铝 制 品盛 装 7

22、5 酒 精 、 新 洁 尔 灭 、 过 氧 乙 酸 、 乳 酸 和 洗 必 泰 等 都是 常 用 的 有 效 消 毒 剂 。 0.5 的 过 氧 乙 酸 在 10分 钟 内 可 将 芽 孢 菌 和 各 种 病 毒 杀死 ； 乳 酸 蒸 汽 常 用 做 无 菌 室 内 或 周 围 环 境 的 定 期 消 毒 ； 75 酒 精 常 用 于 超 净 台 的 台 面 、 器 械 、 实 验 操 作 者 的皮 肤 等 的 消 毒 ; 0.1 新 洁 尔 灭 用 于 对 桌 、 椅 、 地 面 、 皮 肤 、 操 作 台 面进 行 擦 拭 或 浸 泡 消 毒 ； 0.1 洗 必 泰 水 溶 液 用 于 皮

23、 肤 浸 泡 消 毒 。 总 结 ： 物 理 消 毒（ 1） 射 线 消 毒 ： 60Co、 X射 线 ， 用 于 血 清 和 塑 料 制 品 灭 菌 。（ 2） 紫 外 线 ： 器 皿 需 结 合 75 酒 精 浸 泡 ， 照 射 30min。（ 3） 干 热 灭 菌 ： 160C， 90 120 min。 主 要 用 于 玻 璃 、 金 属器 皿 。（ 4） 湿 热 灭 菌 ： 121C， 30 min； 适 用 布 、 橡 胶 、 某 些 塑 料 、金 属 、 玻 璃 等 。（ 5） 过 滤 除 菌 ： 用 孔 径 小 于 0.22 m的 滤 膜 过 滤 ， 适 用 于 培养 用 液 和

24、 其 他 不 能 高 压 灭 菌 的 溶 液 。 总 结 ： 化 学 消 毒（ 1） 70 （ 75 ） 酒 精 ： 用 于 手 、 器 械 、 工 作 台 面 。（ 2） 0.1 新 洁 尔 灭 ： 主 要 用 于 手 的 清 洗 和 工 作 台 面 的 清 洗 。（ 3） 来 苏 水 ： 主 要 用 于 桌 椅 、 墙 壁 、 地 面 的 消 毒 ， 也 可 用于 空 气 消 毒 。（ 4） 0.5%过 氧 乙 酸 ： 10min可 将 芽 孢 菌 杀 死 ， 用 于 表 面 消毒 。 （ 5） 其 他 ： 乳 酸 、 甲 醛 、 高 锰 酸 钾 、 氯 等 。 无 菌 室 的 灭 菌 ：

25、 1.定 期 打 扫 无 菌 室 ： 每 周 打 扫 一 次 ， 先 用 自 来 水 拖 地 、 擦 桌 子 、超 净 工 作 台 等 ， 然 后 用 3来 苏 尔 或 者 新 洁 尔 灭 或 者 0.5 过 氧乙 酸 擦 拭 。 2.CO2孵 箱 （ 培 养 箱 ） 灭 菌 ： 先 用 3新 洁 尔 灭 擦 拭 ， 然 后 用 75 酒 精 擦 拭 或 者 0.5 过 氧 乙 酸 ， 再 用 紫 外 灯 照 射 3.实 验 前 灭 菌 ： 打 开 紫 外 灯 、 三 氧 杀 菌 机 、 空 气 净 化 器 系 统 各20-30分 钟 4.实 验 后 灭 菌 ： 用 75 酒 精 （ 3新 洁

26、 尔 灭 ） 擦 拭 超 净 台 、 边 台 、倒 置 显 微 镜 的 载 物 台 。 实 验 人 员 的 无 菌 准 备 ：1.肥 皂 洗 手 。2.穿 好 隔 离 衣 、 带 好 隔 离 帽 、 口 罩 、 放好 拖 鞋3.用 75 酒 精 棉 球 擦 净 双 手 。 无 菌 操 作 的 注 意 事 项 ：1.凡 是 带 入 超 净 工 作 台 内 的 酒 精 、 PBS、 培 养 基 、 胰蛋 白 酶 的 瓶 子 均 要 用 75 酒 精 擦 拭 瓶 子 的 外 表 面2.靠 近 酒 精 灯 火 焰 操 作 。3.器 皿 使 用 前 必 须 过 火 灭 菌4.继 续 使 用 的 器 皿

27、（ 如 瓶 盖 、 滴 管 ） 要 放 在 高 处 ， 使用 时 仍 要 过 火 。5.各 种 操 作 要 靠 近 酒 精 灯 ， 动 作 要 轻 、 准 确 ， 不 能 乱碰 。 如 吸 管 不 能 碰 到 废 液 缸 。6.吸 取 两 种 以 上 的 使 用 液 时 要 注 意 更 换 吸 管 ， 防 止 交叉 污 染 。 培 养 前 准 备 器 材 物 品放 到 操 作 场 所 （ 培 养 室 、 超 净 台 ） 内 消 毒 。 操 作 间 消 毒 每 天 0.2% 新 洁 尔 灭 拖 地 ； 每 天 紫 外 线 照 射 分 钟 超 净 台 在 每 次 试 验 前 用 酒 精 擦 拭 ，

28、然 后 紫 外 线 消 毒 分 钟 洗 手 和 着 装 火 焰 消 毒 操 作 ： 动 作 准 确 敏 捷 避 免 手 碰 到 器 皿 布 局 合 理 瓶 口 顺 风 不 同 移 液 管 取 液 不 能 讲 话 、 咳 嗽 专 门 人 配 液 ， 灭 菌 ， 标 签 一 切 用 品 固 定 存 放 ；“ 避 免 污 染 ” 第二节、细胞培养用液 （二）平衡盐溶液 成 分 ： 无 机 盐 葡 萄 糖用 途 ： 洗 涤 配 制 其 他 溶 液 的基 础 溶 液 可 加 指 示 剂 BBS 作 用 ：提 供 细 胞 生 长 的 基 本 元素 ；维 持 渗 透 压 、 缓 冲 和 调节 酸 碱 度 ；

29、 平 衡 盐 溶 液 ： 无 Ca2+、 Mg2+的 缓 冲 液 PBS： NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20g 加 水 至 1000 ml （三）消化液作 用 ： 贴 附 型 细 胞 原 代 培 养 和 传 代 培 养 过 程 中细 胞 和 组 织 的 分 散 ； 胰 蛋 白 酶 液 ： 使 细 胞 间 蛋 白 质 水 解 ， 细 胞 分 散 EDTA（ 二 乙 烯 四 乙 酸 二 钠 ） ： 吸 取 Ca2 ， Mg2 ， 使 细 胞 分 离 胶 原 酶 原 代 培 养 分 散 组 织 细 胞 联用 胰 蛋 白 酶 消 化

30、 液来 源 ： 猪 或 者 牛 的 胰 脏 ， 白 色 粉 末作 用 ： 水 解 细 胞 之 间 的 蛋 白 质浓 度 ： 0.25% 0.125%特 点 ： 不 同 细 胞 的 要 求 不 同终 止 ： 血 清 可 以 中 止 胰 蛋 白 酶 的 继 续 作 用 EDTA Na 又 称 Versen溶 液 化 学 鳌 合 剂 对 细 胞 具 有 一 定 的 解 离 作 用 毒 性 小 ， 价 格 低 0.02% 胶 原 酶 溶 液来 源 ： 细 菌作 用 ： 对 胶 原 组 织 和 细 胞 间 质 有 较 强 的 消化 作 用 。 细 胞 培 养 用 容 器 及 培 养 基Culture v

31、essels and mediumfor animal cell culture 培 养 基 （ 液 ） 是 维 持 体 外 细 胞 生 存和 生 长 的 溶 液 天 然 培 养 基 ： 合 成 培 养 基 ： 氨 基 酸 、 维 生 素 、 糖类 无 机 离 子 、 其 它 成 分 完 全 培 养 基 ： 合 成 培 养 基 +血 清 无 血 清 培 养 基 ： （一）天然培养基 天 然 培 养 基 有 生 物 性 液 体 （ 血 清 ） ， 组织 浸 液 （ 胚 胎 浸 液 ） ， 凝 固 剂 （ 血 浆 ） 优 点 ： 营 养 成 分 丰 富 ， 培 养 效 果 好 缺 点 ： 来 源

32、受 限 。 成 分 复 杂 ， 影 响 对 某 些 实 验 产 物 的 提 取 和 实 验 结 果 的 分 析 。 易 发 生 支 原 体 污 染 血 清 (serum)： 一 般 常 用 为 小 牛 血 清 (包括 胎 牛 血 清 )， 人 血 清 和 其 它 动 物 血 清 。 灭 活 ： 56度 ， 30min消 除 补 体 活 性 。 成 分 ： 总 蛋 白 3.5-4.5g/100ml 球 蛋 白 不 高 于 2g/100ml 外 观 ： 透 明 淡 黄 色 ， 无 溶 血 ， 无 沉 淀 。 常 用 血 清 有 胎 牛 血 洁 ,新 生 牛血 清 ,小 牛 血 清 ,兔 血 清 ,

33、马 血清 等 ,其 中 以 胎 牛 血 清 质 量 最好 . 优 质 血 清 的 标 准 :透 明 ,淡 黄色 ,无 沉 淀 物 ,无 细 菌 ,支 原 体 ,病 毒 污 染 . 多 种 PR（ 白 蛋 白 、 球 蛋 白 、 铁 蛋 白 等 ） 多 种 金 属 离 子 激 素 ； 促 贴 附 物 质 ， 如 纤 粘 蛋 白 、 冷 析 球 蛋白 、 胶 原 等 。 各 种 生 长 因 子 转 移 蛋 白 不 明 成 分 血 清 的 使 用 与 储 存 使 用 前 的 处 理 56 灭 活 30min 去 除 补 体 成 分 储 存 条 件 灭 活 后 分 装 成 小 包 装 （ 10mL、

34、20mL、 50mL） ， 20 储 存 ； 使 用 前 4 融 化 ， 可 用 1个 月 。 使 用 浓 度 一 般 为 5 20 ， 最 常 用 的 是 10 。 影 响 血 清 的 各 种 因 素 年 龄 ： 较 老 动 物 的 血 清 对 细 胞 生 长 有抑 制 作 用 血 型 ： AB型 血 清 比 A型 和 O型 血 清 对细 胞 生 长 有 利 血 色 素 胆 红 质 脂 肪 酸 血 清 在 培 养 液 中 的 浓 度 并 非 越 高 越 好 细 胞 培 养 中 使 用 血 清 的 缺 点 使 用 血 清 有 可 能 改 变 某 种 细 胞 在 体 内 的 正 常 状 态 。

35、如 ： 血 清 可 以 促 进 成 纤 维 细 胞 的 生 长 ， 同 时 会 抑制 表 皮 角 质 细 胞 的 生 长 。 血 清 中 含 有 一 些 物 质 对 细 胞 会 产 生 毒 性 作 用 。 如 ： 多 胺 氧 化 酶每 批 血 清 之 间 都 有 差 别 ， 其 成 分 不 能 保 持 一 致 。取 材 过 程 中 有 可 能 带 入 支 原 体 、 病 毒 ， 对 培 养 细 胞产 生 影 响 。 关于血清的几个问题 血 清 必 须 贮 存 于 20 -70 ， 若 存 放于 4 ， 请 勿 超 过 一 个 月 。 如 果 一 次 无 法 用完 一 瓶 ， 可 将 40 45

36、 ml分 装 于 无 菌 50ml 离 心 管 中 ， 由 于 血 清 结 冻 时 体 积 会 增 加 约10 %， 必 须 预 留 此 膨 胀 体 积 之 空 间 ， 否 则易 发 生 污 染 或 容 器 冻 裂 之 情 形 。 一 般 厂 商 提 供 之 血 清 为 无 菌 ， 不 需 再 无菌 过 滤 。 若 发 现 血 清 有 许 多 悬 浮 物 ， 则 可将 血 清 加 入 培 养 基 内 一 起 过 滤 ， 勿 直 接 过滤 血 清 。 血 浆 ： 1907年 Harrison首 次 使 用优 点 ： 支 持 培 养 组 织 块 ， 供 给 细 胞生 长 物 质 。 缺 点 ： 易

37、 于 液 化 。2、 血 浆 阅 读 ： P484、 水 解 乳 蛋 白5、 胶 原回 答 ： 胶 原 在 细 胞 培 养 中 的 用 途 ？ 胶 原 的 制 备 方 法 ？ 胶 原 的 使 用 方 法 ？ （二）合成培养基 合 成 培 养 基 ： 根 据 细 胞 生 存 所 需 物 质 的 种 类和 数 量 ， 用 人 工 方 法 模 拟 合 成 的 。 主 要 成 分 ： 氨 基 酸 、 维 生 素 、 碳 水 化 合 物 、 无 机 盐 和 其 它 一 些 辅 助 物 质 。 优 点 ： 标 准 化 生 产 ， 组 分 和 含 量 相 对 固 定 。 成 本 低 缺 点 ： 缺 少 某

38、些 成 分 ， 不 能 完 全 满 足 体 外 细 胞 生 长 需 要 。 常 用 合 成 培 养 基MEM: 12种 氨 基 酸 +谷 氨 酰 胺 + 8种 维 生 素广 泛 适 用 已 建 成 细 胞 系 的 培 养minimum essential medium DMEM: MEM改 良 成 份 加 倍葡 萄 糖 (高 糖 1000mg/L或 者 低 糖 400mg/L) 低 糖 : 生 长 速 度 快 ,附 着 性 稍 差 的 肿 瘤 细 胞 ; 高 糖 : 附 着 性 差 的 细 胞 RPMI-1640: 成 份 简 单 , 正 常 细 胞 和 肿 瘤 细 胞 ,广 泛 适 用 干

39、粉 培 养 基 商 品 培 养 液 完 全 培 养 基也 叫 血 清 培 养 基 ;分 成 细 胞 生 长 和 细 胞 维 持 培 养 基细 胞 生 长 培 养 基 : 血 清 含 量 高 , 10-20%维 持 培 养 基 :血 清 含 量 低 , 2-5% 青 霉 素 50100IU/ml培 养 液链 霉 素 50100ug/ml培 养 液 100IU/ml （三）无血清培养基 血 清 中 不 仅 存 在 促 细 胞 生 长 因 子 ，同 对 也 存 在 细 胞 生 长 抑 制 因 子 或 毒 性因 子 ， 故 在 含 血 清 培 养 基 中 培 养 的 细胞 所 反 映 的 生 物 学

40、特 性 是 细 胞 和 复 杂血 清 因 子 的 综 合 反 应 。 在 生 长 因 子 、 蛋 白 质 工 程 、 基 因表 达 调 控 等 研 究 领 域 ， 迫 切 需 要 用 无血 清 培 养 基 培 养 细 胞 v 1975年 ， Sato首 次 成 功 地 用 无 血 清 培养 基 培 养 了 垂 体 细 胞 株 ， 近 20多 年 来 已 报道 了 几 十 种 细 胞 系 在 无 血 清 培 养 基 中 成 功地 生 长 和 增 殖 。v 无 血 清 细 胞 培 养 基 的 使 用 保 证 了 实 验结 果 的 准 确 性 、 可 重 复 性 和 稳 定 性 ， 减 少了 细 胞

41、 污 染 ， 简 化 了 提 纯 和 鉴 定 各 种 细 胞产 物 的 程 序 。 v 向 无 清 培 养 液 中 能 促 进 细 胞 系 生 长的 补 加 物 都 是 独 特 的 。 适 用 于 某 种 细 胞 株的 培 养 液 ， 很 可 能 不 适 合 另 一 种 细 胞 株 的生 长 。 即 使 同 源 组 织 的 不 同 细 胞 株 ， 所 需补 加 物 也 不 同 。v 商 品 化 的 无 血 清 培 养 液 供 应 。 如 ： Sigma公 司 的 MCDB131可 用 于 培 养 内 皮细 胞 Biofluids公 司 的 LHC-9用 于 气 管 上 皮细 胞 提 高 制 品

42、 安 全 性 和 /或 产 量 . 无 血 清 培 养 基 替 代 血 清 的 补 充 成 分 优 点 ： 增 加 确 定 性 ； 性 能 更 一 致 ； 容 易 进 行 纯 化 和 下 游 加 工 ； 缺 点 ： 无 血 清 培 养 基 尚 处 于 研 究 阶段 难 以 推 广 。 基 础 培 养 基 无血清培养基加入添加剂生长因子和激素结合蛋白贴附因子和伸展因子有利细胞生长的因子和元素 提高重复性减少微生物污染供应充足稳定产品易纯化避免血清因素对细胞的毒性减少血清中蛋白对生物测定的干扰 抗 生 素 : 在 培 养 液 配 制 后 ， 培 养 液 内 常 加 适量 抗 菌 素 ， 以 抑 制

43、 可 能 存 在 的 细 菌的 生 长 。 青 霉 素 （ 50100IU/ml培 养 液 ） 链 霉 素 （ 50100ug/ml培 养 液 ） 抗 菌 素 的 使 用 : 在 培 养 液 配 制 后 ,培 养 液 内 常 加 适 量 抗 菌素 ,以 抑 制 可 能 存 在 的 细 菌 的 生 长 . 通 常 是 青 霉 素 和 链 霉 素 联 合 使 用 . 培 养 基 内 青 霉 素 ,链 霉 素 最 终 使 用 浓 度 为每 毫 升 100单 位 . 培 养 基 的 组 成 基 础 培 养 基 80%一 95%血 清 5%一 20%碳 酸 氢 钠 2.0 g/L青 ,链 霉 素 各 100卑 位 /毫 升 物 理 性 质 1、 pH值 ：正 常 成 纤 维 细 胞 ： pH7.47.7； 转 化 细 胞 ： pH7.07.4。酚 红 的 呈 色 ： 2、 缓 冲 盐 ： 碳 酸 氢 钠 3、 渗 透 压 4、 粘 度 紫 色 红 带 蓝 红 色 橙 色 黄 色 呈 色 7.87.67.47.06.5pH 其 它 常 用 液P50