现代分子生物学第五章

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1、第 五 章 分 子 生 物 学 基 本 研 究 法（ 上 ） DNA、 RNA及 蛋 白 质 操 作 技 术 重 组 DNA操 作 过 程 示 意 图 Gregor Mendel(1822-1884).The Father of Genetics 现 代 分 子 生 物 学 的 快 速 发 展 ， 得 益 于 上 个 世纪 中 叶 以 来 研 究 方 法 、 特 别 是 基 因 操 作 和 基因 工 程 技 术 的 进 步 。基 因 操 作 主 要 包 括 DNA分 子 的 切 割 与 连 接 、杂 交 、 电 泳 、 细 胞 转 化 、 核 酸 序 列 分 析 以 及基 因 人 工 合 成

2、、 表 达 、 定 点 突 变 和 PCR扩 增等 ， 是 分 子 生 物 学 研 究 的 核 心 技 术 。 基 因 工 程 是 指 在 体 外 将 核 酸 分 子 插 入 病 毒 、 质粒 或 其 它 载 体 分 子 ， 构 成 遗 传 物 质 的 新 组 合 ，使 之 进 入 原 先 没 有 这 类 分 子 的 寄 主 细 胞 内 并 进行 持 续 稳 定 的 繁 殖 和 表 达 。 该 技 术 是 核 酸 操 作的 一 部 分 ， 只 不 过 它 强 调 了 外 源 核 酸 分 子 在 另一 种 寄 主 细 胞 中 的 繁 衍 与 表 达 。 事 实 上 ， 这 种 跨 越 物 种 屏

3、 障 、 把 来 自 其 它 生物 的 基 因 置 于 新 的 生 物 细 胞 之 中 的 能 力 ， 是基 因 工 程 技 术 区 别 于 其 它 技 术 的 根 本 特 征 。DNA操 作 技 术基 因 克 隆 的 常 用 载 体 系 统基 因 的 分 离 与 鉴 定 5. 1 重 组 DNA技 术 发 展 史 上 的 重 大 事 件三 大 成 就 ：一 、 在 20世 纪 40年 代 确 定 了 遗 传 信 息 的 携带 者 、 即 基 因 的 分 子 载 体 是 DNA而 不 是 蛋 白质 ， 解 决 了 遗 传 的 物 质 基 础 问 题 ；二 、 50年 代 提 出 了 DNA分

4、子 的 双 螺 旋 结 构 模型 和 半 保 留 复 制 机 制 ,解 决 了 基 因 的 自 我 复制 和 世 代 交 替 问 题 ； 三 、 50年 代 末 至 60年 代 ， 相 继 提 出 了 “ 中 心 法则 ” 和 操 纵 子 学 说 ,成 功 地 破 译 了 遗 传 密 码 ， 阐明 了 遗 传 信 息 的 流 动 与 表 达 机 制 。 表 5-1重 组 DNA技 术 史 上 的 主 要 事 件年 份 事 件1869 F Miescher首 次 从 莱 茵 河 鲑 鱼 精 子 中 分 离 DNA。1957 A.Kornberg从 大 肠 杆 菌 中 发 现 了 DNA聚 合 酶

5、 I。1959-1960 Ochoa发 现 RNA聚 合 酶 和 信 使 RNA， 并 证 明mRNA决 定 了 蛋 白 质 分 子 中 的 氨 基 酸 序 列 。1961 Nirenberg破 译 了 第 一 个 遗 传 密 码 ； Jacob和Monod提 出 了 调 节 基 因 表 达 的 操 纵 子 模 型 。 1964 Yanofsky和 Brenner等 人 证 明 ， 多 肽 链 上 的 氨 基 酸序 列 与 该 基 因 中 的 核 苷 酸 序 列 存 在 着 共 线 性 关 系 。1965 Holley完 成 了 酵 母 丙 氨 酸 tRNA的 全 序 列 测 定 ； 科学 家

6、 证 明 细 菌 的 抗 药 性 通 常 由 “ 质 粒 ” DNA所 决定 。 1966 Nirenberg， Ochoa， Khorana， Crick等 人 破 译 了 全 部 遗 传 密码 。1967 第 一 次 发 现 DNA连 接 酶1970 Smith， Wilcox和 Kelley分 离 了 第 一 种 限 制 性 核 酸 内 切 酶 ，Temin和 Baltimore从 RNA肿 瘤 病 毒 中 发 现 反 转 录 酶 。1972-1973 Boyer， Berg等 人 发 展 了 DNA重 组 技 术 ， 于 72年 获 得 第一 个 重 组 DNA分 子 ， 73年 完

7、成 第 一 例 细 菌 基 因 克 隆 。1975-1977 Sanger与 Maxam和 Gilbert等 人 发 明 了 DNA序 列 测 定 技 术 ，1977年 完 成 了 全 长 5387bp的 噬 菌 体 174基 因 组 测 定 。1978 首 次 在 大 肠 杆 菌 中 生 产 由 人 工 合 成 基 因 表 达 的 人 脑 激 素 和 人胰 岛 素 。1980 美 国 联 邦 最 高 法 院 裁 定 微 生 物 基 因 工 程 可 以 被 专 利 化 。1981 Palmiter和 Brinster获 得 转 基 因 小 鼠 ， Spradling和 Rubin得 到转 基

8、因 果 蝇 。1982 美 、 英 批 准 使 用 第 一 例 基 因 工 程 药 物 胰 岛 素 ， Sanger等人 完 成 了 入 噬 菌 体 48,502bp全 序 列 测 定 。 1983 获 得 第 一 例 转 基 因 植 物 。1984 斯 坦 福 大 学 获 得 关 于 重 组 DNA的 专 利 。1986 GMO首 次 在 环 境 中 释 放 。1988 Watson出 任 “ 人 类 基 因 组 计 划 ” 首 席 科 学 家 。1989 DuPont公 司 获 得 转 肿 瘤 基 因 小 鼠 “Oncomouse”。1992 欧 共 体 35个 实 验 室 联 合 完 成

9、 酵 母 第 三 染 色 体 全 序列 测 定 (315kb)。1994 第 一 批 基 因 工 程 西 红 柿 在 美 国 上 市 。 1996 完 成 了 酵 母 基 因 组 (1.25 107bp)全 序 列 测 定 。1997 英 国 爱 丁 堡 罗 斯 林 研 究 所 获 得 克 隆 羊 。2000 完 成 第 一 个 高 等 植 物 拟 南 芥 的 全 序 列 测 定（ (1.15 108bp)。2001 完 成 第 一 个 人 类 基 因 组 全 序 列 测 定 (2.7 109bp)。 限 制 性 核 酸 内 切 酶 能 够 识 别 DNA上 的 特 定 碱基 序 列 并 从

10、这 个 位 点 切 开 DNA分 子 。第 一 个 核 酸 内 切 酶 EcoRI是 Boyer实 验 室 在1972年 发 现 的 ， 它 能 特 异 性 识 别 GAATTC序列 ， 将 双 链 DNA分 子 在 这 个 位 点 切 开 并 产 生具 有 粘 性 末 端 的 小 片 段 。 图 5-1 几 种 主 要 DNA内 切 酶 所 识 别 的 序 列 及其 酶 切 末 端 。 图 5-2 DNA连 接 酶 能 把 不 同 的 DNA片 段 连 接 成 一 个 整 体 体 外 利 用 限 制 性 核 酸 内 切 酶 和 DNA连 接 酶 进行 DNA的 切 割 和 重 组 以 后 ，

11、 还 要 将 它 们 连 接到 具 备 自 主 复 制 能 力 的 DNA分 子 上 ， 才 能 在寄 主 细 胞 中 进 行 繁 殖 。具 备 自 主 复 制 能 力 的 DNA分 子 就 是 分 子 克 隆的 载 体 （ vector） 。 病 毒 、 噬 菌 体 和 质 粒 等小 分 子 量 复 制 子 都 是 基 因 导 入 的 载 体 。 获 得 了 用 外 源 DNA片 段 和 载 体 分 子 重 组 而 成的 杂 种 DNA分 子 后 ， 还 必 须 通 过 一 个 被 称 为细 菌 转 化 的 过 程 将 其 重 新 导 入 到 寄 主 细 胞 中 ，才 能 保 证 重 组 D

12、NA分 子 的 增 殖 （ 图 5-3） 。 图 5-3 重 组 DNA操 作 过 程 示 意 图 5. 2 DNA操 作 技 术5. 2. 1核 酸 的 凝 胶 电 泳自 从 琼 脂 糖 （ agarose） 和 聚 丙 烯 酰 胺（ polyacrylamide） 凝 胶 被 引 入 核 酸 研 究 以 来 ，按 分 子 量 大 小 分 离 DNA的 凝 胶 电 泳 技 术 ， 已 经发 展 成 为 一 种 分 析 鉴 定 重 组 DNA分 子 及 蛋 白 质与 核 酸 相 互 作 用 的 重 要 实 验 手 段 。琼 脂 ， 琼 脂 糖 ， 聚 丙 烯 酰 胺 ， 核 酸 ， 蛋 白 质

13、 ？ 基 本 原 理一 种 分 子 被 放 置 到 电 场 中 ， 会 以 一 定 的 速 度 移向 适 当 的 电 极 ， 把 这 种 电 泳 分 子 在 电 场 作 用 下的 迁 移 速 度 ， 叫 做 电 泳 的 迁 移 率 。 它 与 电 场 强度 和 电 泳 分 子 本 身 所 携 带 的 净 电 荷 数 成 正 比 ，与 片 段 大 小 成 反 比 。 生 理 条 件 下 ， 核 酸 分 子 中 的 磷 酸 基 团 呈 离 子化 状 态 ， 所 以 ， DNA和 RNA又 被 称 为 多 聚 阴离 子 （ polyanions） ， 在 电 场 中 向 正 电 极 的方 向 迁 移

14、 。由 于 糖 -磷 酸 骨 架 在 结 构 上 的 重 复 性 质 ， 相 同数 量 的 双 链 DNA几 乎 具 有 等 量 的 净 电 荷 （ 电荷 密 度 ） ， 因 此 它 们 能 以 同 样 的 速 度 向 正 电极 方 向 迁 移 。 琼 脂 糖 凝 胶 分 辨 DNA片 段 的 范 围 为 0.250kb之 间 。聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 的 分 辨 范 围 为 1到 1000个 碱 基对 之 间 。凝 胶 浓 度 的 高 低 影 响 凝 胶 介 质 孔 隙 的 大 小 ， 浓度 越 高 ， 孔 隙 越 小 ， 其 分 辨 能 力 就 越 强 ， 越 适合 分 离 小 分 子

15、 量 的 分 子 。 表 5-3 琼 脂 糖 及 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 分 辨 DNA片段 的 能 力 凝 胶 类 型 及 浓 度 分 离 DNA的 大 小 范 围 （ bp） 0.3%琼 脂 糖 50 0001 000 0.7%琼 脂 糖 20 0001 000 1.4%琼 脂 糖 6 000300 4.0%聚 丙 烯 酰 胺 1 000100 10.0%聚 丙 烯 酰 胺 50025 20.0%聚 丙 烯 酰 胺 501 图 5-4 溴 化 乙 锭染 料 的 化 学 结 构及 其 对 DNA分 子 的插 入 作 用 。 由 于插 入 了 溴 化 乙 锭分 子 ， 在 紫 外 光照 射

16、 下 ， 琼 脂 糖凝 胶 电 泳 中 DNA的条 带 便 呈 现 出 橘黄 色 荧 光 ， 易 于鉴 定 。 图 5-4 DNA脉 冲 电 场 凝 胶 电 泳 示 意 图 5. 2. 2 细 菌 转 化 与 目 标 DNA分 子 的 增 殖通 过 细 菌 转 化 方 法 将 体 外 构 建 好 的 杂 种 DNA分子 导 入 宿 主 细 胞 中 。 外 源 DNA通 过 自 身 载 体 上的 复 制 起 始 点 进 行 复 制 增 殖 ， 能 在 宿 主 细 胞 中长 期 保 存 下 来 ， 并 能 以 完 整 的 形 式 从 细 胞 中 被分 离 纯 化 出 来 。 细 菌 转 化 （ t

17、ransformation） ， 是 指 一 种 细 菌菌 株 由 于 捕 获 了 来 自 供 体 菌 株 的 DNA而 导 致 性状 特 征 发 生 遗 传 改 变 的 过 程 。为 提 高 效 率 ， 可 对 受 体 菌 进 行 物 理 或 化 学 处 理 ，增 加 其 获 取 DNA的 能 力 。 经 过 这 种 处 理 的 细 胞被 称 作 感 受 态 细 胞 （ competent cells） 。 图 5-5 细 菌 转 化 及 蓝 白 斑 筛 选 CaCl2法将 快 速 生 长 期 大 肠 杆 菌 置 于 经 0 预 处 理 的 低渗 CaCl2溶 液 中 ， 细 胞 膨 胀 ，

18、 膜 通 透 性 改 变 ，易 与 外 源 DNA相 粘 附 。将 该 体 系 转 移 到 42 下 做 短 暂 的 热 刺 激 ， 外源 DNA就 可 能 被 细 胞 吸 收 。 将 经 过 转 化 后 的细 胞 置 于 选 择 性 培 养 基 上 ， 筛 选 阳 性 克 隆 。转 化 效 率 可 达 到 5 1062 107个 转 化 子 /g超 螺 旋 质 粒 DNA。 电 击 法电 脉 冲 可 以 在 细 胞 膜 上 造 成 小 凹 陷 ， 形 成 疏水 孔 洞 。 随 着 跨 膜 电 压 增 加 ， 大 疏 水 性 孔 洞会 转 变 为 亲 水 性 孔 洞 ， 介 质 中 的 DNA

19、进 入 细胞 质 。将 生 长 至 对 数 中 期 的 E. coli菌 液 冷 却 至 4后 离 心 ， 洗 菌 后 用 10%的 甘 油 悬 浮 ， 将 高 密度 菌 液 （ 2 1010/ml） 置 于 特 制 的 电 极 杯 中进 行 电 击 。 获 得 最 大 转 化 效 率 时 场 强 一 般 为12.515kV/cm， 时 间 跨 度 一 般 为 4.55.5毫秒 。电 击 转 化 与 温 度 有 关 ， 一 般 在 04 进 行 。由 于 转 化 载 体 上 常 带 有 LacZ基 因 ， 多 用 带 有不 同 抗 生 素 （ 常 用 的 抗 生 素 包 括 氨 苄 青 霉 素

20、 、卡 那 霉 素 和 四 环 素 等 ） 的 选 择 性 培 养 基 结 合-互 补 蓝 白 斑 筛 选 法 鉴 定 转 化 细 胞 。 利 用 噬 菌 体 颗 粒 能 够 有 效 地 将 DNA注 入 到寄 主 细 胞 中 这 一 特 点 ， 科 学 家 又 发 明 了 重 组体 DNA分 子 的 体 外 包 装 法 。经 包 装 的 基 因 工 程 噬 菌 体 颗 粒 能 够 借 助 细 菌表 面 的 噬 菌 体 接 受 器 位 点 将 DNA注 入 受 体细 菌 ， 并 在 这 些 细 胞 中 得 到 繁 殖 和 表 达 。 图 5-6 噬 菌 体 作 为 克 隆 载 体 构 建 基

21、因 文 库 的流 程 图 5. 2. 3聚 合 酶 链 式 反 应 （ PCR） 技 术聚 合 酶 链 式 反 应 是 快 速 扩 增 DNA序 列 最 常 用的 方 法 。PCR反 应 的 模 板 DNA若 是 基 因 组 上 的 某 个 片段 ， 就 称 为 genomic PCR， 若 是 mRNA， 反转 录 产 生 的 cDNA， 就 称 为 RT-PCR。 PCR技 术 的 原 理首 先 将 双 链 DNA分 子 在 临 近 沸 点 的 温 度 下 加 热分 离 成 两 条 单 链 DNA分 子 ， DNA聚 合 酶 以 单链 DNA为 模 板 并 利 用 反 应 混 合 物 中

22、的 四 种 脱 氧核 苷 三 磷 酸 合 成 新 生 的 DNA互 补 链 。 DNA解 链 （ 变 性 ） 引 物 与 模 板 DNA相 结 合 （ 退 火 ） DNA合 成 （ 链 的 延 伸 ） 三 步 。经 不 断 重 复 循 环 之 后 ， 反 应 混 合 物 中 所 含 有 的双 链 DNA分 子 数 ， 即 两 条 引 物 结 合 位 点 之 间 的DNA区 段 的 拷 贝 数 ， 理 论 上 的 最 高 值 应 是 2n。 将 含 有 待 扩 增 DNA样 品 的 反 应 混 合 物 放 置 在 高温 （ 94 ） 环 境 下 加 热 1分 钟 ， 使 双 链 DNA变性 ，

23、形 成 单 链 模 板 DNA。降 低 反 应 温 度 （ 退 火 ， 约 50 ） ， 约 1分 钟 ，使 寡 核 苷 酸 引 物 与 两 条 单 链 模 板 DNA结 合 在 靶DNA区 段 两 端 的 互 补 序 列 位 置 上 。将 反 应 混 合 物 的 温 度 上 升 到 72左 右 保 温 1-数 分钟 ， 在 DNA聚 合 酶 的 作 用 下 ， 从 引 物 的 3-端 加入 脱 氧 核 苷 三 磷 酸 ， 并 沿 着 模 板 分 子 按 53方 向 延 伸 ， 合 成 新 生 DNA互 补 链 。 图 5-16 聚 合 酶 链 式 反 应 示 意图 。 （ a） 起 始 材

24、料 ， 双 链DNA； （ b） 反 应 混 合 物 加热 后 发 生 链 分 离 ， 降 温 使 引物 结 合 到 待 扩 增 靶 DNA区 段两 端 的 退 火 位 点 上 ； （ c）Taq聚 合 酶 以 单 链 DNA为 模板 在 引 物 的 引 导 下 利 用 反 应混 合 物 中 的 dNTPs合 成 互 补的 新 链 DNA； （ d） 将 反 应混 合 物 再 次 加 热 ， 使 旧 链 和新 链 分 开 ； （ e） 合 成 新 的 互补 链 DNA； （ f） 重 复 b；（ g） 重 复 c、 、 、 、 、 、 图 5-7 聚 合 酶 链 式 反 应 （ PCR） 技

25、术 图 5-8 PCR指 数 扩 增 时循 环 次 数 与 DNA产 物 数量 的 比 较 5. 2. 4 实 时 定 量 PCR（ real time quantitative PCR， Q-PCR）由 于 PCR敏 感 性 高 ， 扩 增 产 物 总 量 变 异 系 数大 ， 定 量 不 准 确 。 90年 代 末 期 出 现 了 Q-PCR， 利 用 荧 光 检 测 PCR仪 绘 制 DNA扩 增 过 程 中 的累 积 速 率 动 态 变 化 图 ， 基 本 消 除 在 测 定 终 端 产物 丰 度 时 变 异 系 数 较 大 的 问 题 。 混 合 在 PCR反 应 液 中 的 荧 光

26、 探 针 只 有 与 大 片段 DNA结 合 后 ， 才 能 够 被 激 发 出 荧 光 。随 着 新 合 成 DNA片 段 的 增 加 ， 由 于 结 合 到DNA上 的 荧 光 探 针 增 加 ， 被 激 发 产 生 的 荧 光相 应 增 加 。非 序 列 特 异 性 荧 光 染 料 SYBR Green I , 激 发光 波 长 520nm。 SYBR Green I作 探 针 的 实 时定 量 PCR实 验过 程 图 示 为 确 保 荧 光 检 测 的 确 实 是 靶 DNA， 又 设 计 了仅 能 与 目 的 DNA特 异 结 合 的 荧 光 探 针 。TaqMan探 针 是 一 段

27、 与 靶 DNA序 列 中 间 部 位结 合 的 单 链 DNA， 长 50bp-150bp， 该 DNA的 5和 3端 带 有 短 波 长 和 长 波 长 两 个 不 同 荧光 基 团 ， 由 于 彼 此 距 离 靠 近 ， 在 荧 光 共 振 能量 转 移 （ FRET） 作 用 下 发 生 荧 光 淬 灭 ， 因而 检 测 不 到 荧 光 。 随 着 PCR反 应 的 进 行 ， TaqMan 探 针 结 合 到目 的 DNA序 列 上 ， 并 且 会 被 具 有 外 切 酶 活 性的 Taq DNA聚 合 酶 逐 个 切 除 而 降 解 。 切 下 来的 荧 光 基 团 解 除 了 荧

28、 光 淬 灭 的 束 缚 ， 会 在 激发 光 下 发 出 荧 光 ， 因 此 ， 产 生 的 荧 光 强 度 直接 反 映 了 所 扩 增 靶 DNA的 总 量 。 TaqMan探针 实 时 定量 PCR技术 图 5-11用 实 时 定 量 PCR法 分 析 未 知 样 品 靶 基 因的 绝 对 表 达 量 。 Ct值 是 产 物 荧 光 强 度 首 次 超 过 设 定 阈 值 时 ，PCR反 应 所 需 的 循 环 数 。 利 用 标 准 曲 线 ， 可 以确 定 样 品 中 待 检 测 靶 DNA的 绝 对 含 量 。 5. 2. 5 基 因 组 DNA文 库 构 建把 某 种 生 物

29、的 基 因 组 DNA切 成 适 当 大 小 ， 分别 与 载 体 组 合 ， 导 入 微 生 物 细 胞 ， 形 成 克 隆 。汇 集 包 含 基 因 组 中 所 有 DNA序 列 的 克 隆 （ 理论 上 每 个 序 列 至 少 有 一 个 代 表 ） ， 这 样 的 克隆 片 段 的 总 汇 ， 称 为 基 因 组 DNA文 库 。 Clark和 Carbon于 1975年 提 出 公 式 ：N=ln(1-p) / ln(1-f)式 中 ： N表 示 一 个 基 因 组 文 库 所 应 该 包 含 的重 组 克 隆 数 目 ； p表 示 所 期 望 的 靶 基 因 在 文库 中 出 现

30、的 概 率 ； f表 示 重 组 克 隆 平 均 插 入 片段 的 长 度 与 基 因 组 DNA总 长 的 比 值 。为 获 得 整 个 基 因 簇 或 一 个 基 因 及 其 两 翼 延 伸序 列 ， 基 因 组 文 库 中 的 DNA片 段 常 大 于 20kb。以 人 为 例 ， 其 基 因 组 大 小 为 3 10 9bp若p=99%， 平 均 插 入 片 段 大 小 为 20kb， 则N=6.7 105。 构 建 基 因 组 文 库 最 常 用 的 是 噬 菌 体 载 体 （ 克隆 能 力 约 1520kb） 和 限 制 性 内 切 酶 部 分 消化 法 。 例 如 用 识 别 4

31、个 核 苷 酸 的 核 酸 限 制 性 内切 酶 Sau3A， 与 BamHI是 一 对 同 尾 酶 消 化DNA， 由 Sau3A酶 切 产 生 的 DNA片 段 可 插 入到 经 BamHI消 化 的 噬 菌 体 载 体 上 。 图 5-13 用 Sau3A限 制 性 核 酸 内 切 酶 消 化 真 核生 物 基 因 组 DNA并 利 用 噬 菌 体 载 体 构 建 基 因组 文 库 的 过 程 图 示 。 此 外 ， 还 有 很 多 大 容 量 克 隆 载 体 ， 如 柯 斯 质 粒 、细 菌 人 工 染 色 体 （ BAC） 、 P1源 人 工 染 色 体（ PAC） 、 酵 母 人

32、工 染 色 体 （ YAC） 等 都 可 用于 基 因 组 文 库 的 构 建 。它 们 的 优 点 是 可 以 插 入 更 大 片 段 DNA， 但 是 稳定 性 一 般 较 差 ， 在 大 量 复 制 的 过 程 中 容 易 出 现缺 失 现 象 。 操 作 也 相 对 较 困 难 。 5. 3 RNA基 本 操 作 技 术真 核 生 物 基 因 组 DNA庞 大 ， 有 大 量 重 复 序 列 ，很 难 直 接 分 离 得 到 靶 基 因 片 段 。 而 cDNA来 自反 转 录 的 mRNA， 无 冗 余 序 列 ， 通 过 筛 选cDNA文 库 ， 可 较 快 地 分 离 到 相 关

33、 基 因 。 细 胞 中 的 总 RNA包 括 mRNA， rRNA ， tRNA以 及 一 些 小 RNA（ sRNA） 。 一 个 典 型 的 动 物细 胞 约 含 10-5g RNA, 其 中 80%-85%为 rRNA、15%-20%为 tRNA及 sRNA， 这 些 RNA分 子 具有 确 定 的 大 小 和 核 苷 酸 序 列 ， 特 别 是 rRNA电泳 后 28S和 18S特 征 性 条 带 是 鉴 定 总 RNA纯 度和 完 整 性 的 重 要 参 数 。 mRNA约 占 总 RNA 的1%-5%。 图 5-14 PolyATtract mRNA的 分 离 纯化 过 程 简

34、图 。 RNA的 浓 度 和 纯 度 可 以 通 过 测 定 其 OD260和OD280 来 判 断 。 OD260为 1时 相 当 于 浓 度 为40g/ml， 而 OD260/OD280的 比 值 如 果 在 1.8-2.0之 间 ， 表 示 所 提 取 的 RNA纯 度 较 好 ， 如 果 样 品中 有 蛋 白 质 或 酚 污 染 ， 则 OD260/ OD280的 比 值将 明 显 低 于 1.8。 由 于 RNA分 子 敏 感 脆 弱 ， 在 自 然 状 态 下 难 以 被扩 增 ， 为 了 研 究 mRNA所 包 含 的 功 能 基 因 信 息 ，一 般 将 其 反 转 录 成 稳

35、 定 的 DNA双 螺 旋 （ cDNA，complementary DNA） ， 再 插 入 到 可 以 自 我复 制 的 载 体 中 。 图 5-15 cDNA合成 过 程 示 意 图 。 图 5-16 定 向 cDNA 合 成 及 分 子 修 饰 因 为 绝 大 多 数 大 肠 杆 菌 细 胞 都 会 切 除 带 有 5-甲 基 胞 嘧 啶 的 外 源 DNA， 所 以 实 验 中 常 选 用mcrA- mcrB-菌 株 以 防 止 cDNA被 降 解 。 cDNA文 库 的 构 建cDNA的 长 度 一 般 在 0.5-8 kb之 间 ， 质 粒 载体 和 噬 菌 体 类 载 体 都

36、能 满 足 要 求 。cDNA文 库 常 用 Uni-zap XR（ 一 种 噬 菌 粒载 体 ） 做 载 体 ， 它 具 备 噬 菌 体 的 高 效 性 和 质粒 载 体 系 统 利 用 蓝 白 斑 筛 选 的 便 利 ， 可 容 纳0-10 kb DNA插 入 片 段 ， 含 有 pBluescript载 体 的 全 部 序 列 。重 组 后 可 通 过 体 内 剪 切 反 应 （ In Vivo Excision） 将 cDNA插 入 片 段 转 移 到 质 粒 系统 中 进 行 筛 选 、 克 隆 和 序 列 分 析 。 基 因 文 库 的 筛 选基 因 文 库 的 筛 选 是 指 通

37、 过 某 种 特 殊 方 法 从 基因 文 库 中 鉴 定 出 含 有 所 需 重 组 DNA分 子 的 特定 克 隆 的 过 程 。 筛 选 的 方 法 有 很 多 种 ， 如 核酸 杂 交 法 ， PCR筛 选 法 和 免 疫 筛 选 法 等 。 1、 核 酸 杂 交 法 ：核 酸 杂 交 法 以 其 广 泛 的 适 用 性 和 快 速 性 成 为基 因 文 库 筛 选 中 最 常 用 的 一 种 方 法 ， 用 放 射性 标 记 的 特 异 DNA探 针 适 用 于 高 密 度 的 菌 落杂 交 筛 选 。将 待 筛 选 菌 落 转 移 到 硝 酸 纤 维 素 膜 上 ， 适 当温 育

38、。 同 时 保 留 原 来 的 菌 落 平 板 作 对 照 。 取 出 已 经 长 有 菌 落 的 膜 ， 用 碱 液 处 理 ， 使 菌落 发 生 裂 解 ， DNA随 之 变 性 。 用 蛋 白 酶 K处理 硝 酸 纤 维 素 膜 去 除 蛋 白 质 ， 形 成 菌 落 DNA的 印 迹 。80 烘 烤 滤 膜 ， 将 DNA固 定 在 膜 上 。 将 滤 膜与 放 射 性 标 记 的 DNA或 RNA探 针 杂 交 ， 通过 放 射 性 自 显 影 显 示 杂 交 结 果 。 通 过 对 应 于平 板 上 的 位 置 找 到 相 应 克 隆 。 图 5-17 通 过 核 酸 杂 交 筛

39、选 目 的 克 隆 流 程 图 2、 PCR筛 选 法将 整 个 文 库 （ 以 质 粒 的 形 式 或 者 细 菌 的 形 式 均可 ） 保 存 在 多 孔 培 养 板 上 ， 用 设 计 好 的 目 的 基因 探 针 对 每 个 孔 进 行 PCR筛 选 ， 鉴 定 出 阳 性 的孔 ， 把 每 个 阳 性 孔 中 的 克 隆 再 稀 释 到 次 级 多 孔板 中 进 行 PCR筛 选 。 重 复 以 上 程 序 ， 直 到 鉴 定出 与 目 的 基 因 对 应 的 单 个 克 隆 为 止 。 3、 免 疫 筛 选 法该 法 仅 适 用 于 对 表 达 文 库 的 筛 选 。 若 实 验

40、中 靶基 因 的 序 列 完 全 未 知 但 是 有 针 对 该 基 因 产 物 的特 异 性 抗 体 ， 就 可 以 采 用 免 疫 筛 选 法 。 图 5-18 噬 菌 体表 达 文 库 的 免疫 化 学 筛 选 法示 意 图 5. 4 SNP的 理 论 与 应 用SNP是 Single Nucleotide Polymorphism的缩 写 ， 即 单 核 苷 酸 多 态 性 ， 指 基 因 组 DNA序列 中 由 于 单 个 核 苷 酸 （ A， T， C和 G） 的 突 变而 引 起 的 多 态 性 。 5. 4. 1 SNP概 述科 学 上 把 染 色 体 DNA同 一 位 置 上

41、 的 每 个 碱 基 类型 叫 做 一 个 等 位 位 点 。 SNP是 基 因 组 中 最 简 单最 常 见 的 多 态 性 形 式 ， 具 有 很 高 的 遗 传 稳 定 性 。SNP检 测 和 分 析 技 术 已 经 成 为 继 限 制 性 片 段 长度 多 态 性 （ RFLP） 和 微 卫 星 标 记 （ SSR） 之后 的 第 三 代 遗 传 标 记 。 图 5-19 染 色 体 上 共 同 遗 传 的 SNP组 合 。图 中 SNP1和 SNP2在 同 一 条 染 色 体 上 而 且 距 离 很 近 ，SNP1有 等 位 位 点 A和 G， SNP2有 等 位 位 点 G和 T。

42、 因此 ， 染 色 体 对 有 两 种 可 能 的 SNP组 合 。 单 倍型 基 因型 外 显 子 IV 内 含 子 IV57 130 165 232 236H1 H-4 T T A T TH-3 T T A T TH-1 T T A T TE-2 T T A T TB-73 T T A T TH2 MO17 C T A C CB-1 C T A C CH3 H60 C C T T T玉 米 globulin1不 同 单 倍 型 和 基 因 型 之 间 的 多 态 性 比 较 据 估 计 ， 人 类 DNA中 每 300-1000个 碱 基 对 就有 一 个 SNP， 因 此 ， 一 个 人

43、 类 个 体 大 约 携 带300万 -1000万 个 SNPs。 位 于 染 色 体 上 某 一 区域 的 一 组 相 关 联 的 SNP等 位 位 点 被 称 作 单 倍型 （ haplotype） ， 相 邻 SNPs的 等 位 位 点 倾向 于 以 一 个 整 体 遗 传 给 后 代 。 根 据 SNP在 基 因 组 中 的 分 布 位 置 分 为 编 码 区SNP（ cSNP） ， 调 控 区 SNP（ pSNP） 和 非编 码 区 SNP（ rSNP） 三 类 。编 码 区 内 的 变 异 率 仅 占 周 围 序 列 的 1/5， cSNP的 总 量 显 著 少 于 其 它 两 类

44、 SNPs。cSNP分 为 同 义 cSNP（ synonymous cSNP） ， 编 码 序 列 的 改 变 不 影 响 所 翻 译 的 氨基 酸 序 列 ） 和 非 同 义 cSNP（ non-synonymous cSNP） ， 碱 基 序 列 的 改 变 使氨 基 酸 序 列 发 生 改 变 ， 可 能 影 响 蛋 白 质 的 功 能 。 5. 4. 2 SNP的 检 测 技 术通 过 DNA测 序 法 获 得 新 的 SNP。基 因 分 型 （ genotyping） 是 指 利 用 数 据 库 中已 有 的 SNP进 行 特 定 人 群 的 序 列 和 发 生 频 率的 研 究

45、， 主 要 包 括 基 因 芯 片 技 术 、 Taqman技术 、 分 子 信 标 （ molecular beacons） 技 术和 焦 磷 酸 测 序 法 （ pyrosequencing） 等 。 1 基 因 芯 片 技 术通 过 优 化 芯 片 杂 交 程 序 ， 使 探 针 只 与 完 全 互补 的 序 列 杂 交 而 不 与 含 有 单 个 错 配 碱 基 的 序列 杂 交 。优 点 是 高 通 量 ， 一 次 可 对 多 个 SNP进 行 规 模性 筛 选 ， 被 检 起 始 材 料 也 很 少 ， 操 作 步 骤 简单 。缺 点 是 芯 片 设 计 成 本 高 。 而 且 ，

46、 由 于 DNA样品 的 复 杂 性 ， 有 些 SNP不 能 被 检 测 。 2 Taqman技 术PCR反 应 系 统 中 加 入 2种 不 同 荧 光 标 记 的 分 别与 两 个 等 位 基 因 配 对 的 探 针 。 随 着 PCR的 进 行 ，与 模 板 完 全 配 对 的 探 针 逐 步 被 Taq DNA聚 合 酶的 53外 切 活 性 所 切 割 ， 荧 光 基 团 与 3端 的淬 灭 基 团 分 离 ， 荧 光 基 团 被 激 活 。 不 完 全 配 对的 探 针 （ 代 表 另 一 种 等 位 基 因 ） 不 能 被 有 效 切割 ， 供 体 荧 光 基 团 依 然 被

47、淬 灭 。 3 分 子 信 标 （ molecular beacon） 技 术是 一 种 呈 茎 环 结 构 的 荧 光 标 记 的 寡 核 苷 酸 ，环 状 区 与 靶 序 列 特 异 性 结 合 ， 茎 干 区 由 5-8个碱 基 对 组 成 ， 5端 带 有 荧 光 发 生 基 团 ， 3端 带有 荧 光 淬 灭 基 团 。 自 由 状 态 时 ， 分 子 信 标 呈发 卡 式 结 构 ， 荧 光 几 乎 完 全 淬 灭 。 与 靶 分 子相 结 合 时 ， 荧 光 基 团 和 淬 灭 基 团 之 间 的 距 离增 大 ， 分 子 信 标 的 荧 光 恢 复 。 Taqman技术 （ 上

48、 ） 及分 子 信 标 技术 （ 下 ） 原理 示 意 图 。 5. 5 基 因 克 隆 （ clone） 技 术在 多 细 胞 的 高 等 生 物 个 体 水 平 上 ， 克 隆 表 示 由具 有 相 同 基 因 型 的 同 一 物 种 的 两 个 或 数 个 个 体组 成 的 群 体 。 从 同 一 受 精 卵 分 裂 而 来 的 单 卵 双生 子 （ monozygotic twins） 便 是 属 于 同 一 克隆 。 在 细 胞 水 平 上 ， 克 隆 一 词 是 指 由 同 一 个 祖 细 胞（ progenitor cell） 分 裂 而 来 的 一 群 带 有 完 全相 同 遗

49、 传 物 质 的 子 细 胞 。在 分 子 生 物 学 上 ， 人 们 把 将 外 源 DNA插 入 具有 复 制 能 力 的 载 体 DNA中 ， 使 之 得 以 永 久 保存 和 复 制 这 种 过 程 称 为 克 隆 。 5. 5. 1 RACE技 术 （ rapid amplification of cDNA ends）在 已 知 cDNA序 列 基 础 上 克 隆 5或 3端 缺 失 序列 的 技 术 。 根 据 已 知 序 列 设 计 基 因 片 段 内 部特 异 引 物 ， 由 该 片 段 向 外 侧 进 行 PCR扩 增 得到 目 的 序 列 。 用 于 扩 增 5端 的 方

50、法 称 为5RACE， 用 于 扩 增 3端 的 称 为 3RACE。 5 RACE1、 在 反 转 录 酶 的 作 用 下 ，以 基 因 片 段 内 部 特 异 性 引 物启 始 cDNA第 一 条 链 合 成 。2、 RNase混 合 物 降 解 模 板mRNA， 纯 化 第 一 链 。3、 用 末 端 转 移 酶 在 cDNA链3端 加 入 连 续 的 dCTP。4、 以 连 有 oligo(dG) 的 锚 定引 物 和 基 因 片 段 内 部 特 异 的nested引 物 进 行 PCR扩 增 ，得 到 目 的 片 段 ， 用 nest PCR检 测 。 3RACE1、 用 oligo

51、(dT)锚 定引 物 启 始 cDNA第 一链 的 合 成 .2、 降 解 模 板 mRNA.3、 用 通 用 锚 定 引 物和 基 因 片 段 内 部 特 异引 物 进 行 PCR扩 增 得到 目 的 3片 段 ， 用nest PCR法 检 测 . 5. 5. 2 cDNA差 示 分 析 法通 过 降 低 cDNA群 体 复 杂 性 和 更 换 cDNA两 端 接 头 等方 法 ， 特 异 性 扩 增 目 的 基 因 片 段 。因 为 Tester和 Driver在 接 受 差 示 分 析 前 均 经 一 个 4碱基 切 割 酶 处 理 ， 形 成 平 均 长 度 256bp的 代 表 群

52、， 保证 绝 大 部 分 遗 传 信 息 能 被 扩 增 。每 次 T减 D反 应 后 仅 设 置 72 复 性 与 延 伸 ， 94 变性 这 两 个 参 数 共 20个 PCR循 环 ， PCR产 物 的 特 异 性和 所 得 探 针 的 纯 度 高 。 图 5-23 RDA流 程 图 。 5. 5. 3 Gateway大 规 模 克 隆 技 术Gateway技 术 利 用 噬 菌 体 进 行 位 点 特 异 性DNA片 段 重 组 ， 实 现 了 不 需 要 传 统 的 酶 切 联 接过 程 的 基 因 快 速 克 隆 和 载 体 间 平 行 转 移 。 Gateway大 规 模 克隆

53、策 略 TOPO反 应 :将 目 的 基 因 PCR产 物 连 入 Entry载 体 。 载 体上 的 CCCTT被 拓 扑 异 构 酶 所 识 别 ， 通 过 与切 口 处 的 磷 酸 基 团 形 成 共 价 键 ， 将 该 酶 偶 联在 载 体 上 。 5GTGG粘 性 末 端 攻 击 PCR产 物的 互 补 性 末 端 并 与 接 头 序 列 CACC退 火 ， 使PCR产 物 以 正 确 方 向 连 入 Entry载 体 。 LR反 应 ：将 目 的 片 段 从 Entry 载 体 中 重 组 入 表 达 载 体 。Entry载 体 上 基 因 两 端 具 有 attL1和 attL2

54、位 点 ，目 的 载 体 上 含 有 attR1和 attR2位 点 ， 在 重 组 蛋白 的 作 用 下 发 生 定 向 重 组 ， 形 成 新 的 位 点 attB1和 attB2， 将 目 的 基 因 转 移 到 表 达 载 体 中 。 5. 5. 4 基 因 的 图 位 克 隆 法 （ Map-based cloning）所 有 具 有 某 种 表 现 型 的 基 因 都 可 以 通 过 该 方法 克 隆 得 到 。通 过 构 建 遗 传 连 锁 图 ， 将 目 的 基 因 定 位 到 某个 染 色 体 的 特 定 位 点 ， 并 在 其 两 侧 确 定 紧 密连 锁 的 RFLP或

55、RAPD分 子 标 记 。 通 过 对 不 同 的 生 态 型 及 限 制 性 内 切 酶 和 杂 交探 针 的 分 析 ， 找 出 与 目 的 基 因 距 离 最 近 的 分子 标 记 ， 通 过 染 色 体 步 移 法 将 位 于 这 两 个 标记 之 间 的 基 因 片 段 克 隆 并 分 离 出 来 ， 根 据 基因 功 能 互 作 原 理 鉴 定 目 的 基 因 。 图 5-26 染 色 体 步 移 法 克 隆 基 因 示 意 图 在 RFLP作 图 中 ， 连 锁 距 离 是 根 据 重 组 率 来计 算 的 ， 1cM（ 厘 摩 ） 相 当 于 1%的 重 组 率 。人 类 基

56、因 组 中 ， 1cM1000kb； 拟 南 芥 菜 中 ，1cM290kb； 小 麦 中 ， 1cM3500kb。 用 图 位 克隆 法 获 得水 稻 脆 杆基 因 BCl A.将 BCl定 位 于 水 稻 3号 染 色 体 （ Chr3） 分子 标 记 C524a和 RM16之 间 ；B. 覆 盖 BCl位 点 的 BAC大 片 段 。C. BCl位 点 的 精 细 定 位 。 BCl位 点 被 定 位 于分 子 标 记 P2和 P4之 间 与 P3共 分 离 。D. BCl基 因 结 构 。 红 色 为 编 码 区 ， 白 色 为 5和 3非 翻 译 区 ， 黑 色 线 段 为 内 含

57、子 。 bcl-1和 bcl-2表 示 两 个 突 变 位 点 。 5. 6 蛋 白 质 与 蛋 白 质 组 学 技 术蛋 白 质 组 学 是 蛋 白 质 （ protein） 和 基 因 组（ genome） 研 究 在 形 式 和 内 容 两 方 面 的 组合 ， 该 技 术 致 力 于 研 究 某 一 物 种 、 个 体 、 器官 、 组 织 或 细 胞 在 特 定 条 件 、 特 定 时 间 所 表达 的 全 部 蛋 白 质 图 谱 。 蛋 白 质 组 与 基 因 组 既 相 互 对 应 又 有 显 著 不 同 ，基 因 组 是 确 定 的 ， 每 个 个 体 只 有 一 个 基 因

58、组 ，而 基 因 的 表 达 调 控 水 平 （ 蛋 白 组 ） 却 会 发 生显 著 的 变 化 。由 于 蛋 白 质 分 离 （ 双 向 电 泳 和 高 效 液 相 层 析技 术 ） 和 鉴 定 技 术 （ 现 代 质 谱 ） 的 进 步 ， 以及 基 因 组 学 和 生 物 信 息 学 的 交 叉 渗 透 ， 蛋 白质 组 学 研 究 在 已 经 获 得 了 长 足 的 发 展 。 5. 6. 1 双 向 电 泳 （ Two Dimensional Electrophoresis， 2-D） 技 术等 电 聚 焦 （ Isoelectric focusing， IEF） 及SDS-聚 丙

59、 烯 酰 胺 凝 胶 （ SDS-PAGE） 双 向电 泳 技 术 。 蛋 白 质 是 两 性 分 子 ， 在 不 同 pH缓 冲 液 中 表 现 出 不 同 的 带 电 性 ， 因 此 ， 在 两性 电 解 质 电 泳 体 系 中 ， 不 同 等 电 点 的 蛋 白 质会 聚 集 在 介 质 上 不 同 的 区 域 （ 等 电 点 ） 从 而被 分 离 。 蛋 白 质 的 分 子 量 决 定 了 SDS-蛋 白 复 合 物 在凝 胶 电 泳 中 的 迁 移 率 ， 因 为 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶中 的 SDS带 有 大 量 的 负 电 荷 ， 与 之 相 比 ， 蛋白 质 所 带 电 荷

60、 量 可 忽 略 不 计 。 因 此 ， 蛋 白 质在 SDS凝 胶 电 场 中 的 运 动 速 度 和 距 离 完 全 取决 于 其 分 子 量 。 用 2-D胶 展 示 拟 南 芥 种 子 萌 发 48h后 的 蛋 白 质 表 达 5. 6. 2 蛋 白 质 免 疫 印 迹 实 验 （ Western Blotting） ： 是 检 测 样 品 中 是 否 存 在 蛋 白 抗原 的 一 种 可 靠 方 法 。 主 要 分 为a、 蛋 白 样 品 的 制 备 ； b、 SDS-PAGE分 离 ;c、 转 膜 载 并 封 闭 膜 上 未 反 应 位 点 ， 减 少 非特 异 性 吸 附 ； d

61、、 与 相 应 非 标 记 抗 体 （ 一 抗 ）反 应 ； e、 洗 去 多 余 的 一 抗 ， 加 酶 偶 联 或 放射 性 同 位 素 标 记 的 二 抗 ， 通 过 显 色 或 放 射 自显 影 法 检 测 凝 胶 中 的 蛋 白 成 分 。 免 疫 印 迹（ Western Blotting） 示意 图 . 图 5-30 用 辣 根 过 氧 化 物 酶 显 色 法 和 抗 GFP的 抗 体 检 测 外源 TLR3-GFP融 合 蛋 白 在 同 一 细 胞 系 不 同 克 隆 株 中 的 表 达（ 1， 2， 3， 4表 示 不 同 的 克 隆 株 ） 。 5. 6. 3 蛋 白 质

62、的 质 谱 分 析 技 术现 行 质 谱 仪 主 要 有 三 个 连 续 的 组 成 部 分 ， 即离 子 源 ， 离 子 分 离 区 和 检 测 器 。较 常 用 的 有 基 质 辅 助 的 激 光 解 析 电 离 -飞 行 时间 质 谱 （ Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight spectrometry， MALDI-TOF） 和 电 喷 雾 质 谱（ Electrospray ionization， ESI-MS） 。 MALDI-TOF的 工 作 原 理 ： 将 蛋 白 质 酶 解 成 小肽 段 后 与 基 质 （ 主 要 是 有 机 酸 ） 混 合 ， 将 样品 混 合 物 点 到 金 属 靶 表 面 上 并 使 之 干 燥 结 晶 ，然 后 用 激 光 轰 击 ， 将 呈 离 子 化 气 体 状 态 的 待分 析 物 从 靶 表 面 喷 射 出 去 。 离 子 化 气 体 肽 段在 电 场 中 被 加 速 后 到 达 检 测 器 的 时 间 由 肽 段的 质 量 和 其 所 带 电 荷 数 的 比 值 （ m/z） 决 定 。 图 5-31 MALDITOF分 子 质 谱 仪 原 理 图