实验报告-果蝇基因组DNA的提取

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1、题目：果蝇基因组DNA的提取果蝇基因组DNA的提取姓名： 学号：一、实验目的1. 掌握动物基因组DNA抽提的操作过程，了解基因组DNA提取的意义；2. 熟悉DNA提取的步骤和DNA电泳原理。二、实验原理1. DNA是绝大多数生物（除少数RNA病毒外）记录、存储、传递遗传信息的载体；2. DNA的提取是进行PCR扩增、Southern杂交、限制性片段长度多态性分析等实验的 基础。细胞破碎抽提去蛋白质沉淀核酸三、实验试剂1. 抽提缓冲液：100mM NaCl， 10mMTris. Cl （pH8. 0） , 25mMEDTA（pH8.0）, 0.5 SDS，0.1mg/ml 蛋白酶K （新鲜加入）

2、各成分的作用：NaCl, Tris.Cl：调节溶液的pH,维持一定的离子浓度；EDTA：二价金属离子的螯合剂，使影响DNA的DNA酶中的钙离子和镁离子和EDTA结合， 使酶失去活性，有利于提取完整DNA；还可以防止镁离子与核酸生成沉淀。SDS:去污剂，可溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，和核酸结合，减少和清除蛋白 质杂质，保护DNA免受内源核酸酶的降解。2. 50X电泳缓冲液TAE：242g Tris base，57.1ml 冰醋酸，37.2g Na2EDTA2H20,加 ddH2O 至 1000ml。Na2+离子浓度太低时电泳速度变慢；EDTA：二价金属离子的螯合剂，使影响DNA的DNA酶

3、中的钙离子和镁离子和EDTA结合， 使酶失去活性，有利于提取完整DNA；还可以防止镁离子与核酸生成沉淀。3. 6XDNA 上样缓冲液4. 0.7琼脂糖凝胶：0.28g琼脂糖，加入40ml 1XTAE，于电炉上加热至沸腾，待冷却至50C左右（手试微 烫），加入DNA荧光染料，混匀后将胶倒入插好梳子的制胶板上，冷却后备用。为什么凝胶用的缓冲液是TAE溶液？因为电泳缓冲液是TAE，那么用TAE配胶就使胶体中的离子环境与缓冲液相同，使核酸 携带的电荷更稳定，条带更加清晰。题目：果蝇基因组DNA的提取四、实验步骤1.10只果蝇放入1.5 ml离心管，加30 M抽提缓冲液，用枪头迅速捣碎； 抽提缓冲液：2

4、加400 M抽提缓冲液，混匀，65C温浴30 min,每10分钟重新混匀一次；3加等体积（约430m）酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），盖紧管盖，上下颠倒混匀2min， 12,000rpm 离心 5 min;酚：有机溶剂，能使蛋白质变性； 氯仿：抑制核酸酶，提苯酚； 异戊醇：可快速分层，去气泡；4. 上清转移至新的离心管中。加等体积（约400卩1）异丙醇，轻轻混匀，静置2min。 12,000rpm离心5min，弃上清液；异丙醇：能与自由水紧密结合，结合了溶解DNA的水分子，使DNA沉淀；5. 用400卩1 70%的乙醇洗涤沉淀，12,000rpm离心5min，弃上清液。沉淀自然干燥，加 入

5、20MddH20溶解；70%乙醇：洗去异丙醇，且易于从DNA沉淀中除去；6取2,4,6 DNA溶液，加1-2上样缓冲液，点样电泳，并观察电泳条带。五、注意事项1. 研磨迅速彻底，研磨好的材料应与抽提液充分混匀；2. 动作迅速避免核酸降解酶类的降解；3. DNA 荧光染料致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。4. 配置琼脂糖凝胶溶液时，要等溶液冷却后再加荧光染料，防止染料蒸发，使人中毒；5. 酚是淡黄色的，如果被氧化成醌，则变成棕色，不能继续使用；5第三步颠倒混匀时，要带手套，因为PE管有可能裂开；6整个过程操作要温和，不要剧烈震荡，防止DNA断裂；7.乙醇一定要吹干，否则电泳点样时，样品上漂

6、；六、讨论1. 为什么使用15000的Marker，而不是2000的Marker?答：因为目的基因大于15000bp,用15000的M arker更明显，更容易直观的比较提取的 基因组DNA与15000bp的大小关系，从而判断实验的成败与否。2. 各种提取植物基因组DNA的实验方法的比较？ 答：（1）通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多 种酶类（尤其是氧化酶类）对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化 剂或强还原剂（如巯基乙醇）以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并 减少研磨过程中各种酶类的作用。（2） CATB的原理：CATB是离子

7、表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，题目：果蝇基因组DNA的提取与蛋白质结合，减少和清除蛋白质杂质，再通过后续实验将DNA分离出来即可。 优点：对多糖的去除比较彻底； 缺点：操作繁琐，实验时间长；SDS的原理：是离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，与核酸结合，再通过后 续实验将SDS与核酸分离，即可得到DNA。优点：操作相对简单，时间短； 缺点：对多糖的去除不彻底；（3）再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸（DNA、 RNA）水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加 入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液

8、中，即得植物总DNA溶液。 尿素法：操作过程比较温和，不需要剧烈的震荡及高温的处理，不容易造成DNA变性 降解。此法提取的DNA质量最高且适用真菌的种类最多，同时该法的操作步骤少且完成 全过程时间短，简单易行。3. 荧光染料嵌入DNA分子的机理？答：荧光染料泛指吸收某一波长的光波后能发射出另一波长大于吸收光的光波的物 质。它们大多是含有苯环或杂环并带有共轭双键的化合物。京脂糖凝胶电泳是用于分离、 鉴定和提纯DNA片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不 带电荷，是一种很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下（pH8.0的缓冲液）带负电荷， 在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同

9、DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中 的泳动速率液不同。荧光染料（Gel Red,GoldView,EB等）可嵌入DNA分子碱基对间形 成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重 组子的目的。4. 设计利用提取的果蝇基因组DNA进行各果蝇品种鉴定的实验方案-一査资料。 答：1.实验原理 1.1基因控制生物的性状，可以从基因的角度鉴别生物的不同品种； 1.2控制相对性状的基因称为等位基因，一般位于同一对染色体上； 1.3黑腹果蝇的基因组是已知的；1.4序列相似性比较：就是将待研究序列与DNA或蛋白质序列库进行比较，用于确定该 序列的生物属性，也就是找出与此

10、序列相似的已知序列是什么。完成这一工作只需要使 用两两序列比较算法。常用的程序包有BLAST、FASTA等； 1.5多序列比对的意义：（1）用于描述一组序列之间的相似性关系，以便了解一个基因 家族的基本特征，寻找motif，保守区域等；（2）用于描述一个同源基因之间的亲缘关 系的远近，应用到分子进化分析中；（3）其他应用，如构建profile，打分矩阵等。 2.实验方法2. 1多序列比对 2.1.1多序列比对的方法：同源性分析中常常要通过多序列比对来找出序列之间的相互 关系，和biast的局部匹配搜索不同，多序列比对大多都是采用全局比对的算法。这样 对于采用计算机程序的自动多序列比对是一个非常

11、复杂且耗时的过程，特别是序列数目 多，且序列长的情况下。第 3 页题目：果蝇基因组DNA的提取2.1.2多序列比对的分类：(1) 手工比对(辅助编辑软件如bioedit, seaview, Genedoc等)：通过辅助软件的不 同颜色显示不同残基，靠分析者的观察来改变比对的状态。(2) 计算机程序自动比对：通过特定的算法(如同步法,渐进法等),由计算机程序自 动搜索最佳的多序列比对状态。2. 1.3自动多序列比对的算法(1)同步法 将序列两两比对时的二维动态规划矩阵扩展到三维矩阵。即用矩阵的维数来反映比 对的序列数目。这种方法的计算量很大,对于计算机系统的资源要求比较高,一般只有 在进行少数的

12、较短的序列的比对的时候才会用到这个方法。(2)步进法最常见的就是clustal所采用的方法。其基本思想就是基于相似序列通常具有进化 相关性的这一假设。(3) Clustal的渐进比对过程：在比对过程中,先对所有的序列进行两两比对并计算它们相似性分值,然后根据相 似性分值将它们分成若干组,并在每组之间进行比对,计算相似性分值。根据相似性分 值继续分组比对,直到得到最终比对结果。在比对过程中,相似性程度较高的序列先进 行比对而距离较远的序列添加在后面。2.2两条序列的比对2.2.1点阵法：如果两条序列相似度不是很高,因为点阵法能将所有可能的比对结果用 该矩阵的(次)对角线表现出来。点阵法还能显示插

13、入/缺失及序列内部正向和反向重 复的存在,这是其它比对方法很难做到的。这种方法的局限在于大部分的点阵分析程序 无法给出一个真正的比对结果。2.2.2动态规划法：首先由计算机科学家提出来的一种算法,它从数学意义上保证结果 是最优的。2.2.3词或k串法：通过搜索序列间完全相同的一短串字符，然后通过动态规划法吧这 些词语连接成比对结果。这类方法的优点是速度快,适合搜索整个数据库,寻找与待查 序列比对结果最好的序列，得到比对结果在统计上是可靠的。2.实验思路提取各个品种的果蝇的基因组DNA运用两条序列的比对方法，鉴别控制一对相对形状的基因的序列第 4页与控制一对相对性状的基因组DNA相对应的果蝇即为

14、同一品种题目：果蝇基因组DNA的提取七、实验结果及分析果蝇基因组DNA提取结果：1 2 3 M1000250Marker:DL15000TM1500010000750050002500实验结果分析：I. Marker带:M泳道的Marker与预期结果相符合，出现7个为15000bp、lOOOObp、7500bp、 5000bp、2500bp、lOOObp、250bp条带，但是出现拖带现象；II. 泳道1、2、3号：为提取的果蝇基因组DNA, 1、2、3号泳道分别加入了 2M、4M、 6的样本，三个泳道均跑出了 2个条带，且出现拖带现象，其中第二条带拖带较严重； 第一条带位于15000bp上方，

15、亮度较小，是提取的果蝇基因组DNA，表明提取的较成功； 第二条带位于250bp的下方，亮度大，是提取过程中的RNA杂质； 由于三个泳道加入的样本量依次增多，第一条带的亮度应该依次增大，但是实验结果中 亮度变化并不明显 原因分析:（1）可能是加样时，有部分样本漂出（2）样本浓度过低，亮度差别不明显题目：果蝇基因组DNA的提取参考文献：1杨大鹏主编. 遗传学实验, 基因频率的分析 , 2010年9月.2汤文开，谭新，张辉，黄耿青，徐文亮，李学宝，一种快速简单高效提取植物DNA的方法，华中师范大学学报(自 然科学版)，第41卷 第3期 2007年9月3魏志刚，王艳敏，杨传平，松科植物基因组总DNA提

16、取方法的比较，生物技术通讯，Vol.18 No.2 Mar.,20074曹文波，郑璐璐，谢文海，一种提取植物基因组DNA的方法一-改良尿素法，华中师范大学学报(自然科学版)， 第42卷第3期 2008年9月5关于果蝇的眼色遗传的认识6果蝇嗅觉基因筛选、鉴定及其功能研究712种果蝇基因组对比研究完成黑腹果蝇(Drosophila melanogaster )和拟暗果蝇(D.pseudoobscura )的基因组是已知的；论文分别发表在2000 年和2005年的自然杂志上。可以访问NHGRI资助的果蝇数据库：http:/flybase.bio.indiana.edu,关于果蝇 基因组序列，也可以访

17、问美国国立生物技术信息中心NCBI (http:/www.ncbi.nlm.nih.gov,)或以下两个数据库： EMBL-Bank (http:/www.ebi.ac.uk/embl/index.html,)和 DDBJ (www.ddbj.nig.ac.jp,)8已完成基因组测序的物种动物間辑 A nopneies satvbtse -疟 U Apis /nsfiifOfa -蜜舞 Bes tdijrtrs-牛 Cenoriiabdtlis-神绒虫 仞曲urhdbdl辰白曲总-秀汞隐砰塔虫，模弍生柳 C&nis iupas fafniHaris ctog-伺 Ciona iniestinalis - F口埠轄 CrOfja saviQrryi -种咚鼬 Drostiphiii molunogastoi- - 杲蝇，樓式土咧 Fugu rubripes -问勝 GaOus -华 Homo sapi&ns -人 Mus muscuius卜鼠，模it三復 Pan troglodytes -黒诉徉 Ratius n&rv&gictm -尢盟 Schistostfmm haematobium -茨及皿匪口